细菌转化实验
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8. 将上述操作6的上清液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟， 弃滤液。
9. 将500 μl的Rinse A加入Spin
Column中，12,000 rpm离心30秒钟， 弃滤液。
10. 将700 μl的Rinse（冲洗） B加
入Spin Column中，12,000 rpm离 心30秒钟，弃滤液。
中，倒置培养至菌落长成。
实验前1天晚上：
• 从LB平板上挑取单个菌落，接种于6mlLB液体培养基（加入氨 苄青霉素）中，37℃，过夜振荡（200r/min）培养。
（二）菌体收集
实验当天 ： 1. 将过夜培养的菌体转入1.5mL离心管， 5000r/min离心2min； 2. 弃上清
（三）碱裂解法提取质粒DNA
14. 12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。
六、实验作业
1. 按上述实验步骤提取质粒DNA。
1. 思考本实验的关键步骤是什么？ 答：本实验的关键是溶液Ⅰ重悬须充分，溶液Ⅲ混合须 温和。用binding buffer是为了增加洗脱柱对核酸的结 合活性；wash solution是洗掉柱子里除核酸物质以外 的杂质；而elution buffer就是最后把DNA从柱子上洗 脱下来使用的溶液，一般是pH=8.0的TE，dd水也可以。
2. 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 3. 用理化方法人工诱导细菌进入感受态的操作叫致敏过程。 4. 目前应用较广的转化方法有两种：CaCl2转化法（化学转
化法）和电转化法。 5. CaCl2转化法的原理是在低温（0℃）和低渗的CaCl2溶液
中，菌体膨胀，转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物黏附于细菌细胞表面，经42℃短时间热击， 促进细胞吸收DNA复合物。
实验二 大肠杆菌的遗传转化
一、实验目的
通过实验了解原核生物实现基因转移的途径， 掌握质粒DNA遗传转化的基本原理和操作方法。
二、实验原理ຫໍສະໝຸດ Baidu
1. 转化（transformation）是指一种生物由于接受了另一 种生物（或同种生物）的遗传物质，从而获得了后者的 某些遗传性状或发生遗传性状改变的现象。
0.1M CaCl2溶液配制：
称量1.11g无水CaCl2固体，溶于1000ml 双蒸水中，高压灭菌或0.22um滤器过滤除 菌。保存于4度冰箱中。
质粒的提取：
利用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。
五、实验步骤
（一）感受态的制备(此步骤已完成）
1、E. Coli涂布于平板（Amp-），37℃，培养12h；
三、实验菌株
含质粒载体pGEM-T的大肠杆菌（E. coli.）
四、实验用具和药品
实验用具 – 摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃试管（15mL）及 塞子、离心管（1.5mL）。
LB培养基配方：
ddH2O
细菌培养用胰化蛋白胨 （bacto-tryptone）
细菌培养用酵母提取物 （bacto-yeast extract）
950mL 10g
5g
NaCl
10g
琼脂粉
15g
（配制固体培养基时需加入）
NaOH调节pH至7.0（5mol/L 约0.2mL），高压灭菌 固体平板上添加氨苄青霉素
实验药品
溶液Ⅰ（高压灭菌）： 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Cl（pH8.0） 10 mmol/L EDTA（pH8.0）
全套操作约需1小时，详细说明如下。
3. 加入250 μl的Solution Ⅰ（含RNase A1）充分悬浮细菌沉淀。 注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使 菌体充分悬浮。
4. 加入250 μl的Solution Ⅱ轻轻地上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂 解，形成透明溶液。 注）此步骤不宜超过5分钟。
11. 重复操作步骤10。 12. 将Spin Column安置于Collection
Tube上，12,000 rpm离心1分钟。
13. 将Spin Column安置于新的1.5 ml
的离心管上，在Spin Column膜的中央 处加入60 μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer（洗脱缓冲液），室温静置1分钟。 注）把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热 至60℃使用时有利于提高洗脱效率
溶液Ⅱ（现用现配）：
0.2 mol/L NaOH(临用前用10mol/L的溶液稀释）
1%
SDS
溶液Ⅲ： 5 mol/L乙酸钾 冰乙酸 水
60mL 11.5mL 28.5mL
五、实验步骤
方法：活化-扩增-离心-裂解-离心-抽提-沉淀-洗涤-溶解
（一）细菌繁殖
实验前2天晚上：
将冻存的菌株取出，划线接种于LB（amp）平板上， 置于37℃培养箱
一、实验目的
通过细菌质粒DNA的提取，掌握共价闭合环状 DNA的提取方法。
二、实验原理
1. 细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。
2. 质粒DNA的提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污 剂（如Triton和SDS）裂解法。
3. 碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA 变性，共价闭合环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻 底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链 又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。
2、挑取单菌落，转移至盛有200mL LB的500mL三角瓶 中，37℃，振荡（200r/min）培养12h；
三、实验材料
1. 质粒pGEM-T easy ：编码氨苄青霉素（Ampr）的 抗性基因
2. 大肠杆菌（E.coli）DH5α菌株：氨苄青霉素敏
感型（Amp-）
四、实验用品
1. 超净工作台、摇床 2. 水浴锅、离心机 3. 分光光度计、移液器及枪头 4. 三角瓶（500mL、200mL） 5. 离心管（50mL、1.5mL） 6. 平板（Ampr、Amp-）、LB培养基 7. 冰冷的CaCl2溶液、质粒DNA
5. 加入400 μl的4℃预冷的Solution Ⅲ，轻轻上下翻转混合5～6次，直 至形成紧实凝集块，然后室温静置2分钟。
6. 室温12,000 rpm离心10分钟，取上清。 注）此时4℃离心不利于沉淀沉降。
7. 将试剂盒中的Spin Column（离心柱）安置于Collection Tube （收集 管）上。
9. 将500 μl的Rinse A加入Spin
Column中，12,000 rpm离心30秒钟， 弃滤液。
10. 将700 μl的Rinse（冲洗） B加
入Spin Column中，12,000 rpm离 心30秒钟，弃滤液。
中，倒置培养至菌落长成。
实验前1天晚上：
• 从LB平板上挑取单个菌落，接种于6mlLB液体培养基（加入氨 苄青霉素）中，37℃，过夜振荡（200r/min）培养。
（二）菌体收集
实验当天 ： 1. 将过夜培养的菌体转入1.5mL离心管， 5000r/min离心2min； 2. 弃上清
（三）碱裂解法提取质粒DNA
14. 12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。
六、实验作业
1. 按上述实验步骤提取质粒DNA。
1. 思考本实验的关键步骤是什么？ 答：本实验的关键是溶液Ⅰ重悬须充分，溶液Ⅲ混合须 温和。用binding buffer是为了增加洗脱柱对核酸的结 合活性；wash solution是洗掉柱子里除核酸物质以外 的杂质；而elution buffer就是最后把DNA从柱子上洗 脱下来使用的溶液，一般是pH=8.0的TE，dd水也可以。
2. 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 3. 用理化方法人工诱导细菌进入感受态的操作叫致敏过程。 4. 目前应用较广的转化方法有两种：CaCl2转化法（化学转
化法）和电转化法。 5. CaCl2转化法的原理是在低温（0℃）和低渗的CaCl2溶液
中，菌体膨胀，转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物黏附于细菌细胞表面，经42℃短时间热击， 促进细胞吸收DNA复合物。
实验二 大肠杆菌的遗传转化
一、实验目的
通过实验了解原核生物实现基因转移的途径， 掌握质粒DNA遗传转化的基本原理和操作方法。
二、实验原理ຫໍສະໝຸດ Baidu
1. 转化（transformation）是指一种生物由于接受了另一 种生物（或同种生物）的遗传物质，从而获得了后者的 某些遗传性状或发生遗传性状改变的现象。
0.1M CaCl2溶液配制：
称量1.11g无水CaCl2固体，溶于1000ml 双蒸水中，高压灭菌或0.22um滤器过滤除 菌。保存于4度冰箱中。
质粒的提取：
利用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。
五、实验步骤
（一）感受态的制备(此步骤已完成）
1、E. Coli涂布于平板（Amp-），37℃，培养12h；
三、实验菌株
含质粒载体pGEM-T的大肠杆菌（E. coli.）
四、实验用具和药品
实验用具 – 摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃试管（15mL）及 塞子、离心管（1.5mL）。
LB培养基配方：
ddH2O
细菌培养用胰化蛋白胨 （bacto-tryptone）
细菌培养用酵母提取物 （bacto-yeast extract）
950mL 10g
5g
NaCl
10g
琼脂粉
15g
（配制固体培养基时需加入）
NaOH调节pH至7.0（5mol/L 约0.2mL），高压灭菌 固体平板上添加氨苄青霉素
实验药品
溶液Ⅰ（高压灭菌）： 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Cl（pH8.0） 10 mmol/L EDTA（pH8.0）
全套操作约需1小时，详细说明如下。
3. 加入250 μl的Solution Ⅰ（含RNase A1）充分悬浮细菌沉淀。 注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使 菌体充分悬浮。
4. 加入250 μl的Solution Ⅱ轻轻地上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂 解，形成透明溶液。 注）此步骤不宜超过5分钟。
11. 重复操作步骤10。 12. 将Spin Column安置于Collection
Tube上，12,000 rpm离心1分钟。
13. 将Spin Column安置于新的1.5 ml
的离心管上，在Spin Column膜的中央 处加入60 μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer（洗脱缓冲液），室温静置1分钟。 注）把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热 至60℃使用时有利于提高洗脱效率
溶液Ⅱ（现用现配）：
0.2 mol/L NaOH(临用前用10mol/L的溶液稀释）
1%
SDS
溶液Ⅲ： 5 mol/L乙酸钾 冰乙酸 水
60mL 11.5mL 28.5mL
五、实验步骤
方法：活化-扩增-离心-裂解-离心-抽提-沉淀-洗涤-溶解
（一）细菌繁殖
实验前2天晚上：
将冻存的菌株取出，划线接种于LB（amp）平板上， 置于37℃培养箱
一、实验目的
通过细菌质粒DNA的提取，掌握共价闭合环状 DNA的提取方法。
二、实验原理
1. 细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。
2. 质粒DNA的提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污 剂（如Triton和SDS）裂解法。
3. 碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA 变性，共价闭合环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻 底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链 又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。
2、挑取单菌落，转移至盛有200mL LB的500mL三角瓶 中，37℃，振荡（200r/min）培养12h；
三、实验材料
1. 质粒pGEM-T easy ：编码氨苄青霉素（Ampr）的 抗性基因
2. 大肠杆菌（E.coli）DH5α菌株：氨苄青霉素敏
感型（Amp-）
四、实验用品
1. 超净工作台、摇床 2. 水浴锅、离心机 3. 分光光度计、移液器及枪头 4. 三角瓶（500mL、200mL） 5. 离心管（50mL、1.5mL） 6. 平板（Ampr、Amp-）、LB培养基 7. 冰冷的CaCl2溶液、质粒DNA
5. 加入400 μl的4℃预冷的Solution Ⅲ，轻轻上下翻转混合5～6次，直 至形成紧实凝集块，然后室温静置2分钟。
6. 室温12,000 rpm离心10分钟，取上清。 注）此时4℃离心不利于沉淀沉降。
7. 将试剂盒中的Spin Column（离心柱）安置于Collection Tube （收集 管）上。