免疫检验 第十四章 细胞因子的检查
细胞因子检测
1.细胞增殖法
原理： 一些细胞因子可专一刺激某些细胞增殖，而且 细胞增殖的程度与这些细胞因子活性呈正相关。
如：IL-2 —— T细胞， IL-3 ——肥大细胞，IL-6 ——浆细胞。 这些只依赖某种细胞因子才能生长的细胞系称为 依赖细胞株。
如人IL-2对鼠T细胞有生长支持作用 一定数量鼠T细胞+ 每孔分别加不同剂量的IL-2
IL-6诱导肝细胞产生-抗用相关试验来检测 验干扰素含量。
血凝素生成抑制试验：
小鼠脑脊髓心肌炎病毒可感染人肺癌A549细胞，该病毒 在生长过程中可产生血凝素，使人O型RBC凝集
试验管：A549细胞（已长好） 加一定量干扰素 培
养一定时间 加病毒
第十四章 细胞因子检测 P150
一.细胞因子检测应注意的问题
1.欲了解机体免疫功能，应检测多项细胞因子， 如细胞免疫应测IL-2、TFN-γ等
2.局部取标本：细胞因子由局部细胞产生，在 血液中浓度极低，最好取局部体液或细胞
3.动态检测比较，如疾病的复发期、缓解期、 恢复期
4.同一细胞因子选用多种方法联合检测，各种 方法检测结果不一定平衡
二.检测方法（P161）
生物学方法 免疫学方法 分子生物学方法
（一）生物学方法
原理：根据不同细胞因子生物学活性（功能) 不同而设计的方法
如IL-2可促进T淋巴细胞生长； TNF可杀肿瘤细胞； CSF可刺激造血细胞形成集落； IFN可保护细胞免受病毒攻击。
具体方法：
细胞增殖法 靶细胞杀伤法 诱导的产物分析法 细胞病变抑制法
利用细胞因子基因探针检测特定的细胞因子 mRNA表达的技术
常用方法：斑点杂交、逆转录PCR、 Northern blot、细胞或组织原位杂交等
细胞因子检测
细胞因子检测细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质分泌的蛋白质,在体内广泛参与免疫调节及炎症反应、组织修复、刺激造血系统、刺激细胞的增殖与凋亡等重要生理活动,•在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中均起重要作用。
某些刺激因子也可导致一些细胞因子超量表达,或表达减少,从而参与疾病的发病及病理过程。
1、免疫学检测法其基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。
•如免疫斑点法、ELISA法、RIA法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。
2.、生物学测定法其原理是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株(即靶细胞)•的促增殖作用,以增殖细胞中的DNA的合成或酶活性为指标,间接推算出细胞因子的活性单位,如对IL-1、IL-2等细胞因子活性的检测。
亦可根据某些细胞因子对特定靶细胞的杀伤效应或对病毒的抑制作用进行测定,如对肿瘤坏死因子及干扰素的生物活性测定。
3、分子生物学测定法目前采用的技术有各种印迹法、斑点杂交、原位杂交和PCR等。
通过检测细胞内细胞因子的基因组成或mRNA量,推算出细胞因子的合成量。
一、IL-1的检测(生物活性测定)产生IL-1的细胞种类很多,其中最主要的为单核-巨噬细胞。
IL-1可分为IL-1α(•也称酸性IL-1,pI=5.0)和IL-1β(中性IL-1,pI=7.0)。
两者的分子量和生物活性相似,•只能用抗体检测方法才能区别,常用的生物学测定法对两者都适用。
IL-1•的生物学活性广泛,其检测方法亦较多,包括有小鼠胸腺细胞增殖法、D10G 4.1细胞增殖法及L929细胞增殖法等。
IL-1反应细胞增殖可以通过活性染料染色,显微镜直接计数,3H-TdR或125I-UdR的DNA掺入量或以活性细胞代谢率为指标来表示。
本试验介绍L929细胞增殖MTT比色法。
（一）IL-1的诱生体外试验可用LPS等有丝分裂原诱导单核-巨噬细胞产生IL-1,或用P388D1(鼠),THP-1(人)细胞株制备IL-1。
《细胞因子的检测》课件
干细胞分泌的细胞因子具有促进组织再生和修复的作用，可用于治 疗多种疾病。
基因治疗
通过将具有治疗作用的基因导入细胞，调控细胞因子的表达，达到治 疗遗传性疾病和罕见病的目的。
04
细胞因子检测的挑战与展望
检测灵敏度与特异性
检测灵敏度
提高检测方法的灵敏度，降低检测限，以便更早地发现细胞 因子的存在。
挑战
面临的挑战包括如何提高检测方法的 实用性和可靠性，以及如何降低检测 成本，使其更易于在临床推广应用。
05
案例分析
案例一：肿瘤细胞因子检测
总结词
肿瘤细胞因子检测是利用细胞因子作为生物标志物，对肿瘤进行早期诊断、病情监测和疗效评估的方 法。
详细描述
肿瘤细胞因子检测通过检测肿瘤细胞分泌的细胞因子，如肿瘤坏死因子、白介素等，来判断肿瘤的存 在、发展阶段和预后情况。该方法具有无创、灵敏度高、特异性强等优点，有助于提高肿瘤的诊断准 确性和治疗效果。
案例三：感染性疾病细胞因子检测
总结词
感染性疾病细胞因子检测是利用细胞因子作 为生物标志物，对感染性疾病进行诊断和病 情监测的方法。
详细描述
感染性疾病细胞因子检测通过检测患者体内 异常升高的细胞因子，如白介素-1、白介素 -6等，来判断感染性疾病的类型和严重程度 。该方法有助于早期发现感染源，为患者提 供及时有效的治疗，同时有助于评估治疗效 果和预后情况。
药物研发
药物筛选
通过检测细胞因子水平的变化，可以筛选出具有潜在治疗作用的 候选药物。
药物疗效评估
在药物研发过程中，检测细胞因子水平的变化可以评估药物的疗 效和作用机制。
个体化治疗
根据患者细胞因子表达水平的差异，可以制定个体化的治疗方案 ，提高治疗效果。
细胞因子的检测方法
细胞因子的检测方法细胞因子(cytokine)是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的统称。
在免疫应答过程中，细胞因子在免疫调整、炎症应答、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。
细胞因子的检测不仅是基础免疫讨论的有较手段，同时在临床疾病诊断、病程观看、疗效推断及细胞因子治疗监测方面具有重要价值。
但是，由于细胞因子在体内的含量甚微，给细胞因子的检测带来困维，细胞因子的检测尚未在临床诊断上广泛开展，已知目前采纳的细胞因子检测方法均不完善，且不同的检测方法所得的结果差异较大，给临床诊断与治疗带来肯定的困难。
因此，有必要了解各种检测方法的特性及影响因素。
目前，细胞因子生物学活性检测和浓度测定方法主要有以下几类一.生物学检测法生物学检测又称生物活性检测，是依据细胞因子特定的生物活性而设计的检测法。
由于各种细胞因子具有不同的活性，例如IL-2促进淋巴细胞增殖，TNF杀伤肿瘤细胞，CSFci 激造血细胞集落形成，IFN爱护细胞免受病毒攻击，因此选择某一细胞因子独特的生物活性，即可对其进行检测。
生物活性检测法又可分为以下几类：1．细胞增殖法很多细胞因子具有细胞生 zhang 因子活性，特殊是白细胞介素，如IL-2 ci激t细胞生 zhang 、IL-3 ci 激肥大细胞生 zhang 、IL-6 ci 激浆细胞生 zhang 等。
利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依靠于某种因子的细胞系，即依靠细胞株(简称依靠株)。
这些依靠株在通常状况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。
例如IL-2依靠株ctll-2在不含IL-2的培育基中很快死亡，而加入IL-2后则可右体外 zhang 期培育。
在肯定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过测定细胞增殖状况(如使用3h-tdr掺入法、MTT法等)鉴定IL-2的含量。
除依靠株外，还有一些短期培育的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原ci 激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种细胞因子活性。
细胞因子检测方法
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细胞培养和刺激的基本方法
人IFN-γ：人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和 Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时
人TNF-α：使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激６小时
人IL-2：人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和 Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时
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mRNA的测定
（1）分子杂交实验 （2）逆转录PCR（RT-PCR）
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8
小结
生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能， 是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门 最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测 耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。
免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定 的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感 度也低于生物活性检测法（约低10～100倍）。
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免疫分析法
ELISA 细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 ELISPOT
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ELISPOT
Enzyme-linked Immunospot Assay
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ELISPOT发展历史
1963年：Jerne等人创立的溶血空斑技术(hemo-lytic plaque forming cell assay ,HPF),这项技术可用于检测并计数单个抗体形成细胞。
快速 简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs； 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统； 高效：在同一细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也 可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚群； 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境 更准确反映了体内状况。
细胞因子的检测和应用详解演示文稿
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(4)细胞因子诱导的产物分析法
• 某些细胞因子可刺激特定细胞产生生物活性
物质，如IL-2诱导骨髓细胞合成组胺、IL6诱导肝细胞合成a1-抗胰蛋白酶等。通过测 定所诱生的相应产物，可反映细胞因子的活 性
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靶细胞滤液
3~5μm孔径的微孔滤膜
受检的趋化因子
３７℃ 温育数小时 取膜固定、干燥、着染、脱色
将透明后的滤膜置油镜下检测细胞在 膜内通过距离，求其趋化单位
滤膜微孔小室法
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趋化因子或待测 液
细胞悬液
对照培养液
琼 脂 糖 平 板 法 将含小牛血清的1%琼脂糖倾于平皿，如上图操作后经３７
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实时荧光PCR技术
• 特点：实时（real time)测定 ，靶核酸扩
增和产物检测同时完成，扩增管在整个测定 过程中完全处于闭管状态，不容易出现扩增 产物对实验室的“污染”，对实验技术人员 的测定操作及实验室设置的要求都相 对要 低一些。
TaqMan技术
“分子信标”技术
自分泌（autocrine），少部分通过内分泌的形式作用于远处靶 细胞或靶器官；
• 4）多样性：一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型细胞也可产
生一种或几种相同的细胞因子。
• 5）网络性：协同效应；重叠效应；拮抗效应。 • 6）高效性：它们的受体亲和力高，表现很强的生物学活性，
是免疫球蛋白等分子远不能及的 。
细胞因子检测方法
细胞因子检测方法
细胞因子检测方法是一种用于测量和评估细胞因子水平的实验技术。
细胞因子是一类重要的分子信使，它们在免疫调节、炎症反应和细胞信号传递中发挥着关键作用。
通过检测细胞因子的水平，可以更好地了解免疫系统的功能状态，对疾病的诊断和治疗具有重要意义。
目前，常用的细胞因子检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术和多重细胞因子检测技术等。
ELISA是一种常规的实验方法，通过特异性抗体与目标细胞因子结合，然后通过酶标记的二抗进行检测，并测量光学信号来定量细胞因子的水平。
ELISA具有高灵敏度和特异性，常用于检测单个细胞因子的水平。
流式细胞术是一种可以同时检测多个细胞因子的方法。
它基于细胞表面标记和荧光染料，通过流式细胞仪分析细胞因子的表达。
流式细胞术具有高通量和多参数分析的优势，可以同时检测多个细胞因子，为复杂疾病的研究提供了便利。
此外，近年来出现了多重细胞因子检测技术，如Luminex和Bio-Plex等。
这些技术基于微球和荧光染料的原理，可以同时检测上百种细胞因子，具有高通量和高灵敏度的特点。
多重细胞因子检测技术在疾病的诊断和治疗方面有着巨大的潜力。
细胞因子检测方法在临床诊断和研究中发挥着重要作用。
通过测量细胞因子的水平，可以评估免疫功能、炎症反应和疾病进展等，为疾病的早期诊断和治疗提供
了重要的参考依据。
随着技术的不断进步，细胞因子检测方法将持续发展，为临床医学和生物学研究提供更多的可能性。
细胞因子的检测
TF-1（H）增殖法
GN-CSF、IL-5
IL-6、EPO
IL-4 IL-5
CTLL（M）增殖法 BCL-1（M）增殖法
IL-2 IL-4
各类细胞因子检测的常用靶细胞
细胞因子 IL-6 实验系统 B9（M）增殖法 BM60（H）增殖法 IL-7 IL-8 GM-CSF TNF/ IFN Clone-IXN/2b（M）增殖法 中性粒细胞（M、H）趋化法 TF-1（H）增殖法 IL-3、IL-5 干扰因素 IL-4、IL-11
一、IL-2的检测 二、IFN-γ的检测
三、TNF的检测
待检样品（细胞上清） 指示细胞（CTLL-2）
按不同稀 释度加入
37º C，16-20小时 加入3HTdR（1-5Ci）
37º C，4-6小时 收集细胞
测定
白 细 胞 介 素 2 的 测 定 示 意 图
-
待检样品（细胞上清） 指示细胞（L929）
趋化因子（Chemokine）—— IL-8、GROs、MCP-1
生长因子（Growth factor）—— EGF、FGF、IGF、PDGF
各 类 细 胞 因 子 间 关 系
ILs IFNs
TNFs
TGFs
CSFs
Chemokines
1、旁分泌（paracrine）、自分泌（autocrine）性 2、多源与同源性 3、高效性 4、多效性（pleiotropy） 5、丰余性（redundancy） 6、协同性
第一节
细胞因子检测概述
一、细胞因子的类型与作用特点
二、细胞因子检测的特点与方法
细胞因子
由非神经—内分泌细胞 产生的一大类与免疫应答活 动密切相关的低分子蛋白与 多肽。
细胞因子检测方法
细胞因子检测方法细胞因子是一类存在于细胞内的小分子蛋白质，它们在细胞间扮演着重要的信号传递和调节作用。
细胞因子的产生和释放常常与某些疾病的发生和发展密切相关。
因此，对细胞因子的检测成为了许多疾病的诊断和治疗的重要手段之一。
本文将介绍几种常用的细胞因子检测方法。
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用的细胞因子检测方法。
该方法通过专门的ELISA 试剂盒，利用特异性的抗体对目标细胞因子进行检测。
ELISA方法具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优点，可以用于检测多种细胞因子，如白细胞介素、肿瘤坏死因子等。
二、流式细胞术流式细胞术（Flow Cytometry）是一种通过检测细胞表面或细胞内标记物来分析和鉴定细胞的方法。
在细胞因子检测中，可以通过标记抗体来检测细胞表面的特定细胞因子。
流式细胞术具有高通量、高灵敏度、多参数等优点，可以同时检测多种细胞因子的表达水平，并对细胞因子的分布、数量等进行分析。
三、PCR方法聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种常用的分子生物学技术，可以通过扩增目标DNA片段来检测细胞因子的基因表达水平。
PCR方法可以通过设计特异性引物，扩增细胞因子基因的特定区域，并通过凝胶电泳等方法来检测扩增产物的存在与否。
PCR方法具有高灵敏度、高特异性等优点，可以用于定量和定性分析细胞因子的表达水平。
四、蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术（Protein Microarray）是一种高通量的蛋白质检测技术，可以同时检测多种细胞因子。
蛋白质芯片技术通过将不同的细胞因子蛋白固定在芯片上，然后与标记有荧光物质的样品中的细胞因子进行特异性结合，最后通过荧光扫描仪来检测荧光信号的强度，从而获得细胞因子的表达水平。
蛋白质芯片技术具有高通量、高灵敏度等优点，可以用于筛选和鉴定细胞因子。
细胞因子检测方法
细胞因子检测方法
细胞因子是一种介导细胞间相互作用的小分子信号物质，具有在机体免疫、炎性反应、生物钟同步、细胞分化、生殖发育等方面的重要功能。
因此，细胞因子的检测对于了解疾病发生、发展机制以及药物治疗的疗效等方面具有重要意义。
以下是几种常见的细胞因子检测方法：
1. 酶联免疫吸附试验(ELISA)：该方法利用特异性抗体与细胞因子结合，通过酶标记测定其浓度。
具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，是目前最常用的检测方法。
2. 流式细胞术：该方法利用荧光标记的特异性单克隆抗体对细胞因子进行检测，可以同时检测多种细胞因子，但操作较复杂，需要较高的技术水平。
3. 放射免疫分析(RIA)：该方法利用放射性同位素标记的抗体与细胞因子结合并通过放射检测器测定放射性计数率来检测其浓度，具有高灵敏度和高特异性，但需要操作较为繁琐，使用范围较窄。
4. 生物传感器检测法：该方法利用细胞因子与生物传感器相互作用后产生电化学信号来进行检测，具有快速、灵敏度高、实时检测等优点，但需要设计和构建生物传感器。
5. 质谱法检测：该方法利用质谱仪检测分子的质量和分子类别，可以对多种细
胞因子同时进行检测，但需要较为昂贵的设备和较高的技术水平。
总之，选择适宜的细胞因子检测方法需要考虑实验室设备、技术水平、检测样本和需要检测的细胞因子等多个因素。
细胞内细胞因子的检测
细胞内细胞因子的检测细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。
研究显示，细胞因子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。
早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。
尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如Th1(IL-2，IFN-γ)与Th2(IL-4，IL-5，IL-10)，但这些研究很难推广，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还不清楚。
活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外，而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原，所以应阻断细胞因子分泌至细胞外，方法为破坏高尔基体，因细胞因子（即各种蛋白）在合成后需经高尔基体的加工和转运，才能到达细胞膜，然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。
因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。
近来，Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。
这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
胞内细胞因子染色与传统的检测可溶性蛋白的方法如ELISA相比，具有显著优越性。
该法从单个细胞水平检测内多个细胞因子的同时，还可标记各种细胞表面分化抗原以及活化分子、趋化因子受体和黏附分子等，从而区分表达特定细胞因子的细胞亚群及其表型特征。
使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。
早在1986年，Mosmann等应用Th细胞克隆技术和细胞因子产生的不同，发现小鼠CD4细胞是一个不均一的亚群，可分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。
后来在人类的CD4细胞群中也发现了Th1和Th2细胞亚群。
Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应，在抗胞内病原菌感染中发挥重要作用；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，其主要功能是刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫有关。
《细胞因子检测概述》课件
化学发光法
化学发光法是一种利用化学发光反应来检测细胞因子的方 法。这种方法具有高灵敏度、高特异性和可定量等优点， 适用于痕量细胞因子的检测。
化学发光法主要包括酶促化学发光和直接化学发光等方法 。这些方法在临床诊断、药物研发和环境监测等领域有广 泛应用。
荧光定量PCR法
荧光定量PCR法是一种基于PCR技术 的细胞因子检测方法。通过荧光染料 或探针标记的特异性引物，实现对细 胞因子基因的定量检测。这种方法具 有高灵敏度、高特异性和可定量等优 点。
THANKS
感谢观看
细胞因子在免疫应答、炎症反应、造 血等生理和病理过程中发挥重要作用 。
细胞因子种类
白细胞介素（IL）
如IL-1、IL-2、IL-6等，具有调节免疫和炎 症反应的功能。
干扰素（IFN）
如IFN-α、IFN-β、IFN-γ等，具有抗病毒、 抗肿瘤和免疫调节作用。
肿瘤坏死因子（TNF）
如TNF-α、TNF-β等，具有抗肿瘤和免疫调 节作用。
案例二：自身免疫性疾病细胞因子检测
总结词
自身免疫性疾病细胞因子检测是利用细胞因子作为生物标志物，对自身免疫性疾病进行诊断和病情监测的方法。
详细描述
自身免疫性疾病细胞因子检测通过检测患者体内异常升高的细胞因子，如IL-17、IL-23等，来判断自身免疫性疾 病的存在、发展阶段和治疗效果。这种检测方法有助于提高自身免疫性疾病的诊断准确性和治疗效果，为患者提 供更好的治疗选择。
05
细胞因子检测案例分析
案例一：肿瘤细胞因子检测
总结词
肿瘤细胞因子检测是利用细胞因子作为生物标志物，对肿瘤进行早期诊断、病情监测和疗效评估的方 法。
详细描述
肿瘤细胞因子检测通过检测肿瘤细胞分泌的细胞因子，如IL-6、TNF-α等，来判断肿瘤的存在、发展 阶段和治疗效果。这种检测方法具有无创、灵敏度高、特异性强的优点，有助于提高肿瘤的诊断准确 性和治疗效果。
细胞因子的ELISA方法检测
实验报告1.取已包被抗体并完成封闭的酶标条2条，分别装于酶标架上。
在每条酶标条的1~6孔分别加入稀释液100微升。
2.向第6、7孔加入分别加入2000pg/ml PGFβ1标准品100微升。
3.用加样枪吹吸混匀第6孔的液体，注意避免气泡形成。
混匀后其浓度约为1000pg/ml。
4.再吸出100微升加入第5孔，吹吸混匀。
其浓度变为500pg/ml。
以此类推，一直加到第2孔。
吸去多余的100微升。
5.向第8、9孔各加入100微升样品1。
10、11孔加入100微升样品2.6.封口膜覆盖酶标板，防止水分挥发。
7.将酶标板置于37℃温箱孵育120min。
8.取出孵育后的酶标板，揭开封口膜，甩去孔中液体，注意甩动方向，避免液体流入相邻酶标孔，造成交叉污染。
9.加入洗涤液，注意不要溢出至相邻孔，造成交叉污染。
静置3min后甩去孔中液体，重复以上洗涤过程4次。
在吸水纸上拍干孔中液体。
10.每个孔各加入酶标记抗体100微升。
封口膜覆盖酶标板，将酶标板置于37℃温箱孵育60min。
11. 取出孵育后的酶标板，揭开封口膜，甩去孔中液体。
再加入洗涤液，静置3min后，甩去孔中液体，重复以上洗涤过程4次。
在吸水纸上拍干孔中液体。
12. 每个孔各加入底物A 100微升，再加入底物B各100微升。
晃动酶标板混匀。
将酶标板放入37℃温箱孵育15min显色。
13. 取出孵育后的酶标板，见酶标板孔中液体呈蓝色。
14. 每个孔各加入终止液100微升，可见液体变成淡黄色。
15.用酶标仪在450nm处测OD值。
结果如下：16. 分析结果：将2组标准品的OD值和标本1、标本2的4个副本的OD值合并得到平均值。
根据各自的OD值，在半对数坐标上标出62.5、125、250、500、1000、2000这6个不同稀释度标准品所处的位置，将6个点连线集会成标准曲线。
根据2个标本的OD值标出其在OD值普通坐标上的位置，虚线连接其在标准曲线上的位置，再用虚线连接确定其在浓度坐标上的位置。
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有评价作用。
感染性疾病、免疫炎症、移植排斥反应：TNF、IL-1、IL-
6、IFN-γ 肝脏损伤的两种炎症介质：TNF、IL-6 活动性结核：IL-4 ↑，IFN-γ 及IL-2 ↓ 结核性胸膜炎： IFN-γ 及IL-2 ↑,IL-4 ↓ 类风湿关节炎： TNF、IL-1、 IL-6、IL-8、MCP-1 ↑ 溃疡性结肠炎：IL-15 ↑ 哮喘：IL-5 ↑
性细胞的趋化和激活活性。
趋化因子的生物学特性
1、趋化移行效应：趋化单核细胞向炎症部位移行
2、不但能使免疫细胞向感染部位移行，也可促使天
然免疫应答向获得性免疫应答的转变。
3、趋化因子及其受体在T、B细胞的分化发育中起重
要作用。
4、不同极化的T淋巴细胞表达不同的趋化因子受体。
第三节 细胞粘附分子与细胞粘附分子受体的 特性与功能
第二节 趋化因子及趋化因子受体的特性与功 能
趋化因子：
8 ～12kD 已发现50余个成员 根据结构中C的位置、排列方式和数量,分C、CC、CXC、 CXXXC四类。是细胞因子中唯一作用于G蛋白偶联受体 的超家族成员。 由白细胞与造血微环境中的基质细胞分泌，具有对中 性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性细胞和嗜碱
结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系
敏感性相对较低 标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性
抗体对细胞因子的结合
四、其他检测技术
偏振荧光检测技术 激光共聚焦显微镜 发光技术 免疫组织化学技术
第五节 细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用
细胞因子的测定主要应用于： 特定疾病的辅助诊断 机体免疫状态的评估 临床疾病治疗效果的监测和指 导用药 疾病预防
保 证结果的特异性
（三）细胞因子的联合检测
意义： 举例： T细胞、巨噬细胞和上皮样细胞分泌相应细胞因 功能：IL-1、 IL-2、IFN-γ和GM-CSF
子的 Th1/Th2细胞平衡状态：IL-2、IL-4、IL-10和
IFN-γ
二、特定疾病诊断的辅助指标
（一）细胞因子检测在特定疾病诊断中的意义
1．分离和培养待检细 细胞内细胞因子的测定： 胞 2．细胞固定、破膜 3．封闭非特异性结合 基本步骤 位点 4．染色与分析
细胞表面的粘附分子或细胞因子受体？ 区分不同分泌特性的细胞亚群： Th1细胞 Th2细胞 IFN-γ IL-4
三、酶联免疫斑点试验 (enzyme linked immunospot, ELISPOT)
一、ELISA方法
1. 双抗体夹心法 2. 双位点一步法
标本： 1.血清、血浆、关节液、胸腔液、脑脊液、腹 腔液
2.细胞体外培养后的培养上清液
ELISA
特异、简便 易于推广和标准化等优点 可同时检测大量标本且试验废弃物便于处
理
细胞因子测定的首选方法
敏感性偏低 不能判断细胞因子的生物学活性。
二、流式细胞分析法
第十四章 细胞因子与细胞粘附 因子检测及应用
细 胞因 子
由活化的免疫细胞及部分基质细胞分泌的、主要介导和调节 免疫应答及炎症反应的具有高活性、多功能的小分子蛋白质。
在免疫细胞分化发育、免疫调节、炎症反应、造血功能中均发 挥重要作用，并参与人体多种生理和病理过程的发生胞与细胞、细胞与细胞外基质间粘附作用 的膜表面糖蛋白。 在胚胎的发育和分化、正常组织结构的维持、炎症与免疫应 答、伤口修复、凝血与血栓形成、肿瘤转移等过程中具有重 要作用。
1、整合 素家族 5、可溶性 粘附分子 2、免疫球 蛋白超家族
分类
4、钙粘蛋 白家族
3、选择 素家族
1、整合素家族
整合素家族最初是因此类粘附分子主要介导细胞与 细胞外基质的粘附，使细胞得以附着而形成整体 而得名。
2、免疫球蛋白超家族
免疫系统以及神经 系统和其它生物学系 统中，许多参与抗原 识别或细胞间相互作 用的分子，具有与Ig 相似的结构特征，即 具有1个或多个Ig样 或样结构域。这些种 类繁多、分布广泛、 识别功能多样的分子 称之为免疫球蛋白超
（二）标本的适当选取
常用临床标本：抗凝全血并分离获得单个核细胞。血清或血浆 炎症局部细胞因子的水平：局部分泌液
细胞因子或粘附分子的细胞内定位检测：相应细胞
相应细胞因子的基因和mRNA表达：相应细胞 疗效观察和预后判断：疾病急性期和恢复期双份标本进行动态观 测 免疫荧光染色和流式细胞分析：注意待检细胞的活性和状态，以
6.网络性： 多CK互相平衡
B
活化、 增殖、 分化
多效性 pleiotropy
IL-4 胸腺细胞
增殖
增殖 肥大细胞
重叠性 IL-2、 redundancy IL-4、 IL-5
B
均有刺激B细胞 增殖的功能
协同性 synergy
IL-4 + IL-5
B B细胞
更有效地诱导 IgE类别转换
拮抗性 antagonism
(U/ml)表示 有助于细胞因 子检测的活性 作用 刺激细胞增殖或集落形成的活 性维持细胞生长和存活的特性 抑制细胞生长或破坏细胞的效 应促进细胞趋化或抗病毒作用
生物学活性测定方法学评价
敏感性较高 特异性不高 操作繁琐
易受干扰
免疫学测定法 ELISA 流式细胞分析法 酶联免疫斑点试验（enzyme linked immunospot, ELISPOT）
第四节 临床常用的测定方法
生物学测定法 免疫学测定法
生物学测定法分类
1.基于DNA检测的分子生物学测定法：
DNA扩增法 RNA印迹法
原位杂交法
核酸酶保护分析
2.生物活性测定法
生物活性测定法原理
根据细胞因子特定的生物学活性,应用相应的
指示系统,同时与标准品对比测定,从而得知
样品中细胞因子的活性水平,一般以活性单位
一、细胞因子的共同特性与作用方式 与相应受体特异性结合才能发挥作用。细胞 因子可以旁分泌、自分泌或内分泌的方式发 挥作用。
CKs的共同特性
1.高效性： 靶细胞-受体；高亲和力结合 2.多效性： 一CK多靶多效 3.重叠性： 多CK一靶一效
4.协同性： 一CK强化它CK
5.拮抗性： 一CK抑制它CK
ELISPOT
基
1个斑点代表
1个细胞因子 分泌细胞， 斑点的颜色 深浅程度与
本
原
理
细胞分泌的
细胞因子量 相关。
优点：
ELISPOT方法学评价
特异性高 操作简便、快速，无需依赖细胞株 影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易 标准化。 缺点： 所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物 活性不一定呈正比
胞提呈的抗原后，如缺乏粘附分子提供的辅助刺激
信号，则T细胞的应答处于无能状态。
（二）介导白细胞与血管内皮细胞粘 附
（三）介导淋巴细胞归巢
• 淋巴细胞归巢是淋巴细胞的定向游动，包括淋巴干 细胞向中枢淋巴器官归巢，成熟淋巴细胞向外周淋
巴器官归巢，
继而经淋巴管、
胸导管进入血液
进行淋巴细胞再
循环，以及淋巴 细胞向炎症部位 渗出。
（二）粘附分子检测在特定疾病诊断中的意义 E-钙粘素：表达缺失，提示胃腺 癌及其分化程度的早期辅助诊断； 突变与动脉粥样硬化有关。 CD44：高表达，提示肿瘤转移
三、评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后
※TNF-α：自身免疫性疾病 ※ GM-CSF：血液病 。 ※IFN-γ：肿瘤
思考题
1．细胞因子和细胞粘附分子的特性是什么？可分为 几类？ 2．细胞因子生物活性测定法的种类，各用于哪些细 胞因子的检测，主要优缺点？
一、临床应用原则
细胞因子和粘附分子的异质性、功能交叉 性和多样性、来源的复杂性和组织细胞的非特 异性，决定了在进行这些分子检测时，必须对 方法选择和结果判断作出综合考虑。
（一）方法的联合应用
细胞因子的检测方法多种多样，各有利弊。
高敏感性方法：特异性的降低、废弃物难处理 活性测定方法：定性试验 基因分析法：利于细胞内定位分析、操作烦琐
3、选择素家族
选择素家族最初被称为外源凝集素细胞粘附分子 家族（LEC-CAM家族）。
4、钙粘蛋白家族
钙粘蛋白是一类钙离子依赖的粘附分子 家族。钙粘蛋白在维持实体组织的形成以 及在生长发育过程中细胞选择性的相互聚
集、重排有重要作用。
5、可溶性粘附分子
一般只有胞外区，同样具有粘附 活性，检测可溶性粘附分子的增高 水平可作为监测某些疾病状态的指 标。
二、 粘附分子的功能
淋巴细胞活化的辅助信号分子 介导白细胞与血管内皮细胞粘附
介导淋巴细胞归巢
（一）淋巴细胞活化的辅助信号分子
辅助受体和辅助活化信号是指免疫细胞在接受 抗原刺激的同时，还必须有辅助的受体接受辅助活
化信号才能被活化。
最为常见的提供辅助刺激信号的T细胞上粘附分 子结合抗原提呈细胞（APC）上相应粘附分子有： CD4/MHCⅡ类分子、CD8/MHCⅠ类分子、CD28/CD80及 CD86、CD2/CD58、LFA-1/ICAM-1等。T细胞识别APC细
3． ELISPOT的原理、用途、与ELISA的异同是什么？
4．在应用流式细胞术分析细胞因子时，需要哪些靶 细胞活化剂？各自的作用是什么？ 5．如何利用细胞因子检测来判断Th1/Th2细胞平衡？
小 结
1. 细胞因子和粘附分子是构成免疫应答的重要物
质基础，检测这些分子可反映机体的免疫状态。 2. 细胞因子或粘附分子的检测方法包括生物学测 定法和免疫测定法两大类。 3. 细胞因子和粘附分子检测的临床意义。对某些 特定疾病具有诊断价值；对细胞因子治疗具有 监测和指导用药的意义；对机体的免疫状态具
IL-4
B
IFN-g
IFN-g 阻断IL-4 诱导类别转化的 作用，IL-4抑制 IFN-g