人胚胎干细胞培养手册
胚胎干细胞的培养
胚胎干细胞的体外培养胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES cell)也称ES细胞,是一种存在于着床前早期胚胎中的具有全能性的细胞。
全能性即分化发育成三个胚层的组织细胞的能力。
胚胎干细胞能在体外进行培养传代,保持未分化二倍体状态以及其全能性，具有形成嵌合体动物(chimeric animal)的能力。
胚胎干细胞最早由Evans和Kaufman(1981)两人以及Martin(1981)分别从小鼠早期胚胎中分离培养成功并建立细胞系。
由于其具有全能性,故广泛用于胚胎发育及胚胎工程方面的研究。
例如在培养液中加入不同的分化因子,可定向诱导其分化发育成心肌细胞、淋巴细胞以及神经细胞,甚至可用它培养出器官；可用不同的外源性基因转染胚胎干细胞,或在胚胎干细胞水平上进行基因敲除或基因打靶,经体外筛选后建立带有目的基因的细胞系或将筛选后带有目的基因的胚胎干细胞注射到宿主着床前胚胎内,并移植到假孕母体子宫腔内使之发育成个体。
从而建立转基因动物、基因敲除动物和基因打靶动物，研究基因在分化发育过程中的表达与调控以及制备人类疾病动物模型等。
由于胚胎干细胞在体外培养过程中极易分化和失去正常二倍体核型，进而失去全能性和丧失形成嵌合体动物的能力，故需要特殊的培养条件。
目前, 由于小鼠胚胎干细胞体外培养技术最为成熟，本文将以此为例，较详细地介绍胚胎干细胞体外分离培养和鉴定等实验技术。
一、胚胎干细胞体外培养原理胚胎干细胞体外培养的原则是: 在促进胚胎干细胞增殖的同时，维持其未分化二倍体状态。
胚胎干细胞一旦分化即失去其全能性，失去二倍体正常核型的细胞则会大大降低形成嵌合体(chimera)的能力，特别是进入种系形成生殖细胞的能力。
目前体外培养胚胎干细胞的方法归纳起来有二大类：有饲养层培养法和无饲养层培养法。
有饲养层培养法主要应用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系STO细胞作为饲养细胞；经丝裂霉素-C或γ-射线处理终止其分裂后制备成饲养单层(feeder layer)，将胚胎干细胞种植在这样的单层上。
胚胎干细胞培养标准化操作规程（SOP）
胚胎干细胞培养标准化操作规程（SOP）一、细胞多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。
由Dr. Nagy的实验室制备。
2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。
3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。
我们得到时大约传了7－9代。
4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。
5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。
二、一般培养——维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
培养基ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS 和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。
贮存于4℃。
注：一瓶DMEM 是500ml。
贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTESGRO复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
胚胎干细胞体外培养.
胚胎干细胞体外培养.胚胎干细胞体外培养(一)胚胎干细胞的来源目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。
其中囊胚的ICM最为常用。
(二)胚胎干细胞的分离1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。
以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。
以PGCs取ES 细胞时：小鼠取12.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或13.5～14.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。
2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。
从囊胚分离ICM的方法主要有三种：(1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。
这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。
(2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。
胚胎干细胞的分离培养技术(最全版)PTT文档
ES细胞的特点：
➢ES细胞具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为
体积小、核大，核仁突出，培养时呈克隆状生 长；在功能上，ES细胞具有发育的全能性，即 具有分化为成年动物体内任何一种细胞类型的 能力。
➢ES细胞具有细胞系的特征，在饲养层上能维持
未分化状态并实现自我更新。因为可无限增殖， 也可冷冻保存。
ICM PGCs i在E1F(EEnw、eSSSt功hom细 细 细根itL能ae胞胞胞a据lep上n可具在i细dpg，rim用有哺ga胞lEcee于胚乳e的nSt t6b研胎动细a分8ltai究细物胞9o化s9nt细胞个具o特doce胞的体有ny点vsh癌特发发et建selo.变性生育a立pde机，发的更adn理在育全有frdo和形规能效lme新态律性g的as药上的，)培D. 物表研即u养ro的现究具体c筛为中有-系P选体极分iet。积有化ra小价为in 、值成bla核的年st大工动oc，具物ys核；体t (仁内red突任a出何nd，一b培种la养细ck时胞pi呈类gm克型e隆的nta状能tio生力n长。) in；jected with German Land-race PGCs
嵌合体动物制作方法： 1、集合（凝集）法：在卵裂阶段使2个以上的
胚胎发生粘着和结合。 2、注入法：在临近着床的胚泡期，用显微操作
方法将另一个体的细胞注入到囊胚腔中。
研究现状：
家畜的嵌合体不但已在个体间和品种间 取得成功（绵羊、牛等），而且在异种间 也得到了活的后代，如绵山羊人工嵌合体， 该技术对遗传学研究具有重要意义，塑造 特异性状的新奇物种，从而为动物园展示 了新的前景，嵌合体也被用来研究免疫学 系统的机理。
延迟小鼠囊胚中分离出来的多能性细胞，当 时称之为EK细胞。以后称之为胚胎干细胞。
人胚胎干细胞分离培养与纯化
人胚胎干细胞
1.原代培养及纯化
复苏冷冻的胚胎，用G1.3、G2.3序贯培养法培养至囊胚。
将扩张囊胚移入链霉蛋白酶中，在光镜下观察，在透明带即将完全消化溶解之前移出，用DPBS或DMEM-F12液充分洗涤后种植到灭活的鼠胚胎成纤维细胞上。
种植后每隔12 h观察孵出囊胚的贴壁、增殖情况和分化倾向，种植后约36～48 h后换液，随后每天半量换液或根据培养孔内细胞代谢情况予以换液。
原代克隆生长10～14 d时进行初次传代，前5 代细胞采用机械法，即用拉细的玻璃毛细管将细胞团块刮出，再用1 ml注射器针头在体式显微镜下将克隆分散成适当团
块，重新接种到预先种有饲养层的培养皿中，每日换液。
待hES细胞生长稳定后换用0．05％dispase消化细胞，37℃作用3～5 min，吸管轻轻吹打成约含30--50个细胞的小团块，传代培养，每日换液。
2.原代培养及纯化
将hES细胞培养于60mm组织器官培养皿中。
培养皿事先用含有0.1％白明胶包被及加入1 x 106个经放射性照射的MF1鼠胚胎成纤维细胞。
hES细胞用Thomson细胞培养液于37℃、5％二氧化碳培养箱内进行培养至细胞克隆增大，未分化的干细胞克隆在7-10 d左右被轻轻切割成6-8小块，转移到三个培养皿中再进行培养。
人类胚胎干细胞基础培训教材
人类胚胎干细胞基础技术高级培训班2010-12目录1. 绪论 (4)2. 饲养层细胞的制备 (5)2.1 从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） (5)2.2 MEF的传代 (6)2.3 MEF的冻存 (6)2.4 MEF的失活 (7)3. 饲养层细胞的准备 (8)4. ES/iPS细胞的复苏 (10)5. ES/iPS细胞的传代 (11)6. ES/iPS细胞的冻存 (13)7. 人类胚胎干细胞的无滋养层培养 (14)7.1 人类胚胎干细胞条件培养基（CM）的收集 (14)7.2 无饲养层人胚胎干细胞系的培养及传代 (14)8. 拟胚体的形成 (15)9. 胚胎干细胞全能性的鉴定 (16)9.1碱性磷酸酶活性检测 (16)9.2干细胞表面marker的免疫染色检测 (17)9.3干性因子的去甲基化程度分析 (18)9.4干细胞内源基因的表达分析 (21)9.5端粒酶活性检测 (22)9.6核型检测 (23)9.7拟胚体形成 (23)9.8畸胎瘤形成实验 (23)10. 干细胞技术培训及服务一览表 (24)11. 附录 (25)1.绪论本操作手册将为您详细介绍人胚胎干细胞/iPS细胞培养的基础知识、技术细节及相关的产品信息。
目的是为了让您更好地培养您购买的细胞，请按照此手册进行培养操作直至获得可靠的冻存细胞。
上海斯丹赛生物技术有限公司专业提供各类胚胎干细胞/iPS细胞及成套产品服务，为您的干细胞研究提供一站式解决方案。
2.饲养层细胞的制备材料与仪器♦成纤维细胞完全培养基，货号EFM-01♦胰酶，货号M-005-1♦成纤维细胞冻存液（2x），货号EFFM-01♦基质胶（Matrigel matrix），BD Pharmingen，货号356235♦CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），货号MEF-CF1-01♦T25透气培养瓶，NUNC，货号156367♦T75透气培养瓶，NUNC，货号156499♦ 2 ml移液管，NUNC，货号159617♦5ml移液管，NUNC，货号159625♦10 ml移液管，NUNC，货号159633♦15ml离心管，货号366036♦50ml离心管，货号373660♦冻存管，NUNC，货号377267♦Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头♦生物安全柜，货号♦CO2培养箱，Thermo，HERA cell 150i♦电子计数器，millipore，货号PHCC00000♦电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号4580800♦低速离心机，Thermo Scientific CL10♦液氮罐，Thermofisher，货号CN509002.1从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）1. 拉断颈椎处死怀孕12-13天的CF-1小鼠，浸入70％的酒精中消毒。
IPS技术手册
人类诱导性多能干细胞（iPS细胞）技术指导手册目录：1.前言 (1)2.人类胚胎成纤维细胞培养 (2)3.重编程载体构建 (3)4.病毒包装 (4)5.人类iPS细胞的诱导 (6)6.iPS细胞鉴定 (8)6.1碱性磷酸酶活性检测 (9)6.2干细胞表面marker的免疫染色检测 (9)6.3干性因子的去甲基化程度分析 (11)6.4干细胞内源基因的表达分析 (13)6.5端粒酶活性检测 (14)6.6核型检测 (15)6.7拟胚体形成 (15)6.8畸胎瘤形成实验 (15)7．干细胞技术培训及服务一览表 (15)8．附录 (16)1.前言iPS细胞最初从成纤维细胞重编程而来，因为它们准备和操作相对简单。
其他细胞类型，包括来自外胚层、中胚层和内胚层的细胞也可以用于产生iPS细胞（Eminili et al2008）。
2006年Yamanaka和Takahashi利用逆转录病毒系统在成鼠的成纤维细胞导入四个转录因子（Oct3/4,Sox2,c-Myc,和Klf4，Yamanaka因子），将其重编程为iPS细胞，它具有跟小鼠ES十分相似的特性，尤其重要的是，iPS细胞也能产生后代。
2007年，iPS技术在人类体细胞中得以应用，人类iPS 细胞的产生对退行性疾病的治疗产生巨大的影响（Takahashi et al;Yu et al,2007）。
由于iPS细胞具有和ES类似的功能，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多瓶颈，因此在医疗领域的应用前景非常广阔，成为干细胞研究的热点，《自然》和《科学》杂志分别将其评为2007年第一和第二大科学进展。
随后，iPS细胞的研究日新月异。
.近几年来，iPS研究方面取得的一系列的重大成果让我们欣喜不已，然而，这才刚刚开始，iPS细胞能真正用于临床惠及大众还面临着很多技术上的问题。
一方面iPS产生的方法有待改进；另一方面iPS细胞的定向分化手段需继续探索。
斯丹赛干细胞生物技术公司拥有成熟稳定的胚胎干细胞/iPS细胞技术平台，将竭力为全国各类进行干细胞/iPS研究的科研机构、高校、相关医疗机构和制药企业等提供高品质产品和优质的服务。
胚胎干细胞培养标准化操作规程(SOP)
一、细胞多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。
由Dr. Nagy的实验室制备。
2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。
3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。
我们得到时大约传了7－9代。
4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。
5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。
二、一般培养——维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
培养基ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS 和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。
贮存于4℃。
注：一瓶DMEM 是500ml。
贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTESGRO复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
ECM及Matrigel使用手册
BD Bioscience Discovery Labware BD Biocoat TM产品使用指南BD Biocoat TM Matrigel TM 基质BD Biocoat TM细胞相关检测系统目录1BD Biocoat TM Matrigel TM 基质1.1 Matrigel基底膜基质胶 (1)1.2 高浓度HC Matrigel基底膜基质胶 (3)1.3 人来源细胞外基质 (4)1.4 Ⅲ型人重组胶原蛋白 (5)1.5 高浓度层粘连蛋白/巢蛋白混合物 (6)1.6 人胚胎干细胞专用的Matrigel基质 (7)2BD Biocoat TM细胞检测相关系统2.1 Biocoat肿瘤侵袭系统 (8)2.2 Biocoat血管生成系统：内皮细胞侵袭 (10)2.3 Biocoat血管生成系统：内皮细胞迁移 (12)2.4 Biocoat血管生成系统：内皮血管形成 (14)Caco-2检测系统 (15)2.5 BiocoatHTS附录：细胞培养系统快速使用指南 (17)Biocoat TM Matrigel TM常见问题 (17)1BD Biocoat TM Matrigel TM 基质1.1Matrigel基底膜基质胶BD产品货号：354230 354234 356230 356231 356234 356235 356237储存和运输：-20度储存，干冰运输。
操作指南BD采用专利技术，从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中分离出BD Matrigel 基底膜基质，其主要成分由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，巢蛋白，硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。
BD Matrigel基底膜基质在室温条件下，聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，以及对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达的研究。
BD Matrigel 基底膜基质形成的三维培养基质，可促进上皮细胞、肝细胞、Sertoli细胞、黑色素瘤细胞、血管内皮细胞、甲状腺细胞及毛囊细胞等的贴壁与分化。
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hES细胞培养是费力的,除了复苏/传代的之外,培养液应该每天被更换。此外，复苏或传代之后经常出现生长滞后现象。因此,每天观察细胞非常重要，必须保证提前两天准备MＥF,因为传代的时间可能会超出你的预期。
请注意，我们已经观察到在这些ＨUES细胞系，染色体的改变包括１2三体(在两个细胞系：hVES－３和4)和其它改变(ＨUES-1 2号染色体增加）。这些染色体的异常与增殖特点和双链期短等有关。由于染色体异常在ｈES细胞系中是普遍的,建议经常进行染色体分析。
种植MＥFs：37℃预温MEF培养液,吸１0ml到15ml无菌离心管中。从-80℃取出MEＦ冷冻管，立即沁入37℃水浴中，大约30-４5秒，细胞有8０％融化时取出，立即拿进超净台,７０%异丙醇消毒。把细胞加有培养液的离心管中,最好用1ml培养液冲洗冻存管，也加到离心管中。50０－6０0g，离心5分钟。离心同时,从培养皿中吸出明胶，离心后,小心弃去上清，用12mｌ（６个孔）培养液重悬细胞,充分混匀,每孔加入2ml。标记MEＦ皿,3７℃过夜,让MEF贴壁。
6小时后细胞贴壁，最好在接种24－４8小时使用，不要使用超过4天的ＭEF.
hESｄellｓ
所得到的hEScｅlls在1０cm培养长满后，分装6瓶，密度4×105ｃelｌs/ml—对于绝大多数冷冻管。ＨUEＳ－9为0.5ｍl，复苏时时间要比其系短一些。建议每管复苏到一个35mｍ培养皿中,或6孔皿的一个孔。
Ｄaｙ４-7
根据我们的经验,复苏后最早4天最晚10天（此时ＭEＦ太老了）需要传代。传代前的天数通常依赖很多因素,包括被复苏细胞的状态,平均起来，培养接近长满大约需要7天时间，对于一个给定的细胞系如何操作，请和我们联系。
如果复苏的细胞不能重现附录中描述的景象也不要气馁，我们已经注意到在复苏时有些不一致,一些细胞系比另外一些更稳定，出现不协调、扁平的细胞团，也是不少见的,甚至在极个别情况下全出现单层细胞,此时不要放弃,HVES细胞系的细胞形态在传一到两代后得到改善是很常见的。
2．培养液和材料
所有的培养液和试剂在使用前都要用０.2µm的滤膜过滤；培养瓶和TC材料在拿进培养间之前都应该用７0%异丙醇消毒。
3．细胞处理
为了便于操作,最好不要同时处理两个以上的标本。操作时，在室温和低CＯ2的时间不要太长。所有的细胞离心:室温，500-600g,5分钟。
干细胞之家
培养液准备：
MＥF和hEＳCｓ培养液在无菌条件下进行,完成后用０.2µm的滤膜过滤。当准备hESCs培养液时,保持一致性很重要。如有可能，尽量使用相同的试剂。使用满足于附录提供的血清替代品尤为重要。
培养条件:温度：37±0.5℃
CＯ２浓度：5.１±０.６％
相对湿度：８５－1０0％
主要技术:
1．细胞培养：
当进行hEＳＣ培养时,总的培养原则必需遵守,所有的操作都应该在相应的细胞培养间和超净台内按无菌技术进行。此外，通过安装空气处理和过滤设备减少空气颗粒制造一个相对洁净的空间。当接触和细胞有关的一切试剂和材料时,应该带手套(包括开冰箱门)。工作间在使用前后要用70％的异丙醇彻底消毒。
Dａｙ１
hES细胞复苏24h后,4倍光镜观察，能看到有一些碎屑,这是正常的,
干细胞之家c:\iknow\docshare\data\cur_work\＂
不用担心,这些碎屑是死细胞的混合物。在这个早期阶段,不要指望看到一些细胞团,如果死细胞层完全覆盖孔皿，建议更换部分培养液。
Dａy2-４
通常复苏48h后第一次全部换液，建议2ml／well，复苏后第二天细胞团可以看到，以后每天更换培养液。
复苏
1.接种hEＳ细胞:
复苏前应确保MＥF已经被准备好且状态良好,不要应用MEF状态不好或超过3天的皿，建议事先标记好所有的离心管和培养皿。
干细胞之家
预温hES培养液到３7℃，一个细胞系吸取10mlhＥＳ培养液到无菌的和标好的１5ｍl离心管中，从液氮中取出hEＳ冷冻管,立即将冷冻管的下半部浸入37℃水浴中,大约45~60秒，细胞80%融化时从水浴中取出，立即将冷冻管拿到超净台中，70%酒精消毒,轻轻移入10ml预温培养基中。建议用1ml预温培养液洗冷冻管后一并移入１5ml离心管500~６00g，5mｉn，离心时，从培养箱中取出MEFＳ，在超净台里吸出培养液(需要几个孔吸几个孔),立即加入1mlｈＥS培养液，小心不要碰到ＭＥFS,将其放置在超净台内,离心完后,小心吸出培养液，不要碰触离下来的细胞团(如有必要不要吸出所有的培养液。用1ｍl培养液轻轻重悬细胞团,将1mｌｈES溶液轻轻滴加到预先加入1mｌhＥＳ培养液的MEF上，和MEＦ一样尽管使其均匀分布在培养皿上,轻轻移入培养箱，37℃过夜,让hＥS接种到ＭEFS上。
人胚胎干细胞培养手册
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干细胞之家c:\iknow\docshare\data\cur_work\＂
操作指南
运输和保存:人胚胎干细胞（hESＣs）和PMEFi被装在含90%ＦＣS和10％二甲基亚砜的冻存管中，ｈEＳCs4×10５/管，可接种一个3.5cm培养皿(或六孔板的一个孔）,PMEFi4×10６／管,可接种一块六孔板。冻存管用干冰运输,收到后,hESＣs投入液氮，PMＥFi放入-80℃保存。
生长因子应该最后添加,需要强调的是bFGF进行重悬时需要蛋白载体，在少量培养液中不要试图重悬它。
MEＦ培养液：
hESＣs培养液:
冷冻培养液:9０%FCS+１０％二甲基亚砜, 0．２µm的滤膜过滤,4℃保存。
明胶准备:
用超纯水配制0.1％明胶溶液,加热确保明胶完全溶解，使用前高压或０.2µm的滤膜过滤。
明胶包被:
干细胞之家
接种细胞前,用0.1%明胶溶液包被培养皿，37℃至少3０分钟,分别用1．５或4mｌ包被３5mｍ或10ｃm培养皿。在接种MEF前吸除明胶溶液。
准备ＭEF：
可靠的MEF对hＥSＣs的生长和存活是非常重要的。每管含4×106PMEFｉ，可接种一块六孔板。在复苏／传代hESCs前一到二天接种PMEFi,MEFs超过12-１4天不能再用作滋养层。