医学研究中的论证方法
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0 1 2 3 4 5 6
*
20 m
*
Control Nonmetastatic Metastatic
源自文库
Proliferating HEV endothelial cells in human LN (%)
0 Control Nonmetastatic Metastatic 1 2 3 4 5 6 7 8
归巢受体，如 L-selectin
MECA79
MECA-79 staining
Normal popliteal LN
Sentinel popliteal LN
40 m
40 m
MECA-79 staining
Control Non-metastatic
100 m
100 m
Metastatic
*
20 m
*/**
MECA-79
Remodeled HEV
100 µm
20 µm
20 µm
20 µm
300 µm
0.4 0.35
Tumor weight (g)
0.3 0.25 0.2
0.15
0.1 0.05 0 0 3000 6000 9000 12000 15000
P = 0.027
Lymph sinus area (µm2)
证伪科学假说
E. 结论
如何提出科学假说
一、依据高通量筛选结果，确定新的研究分子 二、根据本课题组 / 本科室既往的系列研究， 提出新的科学假说 三、根据他人的研究发现，提出新的科学假说
SPINK6 SERGLYICN VTN AKR1C1 SPINK5L3 MFAP5 PSG4 DAB2 CCL26 RNF182 CGA KRT19 SPINK4 MYPN FABP4 KANK4 WNT5A SLC12A3 EPDR1 PPP2R2B DIO2 FYN HEG1 C21orf63 MAP2K6 FXYD3 KCNS3 COL17A1 TXNIP LY6D SCEL DSG3 CSTA TSPAN1 ESRP1 RHBDL1 TMC4 PPP1R14C SERPINB4 SEPP1 ANKRD22 NDUFA4L2 ABP1 CLCA2 ST6GALNAC1 S100A14 IRF6 KRT6A CALB1 LOC642587
Metastatic tumor tissue
LN tissue distant from tumor tissue
Metastatic axillary LN; breast cancer patient
50 m
提出新的科学假说：
原发肿瘤在发生转移之前，可以改造淋巴结 的血管系统，之后可以被转移灶所利用。
提出新的科学假说：
肿瘤的血管系统存在异质性，不同的血管由 不同的细胞构成，且与肿瘤的预后关系也不 相同。
挑战旧有的理论：
肿瘤里的血管系统由均一的正常血管内皮细 胞构成。
Undifferentiated vessel MVD
180
130
COR = - 0.54 P < 0.0001
80
30
-20
0
Differential expression value: ≤ -5, -2.5, 0, 2.5, ≥ 5
Serglycin protein structure
1-27 aa
28-76 aa
N terminal
77-158 aa
Glycosylation domain
Glycosaminoglycan attachment
2004; 11:948–53.
血管密度与预后无关
Urology J Urol 1995; 46:27–30. 2005; 174:1208–12.
CD31
CD34
Differentiated vessels: Undifferentiated vessels:
CD34 + CD31 + ; CD34 -
Relative serglycin mRNA level
1000000 100000
10000
1000
100 ````````````````````````````````` 10 1
In vitro
In vivo
300 kDa 130 kDa
Serglycin in CM Serglycin in WCL β-actin
Spearman's Rho = -0.318
P value < 0.0001
There is an inverse correlation between lumen size and wall thickness for those vessels that have lumens.
Proliferating HEV endothelial cells in mouse LN (%)
1971 年在 New England Journal of Medicine 发表第一篇文章，提出一个新的假说：
肿瘤的生长依赖新生的血管系统
1. 证实了无血管的实体瘤不会超过 1-2 mm，且长 期处于休眠状态；只有形成了肿瘤内部的新生血 管系统之后，实体瘤才会迅速生长。
Judah Folkman
挑战 Judah Folkman 的理论：
肿瘤转移灶里的血管系统是完全由肿瘤诱导 而新生的。
Tumor-reactive lymphadenopathy
Sentinel Contralateral
1 mm
1 mm
Sentinel
Contralateral
250 m 250 m
High endothelial venule (HEV) is lined by cuboid or high endothelial cells. HEVs are only found in secondary lymphoid organs, except the spleen. HEVs are the main sites of lymphocyte entry from the blood.
Metastatic
T
100 m
100 m
Mean HEV wall thickness
Control nodes
11.03 m
8.07 m (P < 0.00001) 8.04 m (P < 0.00001)
Non-metastatic nodes
Metastatic nodes
Correlation between HEV lumen size and wall thickness
Non-hypothesis driven study 非假说驱动的研究
Hypothesis-free high throughput studies
Non-hypothesis driven science
1，有一位研究 protein X 的人提出一个假说： protein X 会与 p53 相互作用，并通过实验证实了。 2 ， 有 一 位 研 究 p53 的 人 提 出 一 个 假 说 ： p53 会 与 protein X 相互作用，并通过实验证实了。 3，有一位研究 protein X 的人想知道其功能为何，进行了 筛查，最后发现与 p53 相互作用。 4，有一位研究 p53 的人想知道与 p53 相互作用的蛋白质 都有哪些，然后进行了一次筛查，发现了 protein X 。
血管密度越高预后越差
Int J Urol Urology BJU Int 1995; 2:156–60. 1998; 51:693–6. 2004; 93:291–6.
Clin Cancer Res 2001; 7:533–7. J Pathol 2002; 196:186–93.
Int J Urol
SPINK6 SERGLYCIN UGT1A10 UGT1A7 UGT1A5 UGT1A9 UGT1A4 UGT1A1 UGT1A3 UGT1A8 UGT1A6 AKR1C1 SPINK5L3 ID2 FAM102B WNT5A DAB2 NNMT ABCG2 CGA RNF182 VTN C21orf63 AKR1C3 SH3BP5 IRF6 S100A14 ABCA12 DSC3 SLITRK5 BNC1 SERPINB2 KLK10 KCNS3 SCEL KRT17 KCTD12 LAMC2 ST6GALNAC1 LOC642587 DSG3 SHISA2 KRT5 SYK S100A2 KRT14 KRT6A S100A9 S100A8 CALB1
50
100
150
200
250
Differentiated vessel MVD
1.0
Survival probability
low undifferentiated MVD + high differentiated MVD
0.8
high undifferentiated MVD + high differentiated MVD
Miyasaka M, Tanaka T. Nat Rev Immunol. 2004; 4(5): 360-370.
Miyasaka M, Tanaka T. Nat Rev Immunol. 2004; 4(5): 360-370.
Peripheral-node addressin (PNAD) 淋巴结地址素
Signal peptide
For secretion
Chondroitin 4-sulfate Chondroitin 6-sulfate Chondroitin sulfate E Chondroitin sulfate B Heparin / heparan sulfate
Propose a hypothesis: Serglycin promotes migration, invasion, and metastasis of NPC cells
2. 鉴定出由肿瘤细胞及肿瘤周边的正常细胞所产生 的上调血管生成的因子，如 b-FGF, VEGF。 3. 找到了血管生成抑制剂，并证实了抑制血管生成 可以抑制实体瘤的生长 （TNP470, angiostatin, endostatin）。 4. 肿瘤内的血管密度越高预后越差。 5. 抑制肿瘤血管生成也可以减少肿瘤的远处转 移。
high undifferentiated MVD + low differentiated MVD
0.6
0.4
0.2
low undifferentiated MVD + low differentiated MVD
0.0 0 2 4 6 8 10 12
Survival time (years)
Hypothesis-driven study 假说驱动的研究
Testing a hypothesis
Prove
Disprove
一个合格的开题报告应具备的内容：
A. 提出科学假说的背景 B. 科学假说的内容 / 研究目的 C. 验证科学假说的研究路径 / 研究方法 D. 初步的实验结果
E. 拟开展的实验设计
一个合格的预答辩应具备的内容：
A. 提出科学假说的背景 B. 科学假说的内容 / 研究目的 C. 验证科学假说的研究路径 / 研究方法 D. 各项实验结果：证实、部分证实、或
Pandya NM, et al. Vascular Pharmacology. 2006; 44: 265–274
我们碰到的第一个问题
Metastatic axillary LN; breast cancer patient
IHC staining for Factor VIII
50 m
50 m
原先提出的科学假说：
原发肿瘤在发生转移之前，可以改造淋巴结 的血管系统，之后可以被转移灶所利用。
修正后的科学假说：
原发肿瘤在发生转移之前，可以改造前哨淋 巴结的血管及淋巴管系统，之后可以被转移 灶所利用。
The Lancet 1889, 133: 571-573
The “Seed-and-Soil” Theory
Stephen Paget
1855-1926
旧的科学理论不能解释新发现的自然现象时，人 们不得不追求新的科学理论。而新的科学理论往 往是通过对一系列科学假说的论证而发展成熟。
提出科学假说的人往往具备这些重要素 质：
独立思想
批判精神 挑战权威的勇气
我们碰到的第二个问题
血管密度越高预后越好
Oncology Hum Pathol 1996; 53:127–32. 2001; 32:1209–15.
*
20 m
*
Control Nonmetastatic Metastatic
源自文库
Proliferating HEV endothelial cells in human LN (%)
0 Control Nonmetastatic Metastatic 1 2 3 4 5 6 7 8
归巢受体，如 L-selectin
MECA79
MECA-79 staining
Normal popliteal LN
Sentinel popliteal LN
40 m
40 m
MECA-79 staining
Control Non-metastatic
100 m
100 m
Metastatic
*
20 m
*/**
MECA-79
Remodeled HEV
100 µm
20 µm
20 µm
20 µm
300 µm
0.4 0.35
Tumor weight (g)
0.3 0.25 0.2
0.15
0.1 0.05 0 0 3000 6000 9000 12000 15000
P = 0.027
Lymph sinus area (µm2)
证伪科学假说
E. 结论
如何提出科学假说
一、依据高通量筛选结果，确定新的研究分子 二、根据本课题组 / 本科室既往的系列研究， 提出新的科学假说 三、根据他人的研究发现，提出新的科学假说
SPINK6 SERGLYICN VTN AKR1C1 SPINK5L3 MFAP5 PSG4 DAB2 CCL26 RNF182 CGA KRT19 SPINK4 MYPN FABP4 KANK4 WNT5A SLC12A3 EPDR1 PPP2R2B DIO2 FYN HEG1 C21orf63 MAP2K6 FXYD3 KCNS3 COL17A1 TXNIP LY6D SCEL DSG3 CSTA TSPAN1 ESRP1 RHBDL1 TMC4 PPP1R14C SERPINB4 SEPP1 ANKRD22 NDUFA4L2 ABP1 CLCA2 ST6GALNAC1 S100A14 IRF6 KRT6A CALB1 LOC642587
Metastatic tumor tissue
LN tissue distant from tumor tissue
Metastatic axillary LN; breast cancer patient
50 m
提出新的科学假说：
原发肿瘤在发生转移之前，可以改造淋巴结 的血管系统，之后可以被转移灶所利用。
提出新的科学假说：
肿瘤的血管系统存在异质性，不同的血管由 不同的细胞构成，且与肿瘤的预后关系也不 相同。
挑战旧有的理论：
肿瘤里的血管系统由均一的正常血管内皮细 胞构成。
Undifferentiated vessel MVD
180
130
COR = - 0.54 P < 0.0001
80
30
-20
0
Differential expression value: ≤ -5, -2.5, 0, 2.5, ≥ 5
Serglycin protein structure
1-27 aa
28-76 aa
N terminal
77-158 aa
Glycosylation domain
Glycosaminoglycan attachment
2004; 11:948–53.
血管密度与预后无关
Urology J Urol 1995; 46:27–30. 2005; 174:1208–12.
CD31
CD34
Differentiated vessels: Undifferentiated vessels:
CD34 + CD31 + ; CD34 -
Relative serglycin mRNA level
1000000 100000
10000
1000
100 ````````````````````````````````` 10 1
In vitro
In vivo
300 kDa 130 kDa
Serglycin in CM Serglycin in WCL β-actin
Spearman's Rho = -0.318
P value < 0.0001
There is an inverse correlation between lumen size and wall thickness for those vessels that have lumens.
Proliferating HEV endothelial cells in mouse LN (%)
1971 年在 New England Journal of Medicine 发表第一篇文章，提出一个新的假说：
肿瘤的生长依赖新生的血管系统
1. 证实了无血管的实体瘤不会超过 1-2 mm，且长 期处于休眠状态；只有形成了肿瘤内部的新生血 管系统之后，实体瘤才会迅速生长。
Judah Folkman
挑战 Judah Folkman 的理论：
肿瘤转移灶里的血管系统是完全由肿瘤诱导 而新生的。
Tumor-reactive lymphadenopathy
Sentinel Contralateral
1 mm
1 mm
Sentinel
Contralateral
250 m 250 m
High endothelial venule (HEV) is lined by cuboid or high endothelial cells. HEVs are only found in secondary lymphoid organs, except the spleen. HEVs are the main sites of lymphocyte entry from the blood.
Metastatic
T
100 m
100 m
Mean HEV wall thickness
Control nodes
11.03 m
8.07 m (P < 0.00001) 8.04 m (P < 0.00001)
Non-metastatic nodes
Metastatic nodes
Correlation between HEV lumen size and wall thickness
Non-hypothesis driven study 非假说驱动的研究
Hypothesis-free high throughput studies
Non-hypothesis driven science
1，有一位研究 protein X 的人提出一个假说： protein X 会与 p53 相互作用，并通过实验证实了。 2 ， 有 一 位 研 究 p53 的 人 提 出 一 个 假 说 ： p53 会 与 protein X 相互作用，并通过实验证实了。 3，有一位研究 protein X 的人想知道其功能为何，进行了 筛查，最后发现与 p53 相互作用。 4，有一位研究 p53 的人想知道与 p53 相互作用的蛋白质 都有哪些，然后进行了一次筛查，发现了 protein X 。
血管密度越高预后越差
Int J Urol Urology BJU Int 1995; 2:156–60. 1998; 51:693–6. 2004; 93:291–6.
Clin Cancer Res 2001; 7:533–7. J Pathol 2002; 196:186–93.
Int J Urol
SPINK6 SERGLYCIN UGT1A10 UGT1A7 UGT1A5 UGT1A9 UGT1A4 UGT1A1 UGT1A3 UGT1A8 UGT1A6 AKR1C1 SPINK5L3 ID2 FAM102B WNT5A DAB2 NNMT ABCG2 CGA RNF182 VTN C21orf63 AKR1C3 SH3BP5 IRF6 S100A14 ABCA12 DSC3 SLITRK5 BNC1 SERPINB2 KLK10 KCNS3 SCEL KRT17 KCTD12 LAMC2 ST6GALNAC1 LOC642587 DSG3 SHISA2 KRT5 SYK S100A2 KRT14 KRT6A S100A9 S100A8 CALB1
50
100
150
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Differentiated vessel MVD
1.0
Survival probability
low undifferentiated MVD + high differentiated MVD
0.8
high undifferentiated MVD + high differentiated MVD
Miyasaka M, Tanaka T. Nat Rev Immunol. 2004; 4(5): 360-370.
Miyasaka M, Tanaka T. Nat Rev Immunol. 2004; 4(5): 360-370.
Peripheral-node addressin (PNAD) 淋巴结地址素
Signal peptide
For secretion
Chondroitin 4-sulfate Chondroitin 6-sulfate Chondroitin sulfate E Chondroitin sulfate B Heparin / heparan sulfate
Propose a hypothesis: Serglycin promotes migration, invasion, and metastasis of NPC cells
2. 鉴定出由肿瘤细胞及肿瘤周边的正常细胞所产生 的上调血管生成的因子，如 b-FGF, VEGF。 3. 找到了血管生成抑制剂，并证实了抑制血管生成 可以抑制实体瘤的生长 （TNP470, angiostatin, endostatin）。 4. 肿瘤内的血管密度越高预后越差。 5. 抑制肿瘤血管生成也可以减少肿瘤的远处转 移。
high undifferentiated MVD + low differentiated MVD
0.6
0.4
0.2
low undifferentiated MVD + low differentiated MVD
0.0 0 2 4 6 8 10 12
Survival time (years)
Hypothesis-driven study 假说驱动的研究
Testing a hypothesis
Prove
Disprove
一个合格的开题报告应具备的内容：
A. 提出科学假说的背景 B. 科学假说的内容 / 研究目的 C. 验证科学假说的研究路径 / 研究方法 D. 初步的实验结果
E. 拟开展的实验设计
一个合格的预答辩应具备的内容：
A. 提出科学假说的背景 B. 科学假说的内容 / 研究目的 C. 验证科学假说的研究路径 / 研究方法 D. 各项实验结果：证实、部分证实、或
Pandya NM, et al. Vascular Pharmacology. 2006; 44: 265–274
我们碰到的第一个问题
Metastatic axillary LN; breast cancer patient
IHC staining for Factor VIII
50 m
50 m
原先提出的科学假说：
原发肿瘤在发生转移之前，可以改造淋巴结 的血管系统，之后可以被转移灶所利用。
修正后的科学假说：
原发肿瘤在发生转移之前，可以改造前哨淋 巴结的血管及淋巴管系统，之后可以被转移 灶所利用。
The Lancet 1889, 133: 571-573
The “Seed-and-Soil” Theory
Stephen Paget
1855-1926
旧的科学理论不能解释新发现的自然现象时，人 们不得不追求新的科学理论。而新的科学理论往 往是通过对一系列科学假说的论证而发展成熟。
提出科学假说的人往往具备这些重要素 质：
独立思想
批判精神 挑战权威的勇气
我们碰到的第二个问题
血管密度越高预后越好
Oncology Hum Pathol 1996; 53:127–32. 2001; 32:1209–15.