流式细胞术临床检测项目操作流程
BDFACSCalibur流式细胞术标准操作规程
BD FACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序目的：规范BDFACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序，正确使用设备，保证实验顺利进行、操作人员人身安全和设备安全。
适用范围：本规程适用于BD FACSCalibur流式细胞仪的使用操作。
责任者：操作人员：负责按照本规程操作仪器设备，对仪器进行日常维护，并作使用记录。
保管人员：负责监管仪器操作是否符合规程，并对仪器进行定期维护、保养。
科室负责人：负责对仪器设备的综合管理。
内容：1.每日开机程序1.1在气压阀减压的状态下检查鞘液桶，确认：1.1.1鞘液充满状态，约3L1.1.2盖紧盖子1.1.3安上金属挡板1.1.4管路畅通，无扭曲1.2.检查废液桶，确认：1.2.1废液桶充满400ml漂白剂1.2.2管路畅通，无扭曲1.3打开流式细胞仪。
1.4打开电脑。
1.5气压阀置于加压位置，并排除管路中气泡。
1.6做Prime。
1.7等待机器预热5~10分钟后可开始试验。
2.每日关机程序2.1用3mlFACSCIean洗液加入样品管中上样，将样品支撑架置于旁位，以外套管吸入1ml。
2.2将样品支撑架置于中位，以HI RUN运行10分钟，使内管吸入约1ml。
2.3将样品管换成蒸馏水重复1-2步。
2.4放置盛有1ml蒸馏水的试管于样品支撑架上。
2.5选择Standby模式10分钟，将激光冷却后可关掉主机。
2.6退出所有应用软件，关闭电脑。
2.7将流式细胞仪的压力阀置于减压状态。
3.每月维护程序3.1将FACSClean洗液1~2L装入鞘液桶。
3.2旁路鞘液过滤器（过滤器上的快速接口从SANLINEFILTER端断开，将鞘液白色管路液路取下联到SANLINE FILTER 端口），以防伤害。
3.3将盛有3ml FACSClean 洗液的试管置于样品支架上，以HI RUN 30 分钟。
3.4将鞘液和样品换成蒸馏水重复步骤3，以HI RUN 60 分钟。
3.5将鞘液桶装满鞘液，恢复过滤器。
流式细胞术的应用-周期检测
细胞周期的检测目录一、背景知识二、实验设计原则三、实验操作步骤四、实验结果分析一、背景知识1、细胞周期：G0/G1二倍体S二倍体---四倍体G2/M四倍体细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程。
共分为静止期(GO期)、DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)与分裂期(M期)。
在细胞周期的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。
通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以检测细胞周期。
2、细胞周期常用的核酸染料1.碘化丙啶(Propidium Iodide, PI) 是一种可以嵌合到双链DNA和RNA 的碱基对中，并与之结合的荧光染料，无碱基特异性。
其与双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。
细胞内的DNA被PI染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量的测定。
PI不能穿透细胞膜而被排斥在活细胞外，但是可以穿过破损的细胞膜而对核染色。
可用于区分活、死细胞。
利用这一特性，通常与Calcein-AM、Hoechst 33258或Hoechst 33342等活细胞荧光探针一起使用，同时对活细胞和死细胞染色和鉴定，用于细胞凋亡相关的研究。
也可以用作多重荧光染色的复染剂，兼容于各种细胞标记技术，包括直接或者间接的荧光抗体检测，mRNA原位杂交，细胞结构特异性的荧光探针检测法以及组织染色。
PI的单独染色也可以进行细胞周期的检测。
PI的摩尔吸光系数相对比较低，但是其具有足够大的斯托克斯频移来同时检测核酸DNA和荧光标记抗体，只需要使恰当的滤片。
PI适用于荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪以及荧光计分析。
2.7-氨基放线菌素(7-amino-actinomycinD，7-AAD) 是一种核酸染料。
它不能通过正常细胞膜。
7-AAD同PI有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品。
流式细胞仪实验流程
流式细胞仪实验流程英文回答：Flow cytometry is a powerful technique used in biological research to analyze and sort cells based ontheir physical and chemical properties. It allows researchers to study various aspects of cells, such as cell size, shape, granularity, and protein expression. Here, I will explain the general workflow of a flow cytometry experiment.1. Sample preparation: The first step is to prepare the cell sample for analysis. This involves isolating the cells of interest from tissues or cultures and ensuring their viability. The cells are then washed and resuspended in a buffer solution to maintain their physiological conditions.2. Instrument setup: Once the sample is ready, the flow cytometer needs to be properly set up. This includes calibrating the instrument using calibration beads toensure accurate measurements. The laser and detector settings are adjusted to detect the specific fluorochromes used for labeling the cells.3. Cell labeling: To analyze specific cell populations, cells are often labeled with fluorescent markers. These markers can be antibodies that bind to specific cell surface proteins or dyes that stain cellular components. The choice of markers depends on the research question and the cell types being studied.4. Data acquisition: The labeled cells are introduced into the flow cytometer, where they pass through a narrow flow cell one at a time. As the cells flow through the laser beam, the fluorochromes emit light signals that are detected by the instrument. The emitted signals are converted into electronic signals and recorded as data.5. Data analysis: Once the data is acquired, it needs to be analyzed to extract meaningful information. Flow cytometry software is used to analyze the data and generate graphical representations. Various parameters can bemeasured, such as cell population frequencies, cell cycle distribution, and protein expression levels.6. Cell sorting (optional): In some cases, flow cytometry is used for cell sorting, where specific cell populations are physically separated based on their properties. This is achieved by applying an electric charge to the cells as they pass through the flow cell. The charged cells are then deflected into different collection tubes, allowing researchers to isolate and study specific cell populations.Overall, flow cytometry is a versatile technique that provides valuable insights into cellular characteristics and functions. It is widely used in immunology, cancer research, stem cell biology, and many other fields.中文回答：流式细胞仪是一种在生物研究中广泛应用的技术，可以根据细胞的物理和化学特性对其进行分析和分选。
流式细胞术操作规程
流式细胞术操作规程
《流式细胞术操作规程》
流式细胞术是一种用于研究细胞表型和功能的重要技术。
在进行流式细胞术时，操作规程的严谨性和标准化是非常重要的。
以下是流式细胞术操作规程的一般步骤：
1. 样品准备：首先，需要准备好待测的细胞样品。
这包括细胞的培养和收集，以及必要的处理和染色。
2. 仪器准备：在进行流式细胞术之前，需要确保流式细胞术仪器的正常运行。
这包括检查流式细胞仪和细胞分选仪的通电和冷却系统，以及其它相关设备的准备。
3. 校准仪器：在进行流式细胞术之前，需要对流式细胞仪进行校准，以确保其准确测量样品中细胞的特定参数。
4. 样品测量：将准备好的细胞样品加入流式细胞仪，并进行测量。
测量完毕后，需要对数据进行分析和记录。
5. 数据分析：对测量得到的数据进行分析，包括确定细胞的表型和功能，以及对其它相关参数进行分析和比较。
6. 结果解释：根据数据分析的结果，进行结果的解释和报道，并对相关实验现象进行讨论和总结。
在进行流式细胞术时，需要严格遵守操作规程，以确保实验结果的准确性和可靠性。
此外，对于一些特殊的实验操作，可能
还需要根据具体情况进行相应的调整和改进。
流式细胞术的操作规程是一个很重要的研究工具，它可以帮助研究人员进行高效、准确的实验，从而为科学研究和医学诊断提供更为可靠的数据和方法。
流式细胞术活细胞实验步骤
流式细胞术活细胞实验步骤A. 溶液与试剂注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
011X 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：配制 1 L 的 1X PBS：添加 100 ml 10X PBS至 900 ml 水，然后将其混合。
02抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液，或在100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA)来制备 0.5% BSA PBS 缓冲液。
4°C 保存。
03推荐的二抗：要检测未偶联的抗体，请选择与一抗（例如兔）的宿主物种匹配的二抗。
注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活性染料、DNA 染料等）时，请参考所添加的染料产品页，了解建议的实验步骤。
B. 免疫染色注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。
注：如果使用全血，则需在免疫染色之前裂解红细胞并通过离心分离来洗涤。
注：为防止人 Fc 受体与兔 IgG 或小鼠 Fc 受体与兔或小鼠 IgG 结合，在免疫染色前用 Fc 块预孵育活细胞。
注：理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。
一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。
01将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。
（通常，每次检测用5x10^5至 1x10^6 个细胞）。
02通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
03在100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
04在冰上孵育 30 分钟至 1 小时。
避光。
05在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。
弃去上清液。
重复。
如果使用直接偶联抗体，则跳到步骤 9。
06在100 µl 稀释的荧光物质偶联的二抗（按建议稀释度用抗体稀释缓冲液制备）中重悬细胞。
07在冰上孵育 30 分钟。
避光。
08用抗体稀释缓冲液进行离心洗涤。
弃去上清液。
重复。
09在 200-500 μl 抗体稀释缓冲液中重悬细胞后用流式细胞分析仪进行分析。
流式细胞操作流程
流式细胞操作流程
流式细胞术是一种用于分析和分类细胞的生物学技术。
以下是典型的流式细胞操作流程：
1.细胞样本准备：
•收集要分析的细胞样本，可以是细胞悬液、组织细胞悬液或血液等。
•对样本进行必要的预处理，如裂解红细胞，去除细胞碎片等。
2.标记细胞：
•使用荧光标记物（荧光染料、抗体等）标记细胞中的特定分子，以便流式仪器能够检测到这些标记。
•标记的目标可以是表面抗原、细胞器、DNA或RNA等。
3.样本染色：
•添加染色剂（荧光标记物）到细胞样本中，使其能够在流式仪器中发光。
•染色通常通过孵育样本和染色剂混合物来实现。
4.细胞固定（可选）：
•如果需要保持细胞在染色后的状态，可以进行细胞固定步骤。
5.样本混合：
•将经过标记和染色的细胞混合均匀，以确保获得代表性的样本。
6.样本注射到流式细胞仪：
•将样本通过流式细胞仪的进样口注入，使其形成单个细胞的流动流。
7.激光激发和信号检测：
•使用激光激发样本中的荧光标记物。
•流式细胞仪会检测细胞产生的荧光信号，并记录下来。
8.数据分析：
•通过计算机软件对收集到的数据进行分析。
•分析可以包括对不同细胞亚群的鉴定、数量统计、染色物的表达水平等。
9.结果呈现：
•将分析结果呈现为图表、图像或表格，以便更好地理解和解释实验结果。
流式细胞术可以用于许多研究领域，如免疫学、细胞生物学、肿瘤学等，以研究和识别不同细胞类型、表达分子的水平等。
流式细胞术操作规程
流式细胞术操作规程流式细胞术是一种常用的细胞分析技术，它可以用来检测和分析细胞表面标记物、细胞数量、细胞分布等信息。
以下是一份流式细胞术操作规程，详细介绍了该技术的操作步骤和注意事项。
一、实验前准备1. 准备所需的实验材料，包括流式细胞仪、标记抗体、孵育培养基、样本组织、显微镜片等。
2. 检查流式细胞仪的功能是否正常，确认仪器能够正常运行。
3. 清洁实验台面，确保操作环境干净整洁。
4. 准备所需的试剂和溶液，如PBS缓冲液、抗体染色溶液等。
二、样本处理1. 准备样本组织，将其转移到离心管中，并添加适量的孵育培养基使其完全浸泡。
2. 使用离心机将样本离心，去除上清液。
3. 重悬样本，将其转移到离心管中，并加入足够的PBS缓冲液进行洗涤。
4. 重复洗涤过程，直到样本完全洗净。
三、标记抗体染色1. 取出经过洗涤的样本，将其转移到离心管中，并加入足够的标记抗体溶液。
2. 在黑暗条件下孵育样本，使其与标记抗体充分结合。
3. 静置反应15-30分钟，确保充分染色。
4. 在光线和温度适宜的条件下冰冻样本，避免抗体的结合。
5. 根据实验需求，可以选择单标记或多标记抗体。
四、样本准备1. 取出经过标记抗体染色的样本，将其转移到离心管中，并加入足够的PBS缓冲液进行洗涤。
2. 将样本离心并去除上清液。
3. 重悬样本，并根据实验需要加入适量的PBS缓冲液进行稀释。
4. 检查样本的细胞数目和活性是否符合实验要求，如有必要，可以使用显微镜进行观察和计数。
五、流式分析1. 打开流式细胞仪，并确认仪器的设置和参数是否符合实验要求。
2. 调整仪器的流速和灵敏度，使其适应样本的特性。
3. 将样本转移至流式细胞仪的样本管中。
4. 开始流式细胞分析，记录并保存实验数据。
5. 根据实验需要，可以进行不同的数据分析和处理，包括细胞分布、细胞数量、表面标记物的表达等。
六、实验后处理1. 关闭仪器，清洁工作台和操作区域。
2. 处理和储存实验数据，可以使用相应的图像科学软件进行数据处理和结果分析。
临床检验中心流式细胞仪实验室标准操作程序概要
临床检验中心流式细胞仪实验室标准操作程序概要简介本标准操作程序适用于临床检验中心流式细胞仪实验室，主要目的是规范操作流程，确保实验结果准确可靠。
实验前准备- 实验人员应先进行必要的文献调研并了解免疫荧光染色的原理和基本方法。
- 接受过正规培训的人员方可进行实验操作。
- 实验前，必须对仪器进行全面检查，确保仪器正常工作。
实验步骤1. 细胞样本制备- 取样前应先向患者或其家属进行必要的告知，并取得其同意。
- 根据实验设计和要求，采集适当数量、质量的细胞样本，并根据实验要求进行必要的处理。
- 对细胞样本进行细胞计数、质量检测等操作。
2. 细胞染色- 根据实验要求，选取适当的细胞染色试剂。
- 按照试剂说明书和操作要求进行操作。
3. 流式细胞仪实验操作- 操作人员应事先熟悉细胞仪的基本原理和操作步骤。
- 检测前，确定细胞浓度和待测指标。
- 按照细胞仪的设置要求进行操作，包括仪器开机、样本放置、参数设置、数据采集等。
- 操作完成后，关机并对细胞仪进行必要的维护和清洁操作。
数据分析和结果处理- 根据实验设计，选择适当的统计学方法进行数据分析。
- 结合实验结果和文献调研，得出结论。
- 保存实验结果和数据记录，并按要求撰写实验报告。
实验安全注意事项- 操作过程中必须戴手套、口罩等防护用品。
- 细胞样本和染色试剂应正确处理和存储，避免产生污染和交叉感染。
- 遵守实验室安全规定，保证操作安全。
结论本标准操作程序是临床检验中心流式细胞仪实验室实验操作的指导，规范操作流程和操作安全，是实验室科研工作中的重要保障。
流式细胞仪操作步骤
流式细胞仪操作步骤一、样品准备1. 确认样品是否符合实验要求，如细胞浓度、荧光标记等。
2. 根据实验需求，选择合适的试管和细胞样品。
3. 确认样品中是否有杂质或污染物，必要时进行离心和洗涤。
4. 尽可能缩短样品处理时间，避免细胞活性受到影响。
二、样品上机1. 打开流式细胞仪，确认仪器正常工作。
2. 将样品加入到流式细胞仪的样品管中。
3. 根据实验需求，设置合适的流速和压力。
4. 开始采集数据，观察仪器工作状态，确保数据准确可靠。
三、参数设置1. 根据实验需求，选择合适的荧光标记和检测参数。
2. 根据细胞类型和特性，设置合适的门控和阈值。
3. 确认仪器校准和定标工作已完成。
4. 根据需要，设置多色分析，以便于进行细胞分群和定量分析。
四、数据采集1. 在采集数据时，观察仪器工作状态，确保数据准确可靠。
2. 根据实验需求，确定采集的数据量，确保数据具有代表性。
3. 记录采集数据的时间和条件，以便于后续数据分析。
4. 在采集数据时，注意观察细胞活性、浓度和分布情况，及时调整实验条件。
五、数据分析1. 使用专业软件对采集的数据进行处理和分析。
2. 根据实验需求，对数据进行去噪、归一化和定量分析。
3. 进行细胞分群、细胞周期和细胞凋亡等分析。
4. 对数据进行统计学分析和可视化展示。
六、结果输出1. 根据分析结果，输出相应的图表和数据表格。
2. 对结果进行解释和注释，以便于读者理解和应用。
3. 如果需要，可将结果整理成报告形式，提供给相关人员参考和使用。
七、质量控制八、实验室清理。
血液流式细胞术检测细胞因子方法
血液流式细胞术检测细胞因子方法
血液流式细胞术是一种用于分析和鉴定血液中不同类型细胞的高效技术。
在医学领域，它被广泛应用于研究和临床诊断中。
近年来，血液流式细胞术也被用于检测和分析细胞因子，这对于研究免疫反应、炎症和其他疾病过程具有重要意义。
细胞因子是一类分泌性蛋白质，它们在细胞间传递信号，调节免疫反应、细胞增殖和分化等生物学过程。
通过血液流式细胞术检测细胞因子，可以帮助科研人员和临床医生更好地理解细胞因子在疾病发生发展中的作用，为疾病的诊断和治疗提供重要信息。
血液流式细胞术检测细胞因子的方法主要包括以下几个步骤，首先，通过特定的抗体对血液样本中的细胞进行标记，这些抗体可以与目标细胞因子结合。
然后，利用流式细胞仪对标记的细胞进行检测和分析，流式细胞仪可以测量细胞的大小、形状、表面标记物和内部成分，从而确定细胞中细胞因子的含量和分布。
最后，利用专业的数据分析软件对流式细胞仪获取的数据进行处理和解读，得出细胞因子的定量和定性结果。
血液流式细胞术检测细胞因子方法具有高灵敏度、高通量和多
参数分析的优势，能够同时检测多种细胞因子，为疾病的研究和诊断提供全面的信息。
随着技术的不断发展和完善，血液流式细胞术检测细胞因子的应用范围将会更加广泛，为医学研究和临床诊断带来新的突破和进展。
流式细胞术操作步骤
流式细胞术检测脾脏CD4+、CD8+
一、准备实验：
1640、PBS缓冲液、铜网、小平皿、剪刀、镊子、离心管、红细胞裂解液、枪头、抗体、细胞计数板、杀鸡用大剪刀、1ml注射器
二、实验操作步骤：
1、取一小块雏鸡脾脏，放入装有1ml 1640的1.5ml离心管中
2、铜网+平皿中加入1ml 1640
3、将脾放入铜网中，磨脾
4、吸取磨好的脾汁放入1.5ml离心管中，离心2000r,5min
5、弃去上清，向脾汁沉淀中加入500µl红细胞裂解液，混匀作
用3min,离心2000r 5min
6、若离心后得到沉淀不变白可重复上述操作
7、裂解完成，离心完成，弃去上清，向试管中加入1ml PBS混匀
8、向1.5ml离心管中加入490µLPBS，再加入10µL步骤7脾汁，
计数
9、取106个细胞加PBS定容至100µL，此处用1.5ml离心管
10、向细胞悬液内加入抗体，每只鸡两管细胞悬液，每管10µL
11、4℃避光保存45min
12、向细胞悬液中加入1mlPBS 2000r 5min
13、弃上清，向管中加入200µL PBS 上机。
流式细胞
写在课前的话流式细胞术融合了流体动力学、激光技术、电子工程、计算机技术和单克隆抗体染色技术等多学科的知识，成为一个专门的领域。
它不仅应用于细胞生物学、植物学、分子生物学、生物化学、微生物学等理论科学的研究，以及血液学、免疫学、病理学、肿瘤学、遗传学等临床医学的疾病诊断和治疗，而且可以应用于农林畜牧养殖业及环境、食品、药品等检测等，因此学习其原理极其重要。
一、流式细胞术概念(一) 概念流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):是上世纪70年代的一项高新技术，是利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。
其研究对象为生物颗粒，包括各种动物植物细胞、微生物及人工合成微球等。
研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并同时进行定量的一项技术。
目前这项技术已广泛应用于生物学和医学的各个领域，已成为细胞学分析领域中不可替代的重要工具。
(二) 流式细胞术的特点1. 快极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（Flow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。
2. 准可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。
3. 精通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。
（三）流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM ）操作流程流式细胞术的操作流程简单概括为：培养细胞、新鲜组织、石蜡包埋组织、骨髓、外周血、脱落细胞等不同类型的样品。
首先制备成单细胞悬液后，再经过荧光染色就可以上机进行检测。
如果需要分选，可以通过细胞分选把感兴趣的细胞分选出来进行进一步培养或者进行其他生物学行为的研究。
流式细胞术在成熟淋巴细胞肿瘤诊断中的应用
01 引言
03 参考内容
目录
02 实验方法
引言
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在医学领域中广泛应用的技术， 具有高效、快速、敏感等优点。它通过将细胞悬浮在流水中，并利用特定的抗体 对细胞进行标记，从而对细胞进行种类、功能等方面的分析和检测。在淋巴细胞 肿瘤诊断中，流式细胞术能够通过对成熟淋巴细胞的表面标志物进行检测，为临 床提供更准确、更快速的诊断结果。
参考内容三
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速检测细胞特性的 技术。它已经成为免疫学研究中的重要工具，并被广泛应用于免疫细胞的分型、 功能和活性测量。
1、细胞分型：流式细胞术可以用来对免疫细胞进行精细的分型。通过使用 不同的抗体标记，可以识别和区分各种类型的淋巴细胞，如T细胞、B细胞、NK细 胞等。同时，对于细胞亚群的识别和计数，流式细胞术也具有高灵敏度和高精度 性。
4、疾病诊断：流式细胞术在免疫学中的应用也扩展到了临床诊断。例如， 流式细胞术可以用来检测自身免疫疾病、癌症和感染等疾病中的异常免疫反应。
5、疫苗开发：流式细胞术可以帮助科学家们研究免疫反应的机制，从而为 疫苗开发提供重要的信息。例如，通过流式细胞术，科学家们可以跟踪疫苗接种 后免疫细胞的反应，以便优化疫苗设计和接种方案。
1、免疫分型：流式细胞术能够通过对细胞表面抗原的检测，对淋巴细胞、 白血病、骨髓瘤等免疫相关疾病进行分型和诊断。例如，通过检测T细胞亚群的 分布和功能，可以对自身免疫性疾病、感染性疾病等进行诊断和鉴别诊断。
2、感染诊断：流式细胞术能够快速准确地检测病毒、细菌和其他微生物等 感染引起的特异性免疫反应。例如，通过检测抗原特异性抗体水平，可以快速诊 断流感、肺炎等感染性疾病。
《流式细胞术操作规程》
《流式细胞术操作规程》一、操作准备1.准备所需材料和试剂：包括流式细胞仪、标记抗体、细胞悬液、PBS缓冲液、显微镜玻片、培养基等。
2.检查仪器：确保流式细胞仪各项功能正常，包括激光、光电倍增管等。
3.样本处理：根据实验需要，选择适当的细胞处理方法，如细胞孵育、酶解消化等，确保获取到高质量的细胞悬液。
二、细胞标记1.标记抗体的选择：根据实验需求，选择适当的标记抗体，包括单抗、荧光染料、生物素等。
2.细胞标记试剂的制备：根据实验方案，将标记抗体按照要求的浓度进行稀释，制备成相应的标记试剂。
3.细胞标记操作：将所需细胞悬液分散在适量的PBS缓冲液中，加入标记试剂，轻轻摇晃混合，静置于室温下孵育一段时间，使标记抗体与细胞表面结合。
三、流式细胞术操作1.调整流式细胞仪参数：根据实验需求，设置细胞悬液的流速、激光功率、波长和光电倍增管放大倍数等参数。
2.流式细胞术管套的准备：取一个净化过的管套，用流式细胞术管套清洁剂反复洗涤，然后用蒸馏水清洗，最后用细胞稀释液冲洗一遍。
3.样本装入：将已标记好的细胞悬液加入清洗过的流式细胞术管套中，再用细胞稀释液冲洗一下，确保样本进入流式细胞仪前不会发生凝集或沉淀。
4.样本检测：将样本放入流式细胞仪中，启动仪器开始检测。
通过选择适当的波长和参数，记录并分析细胞的标记情况，如荧光强度、细胞计数、细胞大小等。
5.数据分析：根据实验需求，使用相关软件对所得的数据进行处理和分析，生成数据图表和归纳、总结实验结果。
四、实验结束与清洁1.实验结束：在完成实验后，将仪器设置恢复到初始状态，关闭仪器和电源，清理工作台和废弃物。
2.仪器清洁：使用适当的清洗剂和纯水，清洁仪器内部和外部的各个部分，如样品流路、流式细胞仪的探头等，确保仪器干净整洁。
3.数据保存：将实验所得数据保存到与实验相关的记录文件夹中，以备后续数据分析和验证。
以上是流式细胞术的操作规程。
在进行实验前，要确保仪器的正常运行和合适的细胞标记试剂的选择，严格按照操作规程进行操作，保证实验的顺利进行和数据的准确性。
流式细胞术——原理,操作及应用(二)
流式细胞术——原理,操作及应用(二)流式细胞术原理流式细胞术（Flow Cytometry）是一种通过流式细胞仪对细胞进行高速连续检测和分析的技术。
它利用细胞与荧光标记的抗体等特异性反应，通过流式细胞仪的高速流体流动和多通道探测系统来实现对数千个细胞的快速检测和分析。
操作1.细胞准备：首先需要从样品中获得待检测的细胞，并进行细胞的染色。
常用的染色方法包括直接染色和间接染色，可以利用荧光标记的抗体或荧光染料对细胞进行染色。
2.样品处理：将染色后的细胞悬浮液注入流式细胞仪的进样室中，通过机械或压力的方式使细胞以单细胞的形式通过流式细胞仪。
3.流式细胞仪操作：设置流式细胞仪的相关参数，包括激光光源的波长、光学滤波系统、探测器的选择等。
4.数据获取和分析：流式细胞仪会记录每个细胞的各项参数，包括细胞形态、大小、荧光强度等。
可以利用专门的数据分析软件对获取的数据进行分析和图表的制作。
应用流式细胞术在生命科学研究中有广泛的应用，以下是一些常见的应用：1.免疫学研究：利用流式细胞术可以对免疫细胞进行表面标记，例如CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B细胞等的检测和分析，以研究免疫应答、免疫细胞的亚群分布等。
2.血液学研究：流式细胞术可以用于血液中不同细胞类型的检测和分类，例如红细胞、白细胞以及不同亚群的白细胞等，有助于了解血液疾病的发生机制。
3.肿瘤学研究：利用流式细胞术可以检测肿瘤细胞的特定标记，例如细胞表面抗原、细胞周期相关蛋白等，帮助进一步了解肿瘤细胞的类型、分化程度、增殖活性等。
4.微生物学研究：流式细胞术可以用于微生物的检测和计数，例如细菌、酵母菌等，有助于研究微生物的生长特性、代谢活性等。
5.细胞生物学研究：流式细胞术可以用于对细胞周期的分析、细胞凋亡的检测、细胞增殖速度的测定等，有助于了解细胞生物学的基本过程和调控机制。
总结：流式细胞术是一种非常强大和多功能的技术，在生命科学研究中得到广泛应用。
流式细胞术临床检测项目操作流程
临床检测项目操作流程1：淋巴细胞亚群测定2：HLA-B27测定3：CD55／CD59测定4：血小板抗体测定5：红细胞抗体测定6：粒细胞抗体测定7：白血病免疫分型测定8：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定9：XL操作步骤淋巴细胞亚群测定(CD系列)方法流式细胞仪(BD)原理：双/三色直接免疫荧光法。
荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。
淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。
根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。
标本采集与处理受检者的准备：检查对象生活饮食处于日常状态，空腹静脉采血。
抗凝剂：EDTA或肝素抗凝血要求： 1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。
若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。
4．溶血样本不能用。
试剂品牌规格贮存贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 1ML 2—8℃2：全血溶血试剂A：甲酸70ML 室温B：碳酸钠等32ML 室温C：多聚甲醛14ML 室温3：鞘液 20L 室温4：清洗液 5L 室温5：荧光微球 10ML 2-8℃质控品BD产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。
样本制备：1) 按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照2) 分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。
流式细胞检测实验方法篇
流式细胞检测实验方法篇流式细胞技术（Flow cytometry, FCM）是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。
流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物，它能有效地从单细胞水平区分异质性细胞群体，检测对象包括但不限于悬浮细胞、贴壁细胞或从实体组织分离的单细胞悬液和其他生物颗粒。
一、细胞表面染色步骤1. 样本准备①采集全血或组织（脾，淋巴结，胸腺和骨髓）用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)制成单细胞悬液。
对于体外刺激的细胞，直接将刺激后的细胞悬浮在细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)中，然后进行第2步。
②加满细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS), 300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。
2. 红细胞裂解①需裂解红细胞（如脾脏），将10x红细胞裂解液(ACK buffer)用去离子水稀释到1x，放置到室温。
将细胞重悬于3mL的1x ACK buffer中，室温孵育3-5分钟；如不需要裂解红细胞，直接进入第3步。
②加入10mL细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)终止红细胞裂解，300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。
③重复洗涤一次，加满细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)至15mL, 300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。
④细胞计数，用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)将细胞制成1x107/mL悬液。
将100μL细胞悬液加入流式管中备用。
3. 封闭Fc受体封闭Fc受体能减少染色过程中的非特异性染色。
①小鼠中，纯化的CD16/CD32单抗能和FcγRⅢ/Ⅱ结合，封闭非特异性染色，使阴性细胞的背景荧光降至未标记细胞的水平。
加入0.5-1μg纯的抗小鼠CD16/32单克隆抗体，室温孵育10分钟。
②对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型的纯化Ig或者相同来源血清进行阻断，或者用商业化的Fc受体阻断剂。
流式细胞术操作步骤
流式细胞术检测脾脏CD4+、CD8+
一、准备实验：
1640、PBS缓冲液、铜网、小平皿、剪刀、镊子、离心管、红细胞裂解液、枪头、抗体、细胞计数板、杀鸡用大剪刀、1ml注射器
二、实验操作步骤：
1、取一小块雏鸡脾脏，放入装有1ml 1640的1.5ml离心管中
2、铜网+平皿中加入1ml 1640
3、将脾放入铜网中，磨脾
4、吸取磨好的脾汁放入1.5ml离心管中，离心2000r,5min
5、弃去上清，向脾汁沉淀中加入500µl红细胞裂解液，混匀作
用3min,离心2000r 5min
6、若离心后得到沉淀不变白可重复上述操作
7、裂解完成，离心完成，弃去上清，向试管中加入1ml PBS混匀
8、向1.5ml离心管中加入490µLPBS，再加入10µL步骤7脾汁，
计数
9、取106个细胞加PBS定容至100µL，此处用1.5ml离心管
10、向细胞悬液内加入抗体，每只鸡两管细胞悬液，每管10µL
11、4℃避光保存45min
12、向细胞悬液中加入1mlPBS 2000r 5min
13、弃上清，向管中加入200µL PBS 上机。
流式细胞仪标准操作程序sop(各个项目测定)
流式细胞仪标准操作程序sop（各个项目测定）1 2HLA-B273CD55CD59 4 5 6 7 8TIFN-γ/IL-49XL(流式细胞仪)医院检验科操作规程文件号：200 年月日起实施第1版(共3页)本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月日文件分发部门和／或个人院档案室保管者：检验科主任：检验科实验室：流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)：双/三色直接免疫荧光法。
荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。
淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。
根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。
检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。
静脉采血EDTA或肝素抗凝血1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。
99 3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×10/L之间。
若>10.0×10/L， 9样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×10/L，应分离单个核细胞。
4．溶血样本不能用。
1：单克隆抗体液体 1ML 2—8?2：全血溶血试剂液体A：甲酸液体 70ML 室温B：碳酸钠等液体 32ML 室温C：多聚甲醛液体 14ML 室温3：鞘液液体 20L 室温4：清洗液液体 5L 室温5：荧光微球液体 10ML 2-8?BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8?保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8?可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。
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临床检测项目操作流程1：淋巴细胞亚群测定2：HLA-B27测定3：CD55／CD59测定4：血小板抗体测定5：红细胞抗体测定6：粒细胞抗体测定7：白血病免疫分型测定8：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定9：XL操作步骤淋巴细胞亚群测定(CD系列)方法流式细胞仪(BD)原理：双/三色直接免疫荧光法。
荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。
淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。
根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。
标本采集与处理受检者的准备：检查对象生活饮食处于日常状态，空腹静脉采血。
抗凝剂：EDTA或肝素抗凝血要求： 1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。
若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。
4．溶血样本不能用。
试剂品牌规格贮存贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 1ML 2—8℃2：全血溶血试剂A：甲酸70ML 室温B：碳酸钠等32ML 室温C：多聚甲醛14ML 室温3：鞘液 20L 室温4：清洗液 5L 室温5：荧光微球 10ML 2-8℃质控品BD产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。
样本制备：1) 按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照2) 分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。
3) 混匀，避光，室温孵育20-30分钟。
4) 溶血：FACS LYSING SOLUTION (按说明书步骤溶血)。
5) 上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样。
操作性能精密度批内五次重复CV<2％灵敏度 500—1000个荧光素分子参考值(百分数（绝对值）)CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+29.4-45.8%(478-1072)CD8+ 18.2-32.8%(393-742) NK 9.5-23.5% (175-567)Th/Ts 1.05-2.03临床意义1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。
临床常用Th/Ts比值来判断病人的免疫状况。
Th／Ts比值升高：表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。
Th／Ts比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。
2：NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。
NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。
NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK细胞增加。
HLA-B27测定原理：双色直接免疫荧光法。
将HLA-B27-FITC/B7-PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。
样本制备：1) 按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照2) 分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。
3) 混匀，避光，室温孵育20-30分钟。
4) 溶血：FACS LYSING SOLUTION (按说明书步骤溶血)。
5) 洗、离心、上机测样（备注：测B27一定要至少洗一遍方可上机检测）报告结果报告阴阳性参考值阳性：HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在8.0以上。
临床意义HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB，占人体整个基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎。
CD55/CD59测定原理：双色直接免疫荧光法。
近年的研究表明，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。
血细胞(红细胞和白细胞)通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。
用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。
样本制备:(一)白细胞CD55／CD59检测1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记。
分别向二管中加入样品100ul。
2．溶血。
3．离心后分别加入CD55/CD59 10ul和相应的同型对照10ul。
避光20-30分钟。
4．洗涤离心5．上机测样(二)红细胞CD55／CD59检测1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记2．分别加入CD55／CD59 10ul和相应的同型对照10ul。
3．向二管中加入1：200稀释的样品100ul（可根据红细胞的数量调整），避光20-30分钟。
4．洗涤离心。
5．混匀、上机测样。
报告结果报告百分数参考值CD55>97% CD59>97%PNH的临界值：RBC CD59>95% WBC CD59>90%PNH的诊断值：RBC CD59>91% 大部分>80%中性粒细胞CD59>84%临床意义用于AA和PNH的诊断和分型诊断。
PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。
血小板膜表面抗体测定原理：直接免疫荧光法。
FITC标记的各型多克隆抗体，加到经离心富集的血小板中，与血小板膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。
操作：富集血小板法：1）800r/min*15min,取上清，2）加4－5ml鞘液，2000r/min*3min,弃上清，重复一次。
3) 分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)4) 分别向试管中加入准备好的10u1含血小板的PBS（血小板的量约为106）（血小板若在正常范围，稀释到原量直接取10u1。
）。
5) 混匀，避光，室温孵育20-30分钟6) 洗或不洗，上机测样全血法：1）加4－5ml鞘液，1500r/min*15min,弃上清，后同上3）－6）报告结果报告百分数参考值IgA<2.98% IgG<3.04% IgM<3.0% IgD<2.91%临床意义为免疫性血小板减少性紫癜(ITP)诊断、治疗、预后估计的重要指标，在ITP、胶原性疾病时升高。
红细胞膜蛋白结构测定（红细胞抗体）原理：直接免疫荧光法。
FITC标记的各型多克隆抗体，加到全血中，与红细胞膜上的相应的IgG-Fc 片段结合，经过洗涤(和固定)等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。
操作：1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血（1：200稀释后）。
3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)上机测样报告结果报告百分数参考值IgA<2.78% IgG<2.98% IgM<2.52% IgD<2.88%临床意义自身溶血性贫血的分型诊断粒细胞抗体测定原理：直接免疫荧光法。
FITC标记的各型多克隆抗体，加到经溶血处理后的样本中，与粒系胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析1) 溶血2)分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)3)分别向试管中加入经溶血处理得样本100u1。
4)混匀，避光，室温孵育20-30分钟，洗涤离心5)上机测样报告结果报告百分数参考值IgA<2.68% IgG<2.66% IgM<2.49% IgD<3.4%临床意义白细胞减少症的分型诊断，大多数白细胞减少症患者抗体为阳性白血病免疫分型测定原理：三色直接免疫荧光法。
正常血细胞的分化成熟过程中，细胞膜、细胞浆有抗原的表达与血细胞的分化发育阶段密切相关，因此这些抗原的表达与否可作为鉴别细胞和其分化阶段的基础。
利用荧光素标记的单克隆抗体对血液或骨髓进行染色，通过FCM对白血病细胞细胞膜和细胞浆抗原进行分析，由此了解所测白血病细胞的系列属性及其分化程度。
三色染色在白血病免疫分型中较为常用。
根据分型需要，选择相应抗原的标记抗体，一般FITC标记抗体和PE标记抗体搭配为一组，再加PC5标记抗原CD45单克隆抗体，共三种抗体加入一管标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态，腰穿采骨髓。
抗凝剂肝素抗凝要求 1．样本量至少3ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本或已固定的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。
若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。
4．溶血样本不能用。
操作-样本制备：细胞膜表面抗原1．首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。
2．首先每管中加入5ul CD45-PC5抗体。
3．然后，按管上的标记，加入相应抗体各10ul(注意：必须是FITC和PE标记的抗体搭配)4．各管中加入标本(骨髓或外周血)30～100u1(根据细胞的多少决定)，振荡混匀，室温避光20～30分钟。
5．溶血：细胞浆和核抗原1．准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体，其中一管是同型对照。
2．首先每管中加入标本(骨髓或外周血)100ul(根据细胞的多少决定)，5ulCD45-PC5抗体。
室温避光20分钟。
3．每管中加入固定液100ul，剧烈振荡混匀，室温避光15分钟。
4．各管中加入PBS4ml。
5．300g离心5分钟后，弃去上清液，振荡混匀。
(1500r/min*5min)6．各管中加入透膜剂100ul，轻轻混匀，室温避光5分钟。
7．加抗体，阴性对照管中加入10ul，其余各管加入相应抗体各10ul，室温避光15分钟。
8．各管中加入4mlPBS，振荡混匀。