蜡样芽孢杆菌的检测

实验材料 •甘露醇 卵黄 多粘菌素（MYP）琼脂平板 甘露醇-卵黄 多粘菌素（ 甘露醇 卵黄-多粘菌素 ） •营养琼脂培养基 营养琼脂培养基 •L-酪氨酸营养琼脂培养基 •胰酪胨大豆羊血琼脂 胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB) 胰酪胨大豆羊血琼脂 •动力 硝酸盐生化鉴定管 动力-硝酸盐生化鉴定管 动力 •木糖 明胶生化鉴定管 木糖-明胶生化鉴定管 木糖 •硝酸盐试剂 硝酸盐试剂(1%对氨基苯磺酸溶液 0.2% α-萘胺溶 对氨基苯磺酸溶液, 硝酸盐试剂 对氨基苯磺酸溶液 萘胺溶 液) •3%的双氧水 的双氧水 •革兰染液 革兰染液
4 证实试验
预 实 验 营 养 琼 脂 培 养 基 菌落形态观察
革兰染色
镜检观察菌体 卵磷脂酶实验 L-酪氨酸分解实验 酪氨酸分解实验 触酶实验 溶血实验
双氧水 胰酪胨大豆羊血琼脂平板 MYP琼脂平 琼脂平 板 L-酪氨酸琼脂培养基 L-酪氨酸琼脂培养基
生 化 实 验
鉴 别 试 验
动力与硝酸盐还原实验
动力-硝酸盐生化鉴定管 动力 硝酸盐生化鉴定管
1 形态观察 本菌革兰染色阳性，呈短链或长链，芽孢位于菌体 中央或偏端，不是菌体胀大。
2 实验结果 1 MYP平板上：粉红色菌落，菌落周围产生粉红色浑浊 MYP平板上 粉红色菌落 菌落周围产生粉红色浑浊 平板上： 菌落， 圈。 2 L-酪蛋白琼脂培养基：菌落周围形成透明圈。 酪蛋白琼脂培养基：菌落周围形成透明圈 透明圈。 3 触酶试验：加入过氧化氢后30秒产生气泡。 触酶试验：加入过氧化氢后30秒产生气泡 30秒产生气泡。 4 TSSB平板上：菌落周围产生的β溶血圈。（在菌落 TSSB平板上 菌落周围产生的β溶血圈。 平板上： 周围出现一个大小不一的完全透明清楚的宽带）。 周围出现一个大小不一的完全透明清楚的宽带）。 紫云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌呈现弱得溶血现象， 紫云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌呈现弱得溶血现象， 而炭疽芽胞杆菌通常不溶血。 而炭疽芽胞杆菌通常不溶血。 5 动力-硝酸盐生化鉴定管：细菌沿穿刺线扩散生长， 动力-硝酸盐生化鉴定管：细菌沿穿刺线扩散生长 扩散生长， 加硝酸盐试剂后培养基变红 加硝酸盐试剂后培养基变红。 蕈状芽孢杆菌常常呈绒毛状生长， 蕈状芽孢杆菌常常呈绒毛状生长，蜡样和紫云金芽 孢杆菌通常运动极为活泼，而炭疽芽胞杆菌则不运动。 孢杆菌通常运动极为活泼，而炭疽芽胞杆菌则不运动。
检验程序
检样 50g(mL)+450mL +450mL无菌磷酸盐缓冲稀释液 50g(mL)+450mL无菌磷酸盐缓冲稀释液
10-1~10-6稀释液 选择性培养基 MYP 30°C , 24h ° 形态观察 菌数测定 营养琼脂 30°C , 24h ° 证实试验
革兰染色 生长及菌落观察 鉴别试验
生化反应
计菌落数
MYP 琼脂平板
3 分离培养 计数后，从每个平板选取5个已计数的菌落分别接 种于营养琼脂斜面做纯培养，30℃培养24h，进 行形态观察和证实试验。
第二次课
分类 需氧芽孢杆菌根据芽孢囊膨大与否及芽孢的 形状，可将其分为3个群。第一群的芽孢不突出菌 体，形成的芽孢为椭圆形或圆柱形；第二类的芽 孢囊突出菌体，形成的芽孢为椭圆形；第三群的 芽孢囊突出菌体形成的芽孢为球形。 蜡样芽胞杆菌属于第一群。该群内细菌，根据 营养型细胞的宽度可以又分为两类，其中宽度 ≥0.9µm者称大细胞群，该群有蜡样芽胞杆菌、蕈 状芽孢杆菌、紫云金芽孢杆菌、炭疽芽胞杆菌、 巨大芽孢杆菌。这几种与蜡样芽胞杆菌形态上相 似的4个菌种必须用微生物学和生化学试验进行鉴 别。
产生溶血素：使胰酪胨大豆羊血琼脂（ 产生溶血素：使胰酪胨大豆羊血琼脂（TSSB） ） 中的血细胞发生β溶血 溶血。 中的血细胞发生 溶血。 产生明胶酶： 产生明胶酶：将明胶水解为多肽再水解为氨 基酸而使其由半固体转化为液态状。 基酸而使其由半固体转化为液态状。 触酶实验: 触酶实验 产生过氧化氢酶分解过氧化氢生 成水和氧气。 成水和氧气。 动力和硝酸盐试验: 蜡样芽胞杆菌运动活泼, 动力和硝酸盐试验 蜡样芽胞杆菌运动活泼 能还原硝酸盐为亚硝酸盐。 能还原硝酸盐为亚硝酸盐。
（第一次课） 第一次课）
蜡样芽胞杆菌概述 蜡样芽胞杆菌概述
一 形态与染色
本菌是革兰氏阳性杆菌， 本菌是革兰氏阳性杆菌， 1.0~1.2µm×3~5µm,菌 × 菌 体两端钝圆，有鞭毛， 体两端钝圆，有鞭毛， 无荚膜， 无荚膜，多成短链状排 列。 本菌生长6小时以后可以 本菌生长 小时以后可以 既可以形成芽孢， 既可以形成芽孢，形成 的芽孢小于菌体横径， 的芽孢小于菌体横径， 位于中心或稍偏于一端 稍偏于一端。 位于中心或稍偏于一端。
二 培养特性
营养要求不高， 营养要求不高，在普通 培养基上可生长良好， 培养基上可生长良好， 最适宜温度为28~35℃。 最适宜温度为 ℃ 菌落较大，不透明， 菌落较大，不透明，表 面粗糙似毛玻璃状或蜡 边缘常成扩展状。 状，边缘常成扩展状。 在普通肉汤上培养基呈 浑浊生长， 浑浊生长，常形成菌膜 或壁环，震摇易乳化。 或壁环，震摇易乳化。
实验步骤
2：样品稀释及计数 样品稀释及计数： 样品稀释及计数
1mL 1mL 1mL 1mL 1mL
10Байду номын сангаас1
10-6
9mL
9mL
9mL
9mL
9mL
1 每个稀释度混匀吹打完毕 后换用另一只灭菌吸管。 后换用另一只灭菌吸管。 2 每稀释度接种两个平皿。 每稀释度接种两个平皿。
各稀释度0.1mL， 各稀释度0.1mL，L型玻棒均匀涂布 0.1mL 30℃ ，24h ℃
实验结果
3 计数（表面涂布法）
1克样品中含的蜡样芽孢杆菌数： 克样品中含的蜡样芽孢杆菌数： 克样品中含的蜡样芽孢杆菌数 证实阳性菌落数 挑取的菌落数
MYP平板上的菌落数× 平板上的菌落数
× 稀释倍数× 10 稀释倍数×
举例：将检样10 稀释液0.1mL涂布于MYP 0.1mL涂布于MYP琼脂平板 举例：将检样10-4稀释液0.1mL涂布于MYP琼脂平板 生成的可疑菌落数为25 25个 个进行鉴定， 上，生成的可疑菌落数为25个，取5个进行鉴定， 证实为蜡样芽胞杆菌的是4 1g样品中含的蜡 证实为蜡样芽胞杆菌的是4个，则1g样品中含的蜡 样芽孢杆菌数为（25×4/5） 样芽孢杆菌数为（25×4/5）×104×1/0.1
肠毒素测定
报告
实验步骤
1
样品的保存和送检 待检样品应保持在6℃以下运送并尽可能不使其冷冻。 6℃以下运送并尽可能不使其冷冻 待检样品应保持在6℃以下运送并尽可能不使其冷冻。 对可疑是该菌引起的食物中毒的病人， 对可疑是该菌引起的食物中毒的病人，应取可疑食 物或病患者的呕吐物、粪便，且立刻在3小时内送检 小时内送检。 物或病患者的呕吐物、粪便，且立刻在 小时内送检。 送达实验室后，应保存于4℃并尽快检验。 送达实验室后，应保存于 ℃并尽快检验。
不发酵甘露醇：在甘露醇 卵黄 卵黄-多粘菌素 不发酵甘露醇：在甘露醇-卵黄 多粘菌素 （MYP）琼脂平板上生成微粉红色菌落。 ）琼脂平板上生成微粉红色菌落。 产生卵磷脂酶：分解MYP琼脂中的卵磷脂， 琼脂中的卵磷脂， 产生卵磷脂酶：分解 琼脂中的卵磷脂 在菌落周围产生粉红色混浊环（沉淀环）。 在菌落周围产生粉红色混浊环（沉淀环）。 产生酪蛋白酶：分解培养基中的酪蛋白， 产生酪蛋白酶：分解培养基中的酪蛋白，生 酪氨酸在菌落周围形成透明圈。 成L-酪氨酸在菌落周围形成透明圈。 酪氨酸在菌落周围形成透明圈
三 流行病学
蜡样芽胞杆菌
病原菌 条件致病菌
肠 毒 素 不 耐 热
病
eg:
实验目的
1、掌握蜡样芽孢杆菌检验的主要步骤与方法。 掌握蜡样芽孢杆菌检验的主要步骤与方法。
2、了解蜡样芽孢杆菌菌落特点和掌握生化反 了解蜡样芽孢杆菌菌落特点和掌握生化反 应结果的判断方法。 应结果的判断方法。
蜡样芽胞杆菌具有以下生化特性： 实验原理：蜡样芽胞杆菌具有以下生化特性：