微卫星引物筛选步骤

1．进行酶切用Vs pⅠ对四种鱼（GC、GS、NL和ZZ）基因组DNA（需基因组DNA浓度较高）进行酶切。

反应体系为：ddH2O 15µLVs pⅠbuffer 2µLVs pⅠ酶1µLDNA 2µL总体积20µL酶切在37℃反应3～4h即可，但是为了提高酶切效率可切4～6h。

PCR反应程序为：94℃ 5min，（94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 1min）×30，72℃ 10min，4℃ hold。

Vs pⅠ酶即（AseⅠ酶）：酶切识别位点为：5’A T↓T A A T 3’5’T A A T↑T A 3’AseⅠ酶的接头为：A1：5’CTC GTA GAC TGC GTA CC 3’A2：5’TAG GTA CGC AGT C 3’AseⅠ酶用的预扩增产物为：A3：5’CTC GTA GAC TGC GTA CCT AAT 3’2．接头制备用10µL A1（200µM）和10µL A2（200µM）混合，94℃ 3min后室温放置30min。

3．酶切片段与接头连接接头为A1和A2制备的接头，命名为AE。

连接反应体系如下：ddH2O 5µLT4 ligation酶0.5µLT4 buffer4µL酶切产物20µLA TP（10mM）0.3µLAE 1µL总体积30.8µL上述混合体系在16℃连接过夜。

10h左右。

4．连接产物PCR扩增对连接产物进行PCR扩增，每个样本做4管。

扩增引物为A3。

反应体系如下：ddH2O 14µL10×buffer 2.5µLMg2＋2µLdNTPs（10mM）0.5µLA3 1µLDNA（连接产物）5µLTaqE（2.5U/µL）0.2µL总体积25.2µLPCR反应程序为：（94℃ 30sec，56℃ 1min，72℃ 1min）×20，72℃ 10min，4℃ hold。

5.检测扩增产物扩增产物大小应在750bp左右，即400～1000bp较好。

6．回收扩增产物将同一样本的扩增产物收集于一个EP管中↓向其中加入1/10总体积预冷的3M NaAC和2倍体积预冷的无水乙醇（或者等体积预冷的4MNH4AC和2倍体积预冷的异丙醇）↓－20℃放置30min（该步可在－20℃长期保存）↓室温，12000rpm离心10min↓弃上清，加入1ml左右70％乙醇洗涤一次↓室温，12000rpm离心5min↓弃上清，干燥后加入20µLddH2O溶解即可（可以根据沉淀量加入ddH2O）7．配杂交体系取250～500ng回收DNA与50～80pmol bio-SSR探针混合，使SSC和SDS终浓度分别为4.2×SSC和0.07%SDS。

具体杂交体系如下：ddH2O 74.5µL20×SCC21µL10%SDS 0.7µL回收产物3µLbio-SSR探针（AC）150.8µL总体积100µLPCR反应程序为：95℃ 5min，在58℃可以保存，但是不能时间长。

在此过程中可以准备磁珠。

bio-SSR探针序列可以为（AC）10、（AC）15、（AC）12或者AG重复均可，这个可以根据基因组序列确定。

8．磁珠准备1）2mg beads（200µL）（根据DNA沉淀的多少决定所用磁珠的量，在100～200µL之间，在解冻磁珠时应轻柔的上下颠倒，不能用力）放置在磁力架上，使其吸附到EP管的一侧，然后从另一侧吸弃清液，再加入1mLTEN100洗涤，轻柔颠倒混匀，使磁珠和TEN100充分混合2min左右，然后放到磁力架上吸附，如此反复3次即可。

2）用40µLTEN100溶解最后一次聚集的磁珠。

3）为减少特异性吸附向上述混合液中加入2µL与之无关的基因组DNA（如植物基因组）。

9．吸附1）将杂交体系与稀释的磁珠混合，再加入200µL TEN100稀释。

2）室温放置30min，期间轻柔混合（不能用力过猛，因为该过程是目的片段与探针吸附）。

10．洗涤(去掉多余DNA和杂质)将吸附好的磁珠放到磁力架上去除上清。

1）松弛型洗涤：400µL TEN1000洗涤3次，每次5min，加入TEN1000后轻柔混匀。

2）严谨型洗涤：12µL20×SSC＋12µL10％SDS＋1176µLddH2O，400µL/次，洗涤3次，每次5min，其间需轻柔混匀。

（使SSC终浓度为20％，SDS为0.1%）。

11．洗脱1）第一次洗脱：在磁力架上弃上清液，向磁珠中加入50µLTE，95℃ 5min后迅速取出将上清液吸入另一个管子中（若温度降低那么则会复性），放入－20℃保存。

2）第二次洗脱：向第一次洗脱后的磁珠中加入12µL 0.15M NaOH,洗脱20min后，将其放在磁力架上，取一侧清液，向清液中加入 1.8µL 1M HCL，再加入36.2µLTE，总共50µL后，放入－20℃保存。

3）洗脱产物回收：分别对两次洗脱后的产物进行回收。

分别向两次洗脱后的产物加2µL YtRNA，50µL预冷的4M NH4Ac以及100µL预冷的异丙醇，放入－20℃ 30min以上（也可以长时间保存）。

然后12000rpm离心10min后弃上清，（应特别注意因为几乎看不到沉淀，所以注意小心将弄丢），再加入70％乙醇洗涤一次，再12000rpm离心5min，弃上清。

4）将沉淀干燥后溶于20µLddH2O中。

12．扩增洗脱后回收的产物扩增上一步中的回收产物，NL1st，NL2nd；GS1st和GS2nd各扩增4管。

PCR反应体系为：ddH2O 13.6µL10×buffer2µLMg2＋ 1.2µLdNTPs（10mM）0.4µLA3 0.8µLDNA（回收产物）2µLTaqE（2.5U/µL）0.2µL总体积20µLPCR反应程序为：94℃ 5min，（94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 1min）×30，72℃ 10min，4℃ hold。

检测扩增产物，最好在750bp左右，即400～1000bp均可。

13．回收PCR扩增产物将所扩增的有目的带的产物加入到一个EP管中，加入总体积1/10体积的3M NaAc和2倍体积预冷的无水乙醇（也可以用等体积4M NH4Ac和2倍体积的预冷异丙醇，但是NH4Ac会去掉小片段，而NaAc不会），－20℃放置30min以上↓室温，12000rpm离心10min↓弃上清，加入1ml左右70％乙醇洗涤一次↓室温，12000rpm离心5min↓弃上清，烘干后，沉淀溶于20µLddH2O中。

14．与载体连接在EP管中配制连接混合液，总体积为10µL。

PMD18-T V ector 0.5µLInsert DNA 1µLddH2O 3.5µLLigation SolutionⅠ5µL总体积10µL上述混合液在16℃连接过夜。

其中，PMD18-T Vector用0.5～1µL均可，Insert DNA在0.1~0.3pmol，一般加入1µL，这些都根据DNA的量确定。

Ligation SolutionⅠ应在冰上溶解。

15．连接产物的回收取出连接产物，向10µL反应体系中加入2µL YtRNA＋12µL预冷的4M NH4Ac＋24µL 预冷异丙醇，混匀后－20℃沉降30min以上。

（YtRNA的作用是帮助沉淀，因为连接产物较少所以要加入助沉剂YtRNA）↓室温，12000rpm离心10min↓弃上清，加入500µL（根据DNA量多少加）70％乙醇洗涤一次↓室温，12000rpm离心5min↓弃上清，烘干后，沉淀溶于5µLddH2O中。

16．电转化电转化杯和电转化细胞在冰上预冷。

1．向每管连接产物回收液中加入50µL电转化细胞，用枪混匀放在冰上。

2．把混合液加入电转化小杯中心的孔隙中，放到冰上。

3．用纸擦干小杯，用1500V电压在电转化仪上进行电击（电击时间长短是根据DNA量确定的，机器自己会控制）。

4．转化后，每个小杯中加入900µL液体LB（不加氨苄），用枪头吹打以便使其和转化细胞混匀。

5．取出所有液体加入1.5mLEP管中，170rpm，37℃摇1h。

6．清洗电转化小杯，避免接触金属面，分别用ddH2O，70％乙醇和无水乙醇各清洗3次。

7．取出摇好的菌液后，适当稀释涂板，30µL菌液＋370µL液体LB，然后涂2个板子，每个板子200µL。

在37℃培养过夜。

接头序列：ATTAGGTACGCAGTCTACGAGCTCGTAGACTGCGTACCTAAT5B：AA TGGGAAAGGCACAACTACAAGTCCCAGAA TGCAAAGTGCTGTTGGCTAAAAAGCC AGGATTGGCTGAAGGTGTCACACATGACATGGGGCCACTTGGCAGTTA TGCACAGCTC CGAAAAGGGCTTTTGGTGCCAAGGATGGGTATTCCTCTGAGAACATTTGTGCCTGAATT TTGGCGAAAAGTACCCCTGGTCAGAGCTACAGAGCTGGTGTGTGAACTGCCCTGGTG AACGTTTCATCTCTACTCTGCACCACATAGTGGCTGGGGTTTTCCCCACACTTTTTACTC AGTGCAACATTAGCCTTGTGATTTGTTTTTCTCAGTAGTGTAAAAACACAGTTCTTCAG ATTCCAGGTTGCTTCACTTGTGGTTGTTCCTCTGCTCCCTGGTGACTTTGCTTAGAAGC TCCAGTATTACAAAGATTGTACATGCACCTCTAA TCTAGCCCTCTTTGTTCCTCTACTGA TGTTTTTCTGTTGGTGTCTCACTTGA TCTGTCTCTGT CTCTCTCTCTCTCTCTCTCT CCA T CACTCTCTTTCTCCAGCATCA TACTTGCTCACTCCACAAATCCTCCCATCTCTCTCTCAC ACAGTCTCTCTCCCTCTCTCAA TCTGTCTTTTTTTTTGTGGTGTTTTGACGCGTGCA TGACCCCAAGATTGGGGTATCGGCCAGCGCAGTTTAAP1：5' CTCCCTGGTGACTTTGCTTA 3'P2：5' GATGGGAGGA TTTGTGGAGT 3'SsrttPrimer5.0微卫星分子标记筛选方法综述摘要：微卫星是一种短的串联重复序列(short tandem repeat, STR)或简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)。