微卫星引物筛选步骤

1．进行酶切

用Vs pⅠ对四种鱼（GC、GS、NL和ZZ）基因组DNA（需基因组DNA浓度较高）进行酶切。

反应体系为：ddH2O 15µL

Vs pⅠbuffer 2µL

Vs pⅠ酶1µL

DNA 2µL

总体积20µL

酶切在37℃反应3～4h即可，但是为了提高酶切效率可切4～6h。

PCR反应程序为：94℃ 5min，（94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 1min）×30，72℃ 10min，4℃ hold。

Vs pⅠ酶即（AseⅠ酶）：酶切识别位点为：5’A T↓T A A T 3’

5’T A A T↑T A 3’

AseⅠ酶的接头为：

A1：5’CTC GTA GAC TGC GTA CC 3’

A2：5’TAG GTA CGC AGT C 3’

AseⅠ酶用的预扩增产物为：

A3：5’CTC GTA GAC TGC GTA CCT AAT 3’

2．接头制备

用10µL A1（200µM）和10µL A2（200µM）混合，94℃ 3min后室温放置30min。

3．酶切片段与接头连接

接头为A1和A2制备的接头，命名为AE。连接反应体系如下：

ddH2O 5µL

T4 ligation酶0.5µL

T4 buffer4µL

酶切产物20µL

A TP（10mM）0.3µL

AE 1µL

总体积30.8µL

上述混合体系在16℃连接过夜。10h左右。

4．连接产物PCR扩增

对连接产物进行PCR扩增，每个样本做4管。扩增引物为A3。反应体系如下：ddH2O 14µL

10×buffer 2.5µL

Mg2＋2µL

dNTPs（10mM）0.5µL

A3 1µL

DNA（连接产物）5µL

TaqE（2.5U/µL）0.2µL

总体积25.2µL

PCR反应程序为：（94℃ 30sec，56℃ 1min，72℃ 1min）×20，72℃ 10min，4℃ hold。

5.检测扩增产物

扩增产物大小应在750bp左右，即400～1000bp较好。

6．回收扩增产物

将同一样本的扩增产物收集于一个EP管中

↓

向其中加入1/10总体积预冷的3M NaAC和2倍体积预冷的无水乙醇

（或者等体积预冷的4MNH4AC和2倍体积预冷的异丙醇）

↓

－20℃放置30min（该步可在－20℃长期保存）

↓

室温，12000rpm离心10min

↓

弃上清，加入1ml左右70％乙醇洗涤一次

↓

室温，12000rpm离心5min

↓

弃上清，干燥后加入20µLddH2O溶解即可（可以根据沉淀量加入ddH2O）

7．配杂交体系

取250～500ng回收DNA与50～80pmol bio-SSR探针混合，使SSC和SDS终浓度分别为4.2×SSC和0.07%SDS。具体杂交体系如下：

ddH2O 74.5µL

20×SCC21µL

10%SDS 0.7µL

回收产物3µL

bio-SSR探针（AC）150.8µL

总体积100µL

PCR反应程序为：95℃ 5min，在58℃可以保存，但是不能时间长。在此过程中可以准备磁珠。

bio-SSR探针序列可以为（AC）10、（AC）15、（AC）12或者AG重复均可，这个可以根据基因组序列确定。

8．磁珠准备

1）2mg beads（200µL）（根据DNA沉淀的多少决定所用磁珠的量，在100～200µL之间，在解冻磁珠时应轻柔的上下颠倒，不能用力）放置在磁力架上，使其吸附到EP管的一侧，然后从另一侧吸弃清液，再加入1mLTEN100洗涤，轻柔颠倒混匀，使磁珠和TEN100充分混合2min左右，然后放到磁力架上吸附，如此反复3次即可。

2）用40µLTEN100溶解最后一次聚集的磁珠。

3）为减少特异性吸附向上述混合液中加入2µL与之无关的基因组DNA（如植物基因组）。9．吸附

1）将杂交体系与稀释的磁珠混合，再加入200µL TEN100稀释。

2）室温放置30min，期间轻柔混合（不能用力过猛，因为该过程是目的片段与探针吸附）。10．洗涤(去掉多余DNA和杂质)

将吸附好的磁珠放到磁力架上去除上清。

1）松弛型洗涤：400µL TEN1000洗涤3次，每次5min，加入TEN1000后轻柔混匀。

2）严谨型洗涤：12µL20×SSC＋12µL10％SDS＋1176µLddH2O，400µL/次，洗涤3次，每次5min，其间需轻柔混匀。（使SSC终浓度为20％，SDS为0.1%）。11．洗脱

1）第一次洗脱：在磁力架上弃上清液，向磁珠中加入50µLTE，95℃ 5min后迅速取出将上清液吸入另一个管子中（若温度降低那么则会复性），放入－20℃

保存。

2）第二次洗脱：向第一次洗脱后的磁珠中加入12µL 0.15M NaOH,洗脱20min后，将其放在磁力架上，取一侧清液，向清液中加入 1.8µL 1M HCL，再加入

36.2µLTE，总共50µL后，放入－20℃保存。

3）洗脱产物回收：分别对两次洗脱后的产物进行回收。分别向两次洗脱后的产物加

2µL YtRNA，50µL预冷的4M NH4Ac以及100µL预冷的异丙醇，放入

－20℃ 30min以上（也可以长时间保存）。然后12000rpm离心10min

后弃上清，（应特别注意因为几乎看不到沉淀，所以注意小心将弄丢），

再加入70％乙醇洗涤一次，再12000rpm离心5min，弃上清。

4）将沉淀干燥后溶于20µLddH2O中。

12．扩增洗脱后回收的产物

扩增上一步中的回收产物，NL1st，NL2nd；GS1st和GS2nd各扩增4管。

PCR反应体系为：

ddH2O 13.6µL

10×buffer2µL

Mg2＋ 1.2µL

dNTPs（10mM）0.4µL

A3 0.8µL

DNA（回收产物）2µL

TaqE（2.5U/µL）0.2µL

总体积20µL

PCR反应程序为：94℃ 5min，（94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 1min）×30，72℃ 10min，4℃ hold。

检测扩增产物，最好在750bp左右，即400～1000bp均可。

13．回收PCR扩增产物

将所扩增的有目的带的产物加入到一个EP管中，加入总体积1/10体积的3M NaAc和2倍体积预冷的无水乙醇（也可以用等体积4M NH4Ac和2倍体积的预冷异丙醇，但是NH4Ac会去掉小片段，而NaAc不会），－20℃放置30min以上

↓

室温，12000rpm离心10min

↓

弃上清，加入1ml左右70％乙醇洗涤一次

↓

室温，12000rpm离心5min

↓

弃上清，烘干后，沉淀溶于20µLddH2O中。

14．与载体连接

在EP管中配制连接混合液，总体积为10µL。

PMD18-T V ector 0.5µL

Insert DNA 1µL

ddH2O 3.5µL

Ligation SolutionⅠ5µL

总体积10µL

上述混合液在16℃连接过夜。