番茄高效离体再生体系的建立

０
８０．０ １００
０
０
［２］ 谢必峰 ， 林琳 ， 施巧 琴， 等．灵 芝菌 的深 层培 养及富 硒特 性［Ｊ］．食 品 与 发酵工业， １９９６（ ４） ： ５４－ ５７．
［３］ 魏 华 ， 谢 俊 杰 ， 傅 金 衡 ， 等．灵 芝 富 硒 培 养 研 究［Ｊ］．食 用 菌 ， １９９６， １８ （ ３） ： ７－ ８．
基金项目 作者简介
收稿日期
山东省中青年科学家科研奖励基金（ ２００４ＢＳ０６０１７） 。 孙 同 虎（ １９７８－ ） ， 男 ， 山 东 寿 光 人 ， 硕 士 研 究 生 ， 研 究 方 向 ： 植物抗逆分子生物学。＊ 通讯作者。 ２００６! ０９! ３０
室温培养 ６～８ ｄ 萌发后备用。 １．３．２ 外植体。实验采用番茄幼嫩子叶和下胚轴两种外植 体。第 １ 片真叶长出前， 分别切取番茄子叶中部（ 约 ０．２×０．２ ｃｍ） ， 上表皮向下接种于诱导培养基中， 每瓶接种 ６～８ 片； 下 胚轴中段（ 约 １～１．５ ｃｍ） ， 水平接种于诱导培养基中， 每瓶接 种 ５～６ 段。 １．３．３ 外植 体 培 养 。接 种 好 的 外 植 体 于 组 培 室 中 恒 温（ ２５ ℃） 培养， 每日光照 １２ ｈ ， 光照强度为 １ ５００～２ ０００ ｌｘ 。每种 培养基接种 ６ 瓶。 １．３．４ 幼苗培养。选取顶芽正常、生长健壮的再生幼芽（ １～ ２ ｃｍ） ， 将基 部 愈 伤 组 织 及 培 养 基完 全 切 除 ， 转 接 到 生 根 培 养基上培养， 使其形成完整植株。生根采用 ＭＳ 和 １／２ ＭＳ ２ 种培养基， 每瓶接种 １～２ 个幼芽。培养同方法“ １．３．３”。
生能力， 褐化程度较小。该试验得出， 将继代时间间隔由
１／２ ＭＳ 培 养 基 要 比 ＭＳ 培 养 基 更 适 合 番 茄 诱 导 生 根 。
２１～２５ ｄ 减为 １４～１８ ｄ 可明显降低愈伤组织的褐化。单独添 实验发现， １／２ ＭＳ 诱导生根迅速， 约 ５～６ 天后即可见基部有
加 ＺＴ 也能较好地诱导愈伤组织， 但低浓度的 ＺＴ（ ７ 号） 诱导 幼根出现， １０～１５ 天后不定根数目多， 并很快长出侧根， 幼
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３４ 卷 ２４ 期
毛慧玲等 Ａｓ!１ 菌株富硒能力的研究
６４８７
饼干、糕点中作强化剂， 功效超过美国富硒酵母 ３０ 倍［２］。参 但其原因有于待进一步研究。
考 Ａｓ!１ 的福硒能力， 按成人每日需求 ６０ μｇ 硒计算， 每日只 参考文献
需食用约 １５０ ｇ／Ａｓ 菌体， 即可满足机体对硒的需求， 即可达 到防病、治病、抗衰老、抗肿瘤的目的。Ａｓ!１ 的富硒效果值得 在液体培养生产实践中推广。
愈伤组织能力较弱， 短时间内在出现的小愈伤组织上分化 苗生长旺盛。而 ＭＳ 培养基诱导生根慢， 不定根数目少， 细
出少量幼芽。因此， 低浓度的 ＺＴ 不适于诱导番茄愈伤组织。 弱， 侧根数目亦少， 幼苗生长缓慢， 易黄化。这表明， 培养基
２．３ 不 同 激 素 组 合 和 不 同 外 植 体 对 不 定 芽 的 分 化 的 影 响 中较低的盐离子浓度有利于番茄不定芽生根。因此， 应采用
色。高浓度的 ２， ４!Ｄ（ ２， ６ 号） 诱导的愈伤组织经继代之后容 ２．４ 不 同 培 养 基 对 不 定 芽 生 根 的 影 响 待 幼 芽 长 至 １．５～
易出现褐化， 丧失进一步的分裂生长能力； 而其他激素组合 ２．０ ｃｍ， ２～３ 片叶时， 选取其中较为健壮的芽体从愈伤组织
诱导的愈伤组织经过多次继代之后仍能保持较强的分裂增 上切下， 转接至不同生根培养基上诱导生根。
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｒｅｇｅｎｅｒ ａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｔｏｍａｔｏ ＳＵＮ Ｔｏｎｇ! ｈｕ ｅｔ ａｌ （ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊｉｎａｎ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２５００１４） Ａｂｓｔｒ ａｃｔ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｄｉａ ｗｉｔｈ ｖａｒｉｏｕｓ ｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｏｍａｔｏ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ， ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｎ ｂｕｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｏｔｉｎｇ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ ａｎｄ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＭＳ ＋ ２，４－ Ｄ ０．２ ｍｇ／Ｌ ＋ ６－ ＢＡ １．０ ｍｇ／Ｌ ＋ ｓｕｇａｒ ３０ｇ／Ｌ， ＭＳ ＋ ＩＡＡ ０．２ ｍｇ／Ｌ ＋ ６! ＢＡ １．０ｍｇ／Ｌ ＋ ｓｕｇａｒ ３０ ｇ／Ｌ ａｎｄ １／２ＭＳ ＋ ｓｕｇａｒ ２０ ｇ／Ｌ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｍｅｄｉｕｍｓ ｆｏｒ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ， ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｎ ｂｕｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｏｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ Ｔｏｍａｔｏ； Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ； Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ； Ｃａｌｌｕｓ； Ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
安徽农业科学， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉ． Ｓｃｉ． ２００６， ３４（ ２４） ： ６４６７， ６４８７
责任编辑 曹淑华 责任校对 胡剑胜
番茄高效离体再生体系的建立
孙同虎， 孙秀玲， 薄鹏飞， 杜希华 ＊ （ 山东师范大学生命科学学院， 山东济南 ２５００１４）
摘要 以中蔬四号番茄子叶和下胚轴为外植体进行离体培养， 研究了不同激素及不同浓度的组合对愈伤诱导、不定芽分化及生根的 影响。结果表明， ＭＳ ＋ ２， ４!Ｄ ０．２ ｍｇ／Ｌ ＋ ６!ＢＡ １． ０ ｍｇ／Ｌ＋ 蔗糖 ３０ ｇ／Ｌ 诱导所得愈伤最好， ＭＳ ＋ ＩＡＡ０．２ ｍｇ ／Ｌ ＋６ !ＢＡ１． ０ ｍｇ／Ｌ ＋蔗糖 ３０ ｇ／Ｌ 诱导分化不定芽效果最佳， １／２ ＭＳ＋蔗糖 ２０ ｇ／Ｌ 是诱导不定芽生根的理想培养基。建立起高效番茄离体再生体系。 关键词 番茄； 下胚轴； 子叶； 愈伤； 不定芽分化 中图分类号 Ｑ９４３．１ 文献标识码 Ａ 文章编号 ０５１７－ ６６１１（ ２００６） ２４－ ６４６７－ ０１
继代 １～２ 次之后， 愈伤组织块有 ２ 种生长方式， 一部分愈伤 １／２ ＭＳ 培养基做为番茄不定芽生根培养基。
组织继续分裂增生， 另外一部分愈伤组织表面逐渐转绿， 密
无菌处理的育苗有机土中栽培的幼苗成活率为 １００ ％，
度变大， 表面逐渐形成颗粒状突起， 进一步出现不定芽。
而未经无菌处理的有机土中栽培的幼苗成活率不到 ２０ ％。
（ 上接第 ６４６７ 页）
浓度的 ＺＴ（ ９ 号） 诱导率下降， 且随时间延长畸形芽增多。
组织生长最快， 生长量最大； 不含 ２， ４!Ｄ 的其他培养基中愈
因此， 番茄再生应以番茄子叶为外植体， 以 ＭＳ＋ＩＡＡ ０．２
伤组织生长相对较慢， 但组织块比较致密， 呈黄绿色或淡绿 ｍｇ／Ｌ ＋ＢＡ １．０ ｍｇ／Ｌ 为最佳诱导分化培养基。
表２
编号
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９
不同激素组合诱导子叶及下胚轴不定芽分化率比较
接种数
子叶 下胚轴
２２
３６
４３
３２
６０
３２
６３
３０
４０
２８
３４
３２
４２
２８
３６
２８
４４
２８
出芽数
子叶 下胚轴
１６
３２
０
０
４８
３２
０
０
２９
３４
０
０
３１
２３
２３
２１
２１
２０
诱 导 率∥％
子叶 下胚轴
７２．７ ８８．９
０
待幼苗生出侧根后， 选取健壮苗移栽至育苗有机土中。 育 苗 有 机 土 采 用 两 种 处 理 ， 一 种 经 高 压 灭 菌 ３０ ｍｉｎ 后 使 用， 一种不做无菌处理。移栽前洗净根部培养基以防生菌污 染。幼苗第 １ 周套袋弱光培养， 之后室温自然光照培养。 １．３．５ 统计方法。每种培养基接种外植体 ２０～３０ 个， 重复 ２次。 ２ 结果与分析 ２．１ 消毒方式对种子萌发的影响 番茄种子采用浓度 ０．１ ％ 的升汞消毒 ８ ｍｉｎ 或 ３ ％的次氯酸钠消毒 １２ ｍｉｎ， 都有较好 的消毒效果， 杂菌污染率都为 ０。但升汞消毒的种子萌发困 难， １５ 天后仍未见萌发； 而次氯酸钠消毒的种子约在 ６ 天 之后即可萌发， 且萌发率较高， 出苗整齐， 幼苗较健壮。据报 道， 升汞抑制了内源 ＩＡＡ 的产生， 降低了种子活力［２］。 ２．２ 不同诱导培养基对愈伤组织诱导的影响 表 １ 所列 ９ 种培养基中培养的番茄子叶和下胚轴两种外植体都能诱导 出愈伤组织。下胚轴在 ５～６ 天后可看到愈伤组织出现， 比子 叶快 ８～１０ ｄ。下胚轴诱导的愈伤组织分裂旺盛， 生长快。观 察发现， 下胚轴愈伤诱导表现出明显的极性， 形态学上端愈 伤组织出现早， 生长快， 形态学下端无愈伤或愈伤组织出现 晚且生长量小。这与笔者在多种植物离体培养中观察到的 现象一致。含 ２， ４!Ｄ 的培养基（ ２， ４， ６ 号） 中愈伤组织生长较 快， 组织疏松， 呈白色或者乳白色， 其中 ２ 号培养基中愈伤
表１
各种诱导培养基成分组成
编号 基本培养基
１
ＭＳ
２
ＭＳ
３
ＭＳ
４
ＭＳ
５
ＭＳ
６
ＭＳ
７
ＭＳ
８
ＭＳ
９
ＭＳ
植 物 生 长 调 节 物 质∥ｍｇ／Ｌ
ＩＡＡ
２， ４!Ｄ
ＺＴ
ＢＡ
０．５
－
１．０
－
－
０．５
１．０
－
０．２
－
－
１．０
－
０．２
－
１．０
０．５
－
－
１．０
－
０．５
－
１．０
－
Fra Baidu bibliotek
－
０．５
－
－
－
１．０
－
－
－
２．０
－
１．３ 方法 １． ３． １ 种子消毒。用浓度 ７０ ％酒精消毒 ３０ ｓ， 无菌水冲洗 ２ 次 。 再 把 种 子 分 ２ 批 ， 其 中 一 批 用 浓 度 ０．１ ％ 的 升 汞 （ ＨｇＣｌ２） 溶液消毒 ６～８ ｍｉｎ ， 另外一批用含 ３ ％活性氯的次 氯酸钠（ ＮａＣｌＯ） 溶液消毒 １２ ｍｉｎ。无菌水冲洗 ６～７ 次， 滤纸 吸 干 ， 接 种 于 １／ ２ ＭＳ 固 体 培 养 基（ 蔗 糖 浓 度 为 ３０ ｇ／Ｌ） 中 。
该试验采用的培养基是 ＰＤＡ 培养基， 在未添加亚硒酸 钠时菌丝生长非常好， 而硒的添加对菌丝生物量、富硒率等 都有一定影响。笔者曾尝试了加富培养基富硒培养 Ａｓ!１， 结
［１］ 林 树 钱 ．中 国 药 用 菌 生 产 与 产 品 开 发［Ｍ］．北 京 ： 中 国 农 业 出 版 社 ， ２０００．
基 因 工 程 技 术 已 成 为 番 茄 育 种 的 重 要 手 段 ［１］。而 番 茄 高 效离体再生体系的建立是基因工程研究， 快速育苗， 优质种 质保存等工作的重要前提。目前番茄组织培养研究较多， 建 立了各种再生体系［２－１０］， 但依 然存 在 再 生 效 率 低 、不 稳 定、畸 形 芽 比 例 偏 高 、生 根 困 难 、幼 苗 栽 培 成 活 率 低 等 问 题 。 该 研 究通过优化激素组合， 改善培养条件， 以期筛选出一种低成 本 、高 效 率 的 番 茄 再 生 体 系 。 １ 材料与方法 １． １ 材料 实验所用的番茄种子为中蔬 ４ 号， 购自 中 国 农业科学院花卉蔬菜研究所。 １．２ 培养基 以 ＭＳ 为基本培养基， 添加不同种类和浓度 的激素配成诱导培养基（ 表 １） 。诱导培养基均含 ３ ％蔗糖， 调节 ｐＨ 值至 ５．８， 添加 ０．６ ％琼脂粉固化。培养基分 装 后 ， ０．１ ＭＰａ 高 压 灭 菌 １５～２０ ｍｉｎ。ＺＴ 和 ＩＡＡ 等 不 耐 高 温 的 激 素， 待培养基高压灭菌后再添加。生根培养基采用 ＭＳ 和 １／２ ＭＳ 两种， 添加 ２ ％的蔗糖。
［４］ 活泼， 徐 柔， 章 克昌 ， 等．酒精 糟 液 香 菇 深 层 发 酵 富 集 微 量 元 素 的 研 究［Ｊ］．中国食用菌， ２００３， ２２（ ３） ： ４３－ ４４．
果发现， 菌丝生长受到的抑制作用较小， 耐硒能力也较强，
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