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月稳定）
5．扩增和保存 重组phage可在E.coli中扩增，所得文库可被长时间 利用和贮存，可用于多个不同基因的筛选
6．在宿主菌上形成噬菌斑
7．带有目的外源DNA序列的phage重组体的鉴定
8．对选出的重组phage进行噬斑纯化，再对外源 DNA进行分析
• 载体的去磷酸化，提高连接和包装效率
• 连接反应中，应测定外源片段与载体的比例 phage 108pfu/g DNA
• 基因组DNA片段3’凹端的不完全补平 GEM-11
-GATC- Sau3AI -CTAG-
-CTAG
GATC-
基因组DNA
Klenow dATP /dGTP
Vector
-CTCGAG-GAGCTC-
-GA -CTAG
二、用phage构建文库
1．总DNA的提取 DNA初始长度应至少是用于克隆的片段的4倍， 否则有效片段较少，因此DNA至少应大于100kb （cosmid200kb）
2．载体臂的制备 ·购买 ·载体制备、纯化 ·限制酶消化 BamHI / EMBL XhoI / GEM-11
·载体臂的纯化（梯度离心：蔗糖 或NaCl）
n=ln(1-p)/ln(1-f)
n: 一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数 p: 所期望的目的基因在基因文库中出现的几率 f: 插入片段的平均大小与基因组DNA大小的比值
哺乳动物 3×109kb 若pBiblioteka Baidu99% 平均克隆片段20kb
f=20kb/3×109 n=690773.2
E.coli 4639221bp p=99% f=20kb/4600kb n=1056.9
GATCAG-
互补
XhoI Klenow -CTC -GAGCT
dCTP /dTTP
TCGAGCTC-
三、重组体的筛选和分析
噬斑原位杂交
将噬菌体以一定密度铺于平板，并影印到固相膜上 要从哺乳动物DNA文库里筛选出目标基因，哺乳动物 基因组复杂度为3×109bp，必须筛选几十万个噬斑
不同大小的培养皿所能容纳的噬斑数目
梯度离心的收获量大，而agarose回收量小 回收无填充片段 聚乙二醇沉淀，除去碎片
置换型载体 L
cos
R
Central stuffer
cos
3．基因组DNA的消化 一般采用Sau3AI消化 回收20-24kb （ agarose法 or 梯度离心）
·有些载体可做不完全补平
4．连接/包装 连接形成较长的多联体，包装成粘粒（4℃ 6个
YAC可用于克隆500kb以上，甚至几Mb的DNA片段 BAC 可减少DNA分子间的重组
1． phage vectors
早期（70年代后期）使用，如Charon 4A 和 gtWES， 克隆15～20kb
目前用EMBL系列, 2019，DASH， Charon 38-40， GEM-11 等置换型载体，插入片段的最大值可达 20-24kb
• 双酶切消化载体 （EMBL系列，2019，XDASH，Charson 40,35,34）
EMBL 3A: SalI BamHI EcoRI ------ E1 B1-S1
若用BamHI和EcoRI双酶切，可用异丙醇沉淀或其它 柱层析法去除小片段，使非重组体的数目降低2个数 量级，结合其它方法如Spi筛选可再降低2-3个数量级
·选择载体要考虑的因素
易于从重组噬菌体中回收插入的外源DNA 易于制备两臂 载体的可知性，如序列，图谱 载体臂上的琥珀突变，利用特殊筛选系统 重组体中有活性的gam基因 载体臂上的chi序列
2．Cosmid vector
所有cosmid vector均可用于构建文库，但建议尽量 使用 pJB8和c2RB，因为经验较多，许多问题易于 解决
一、载体的选择
可装载的外源DNA
Plasmid <10kb
Phage Cosmid BAC YAC
0-23kb ~45kb ~ 100kb ~ 300kb-1.2Mb
粘粒克隆所需的克隆子数是phage的一半， 如需700000时，cosmid需350000个
如无特殊需要(如单个phage不能包容靶基因片段或 要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克隆 时)一般不采用cosmid，因其在构建文库和贮存文库 比phage困难得多
其它方法，如免疫学方法
四、亚基因组文库的构建
用基因组DNA的特定部分所构建的基因文库 质粒 DNA，线粒体DNA, 特定限制性片段
在有杂交探针的情况下，可通过Southern杂 交，先找出目标基因所在的限制性片段的大 小，然后用相应大小的限制性DNA片段构 建出基因文库，这样可减少筛选的压力。
例如 将基因组DNA用多种限制性内切酶切割， 通过Southern杂交
平皿直总面积底 层 琼 脂指 示 细 菌顶 层 琼 脂噬 斑 最 大 数 目
径 (mm) (cm2) 量 (ml) 量 (ml) 量 （ ml）(噬 斑 数 /平 板 )
90 63.9 30
0.1
2.5 15000
150 176.7 80
0.3
6.5 50000
. 杂交筛选 用探针 . 纯化 . 分析 /Southern杂交，酶切Sequencing/
第八章 DNA文库的构建
DNA libraries
基因文库（Gene library）：由大量的含有基因组 DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同 DNA片段的克隆所构成的群体, 称之为基因文 库。一个完全的基因文库，应该能够保证从中 筛选到目的基因。 即 Genomic library
1976年L.Clark, J.Carbon提出了一个完全的基因 文库所需克隆的计算公式
发现目标基因在 8.3kb SpeI片段上
则 将SpeI切割的 基因组DNA中的 ~8.3kb片段回收， 用于构建DNA文 库
哺乳动物 3×109kb 若p=99% 平均20kb n=690773.2
p=99% f=10kb/4600kb n=2116
cDNA文库:
若这些大量的重组DNA分子所含的外源 DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的 特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经 反转录形成的cDNA，它们所构成的重组 DNA克隆群体，则称之为cDNA基因文库
第一节 基因组DNA文库的构建
5．扩增和保存 重组phage可在E.coli中扩增，所得文库可被长时间 利用和贮存，可用于多个不同基因的筛选
6．在宿主菌上形成噬菌斑
7．带有目的外源DNA序列的phage重组体的鉴定
8．对选出的重组phage进行噬斑纯化，再对外源 DNA进行分析
• 载体的去磷酸化，提高连接和包装效率
• 连接反应中，应测定外源片段与载体的比例 phage 108pfu/g DNA
• 基因组DNA片段3’凹端的不完全补平 GEM-11
-GATC- Sau3AI -CTAG-
-CTAG
GATC-
基因组DNA
Klenow dATP /dGTP
Vector
-CTCGAG-GAGCTC-
-GA -CTAG
二、用phage构建文库
1．总DNA的提取 DNA初始长度应至少是用于克隆的片段的4倍， 否则有效片段较少，因此DNA至少应大于100kb （cosmid200kb）
2．载体臂的制备 ·购买 ·载体制备、纯化 ·限制酶消化 BamHI / EMBL XhoI / GEM-11
·载体臂的纯化（梯度离心：蔗糖 或NaCl）
n=ln(1-p)/ln(1-f)
n: 一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数 p: 所期望的目的基因在基因文库中出现的几率 f: 插入片段的平均大小与基因组DNA大小的比值
哺乳动物 3×109kb 若pBiblioteka Baidu99% 平均克隆片段20kb
f=20kb/3×109 n=690773.2
E.coli 4639221bp p=99% f=20kb/4600kb n=1056.9
GATCAG-
互补
XhoI Klenow -CTC -GAGCT
dCTP /dTTP
TCGAGCTC-
三、重组体的筛选和分析
噬斑原位杂交
将噬菌体以一定密度铺于平板，并影印到固相膜上 要从哺乳动物DNA文库里筛选出目标基因，哺乳动物 基因组复杂度为3×109bp，必须筛选几十万个噬斑
不同大小的培养皿所能容纳的噬斑数目
梯度离心的收获量大，而agarose回收量小 回收无填充片段 聚乙二醇沉淀，除去碎片
置换型载体 L
cos
R
Central stuffer
cos
3．基因组DNA的消化 一般采用Sau3AI消化 回收20-24kb （ agarose法 or 梯度离心）
·有些载体可做不完全补平
4．连接/包装 连接形成较长的多联体，包装成粘粒（4℃ 6个
YAC可用于克隆500kb以上，甚至几Mb的DNA片段 BAC 可减少DNA分子间的重组
1． phage vectors
早期（70年代后期）使用，如Charon 4A 和 gtWES， 克隆15～20kb
目前用EMBL系列, 2019，DASH， Charon 38-40， GEM-11 等置换型载体，插入片段的最大值可达 20-24kb
• 双酶切消化载体 （EMBL系列，2019，XDASH，Charson 40,35,34）
EMBL 3A: SalI BamHI EcoRI ------ E1 B1-S1
若用BamHI和EcoRI双酶切，可用异丙醇沉淀或其它 柱层析法去除小片段，使非重组体的数目降低2个数 量级，结合其它方法如Spi筛选可再降低2-3个数量级
·选择载体要考虑的因素
易于从重组噬菌体中回收插入的外源DNA 易于制备两臂 载体的可知性，如序列，图谱 载体臂上的琥珀突变，利用特殊筛选系统 重组体中有活性的gam基因 载体臂上的chi序列
2．Cosmid vector
所有cosmid vector均可用于构建文库，但建议尽量 使用 pJB8和c2RB，因为经验较多，许多问题易于 解决
一、载体的选择
可装载的外源DNA
Plasmid <10kb
Phage Cosmid BAC YAC
0-23kb ~45kb ~ 100kb ~ 300kb-1.2Mb
粘粒克隆所需的克隆子数是phage的一半， 如需700000时，cosmid需350000个
如无特殊需要(如单个phage不能包容靶基因片段或 要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克隆 时)一般不采用cosmid，因其在构建文库和贮存文库 比phage困难得多
其它方法，如免疫学方法
四、亚基因组文库的构建
用基因组DNA的特定部分所构建的基因文库 质粒 DNA，线粒体DNA, 特定限制性片段
在有杂交探针的情况下，可通过Southern杂 交，先找出目标基因所在的限制性片段的大 小，然后用相应大小的限制性DNA片段构 建出基因文库，这样可减少筛选的压力。
例如 将基因组DNA用多种限制性内切酶切割， 通过Southern杂交
平皿直总面积底 层 琼 脂指 示 细 菌顶 层 琼 脂噬 斑 最 大 数 目
径 (mm) (cm2) 量 (ml) 量 (ml) 量 （ ml）(噬 斑 数 /平 板 )
90 63.9 30
0.1
2.5 15000
150 176.7 80
0.3
6.5 50000
. 杂交筛选 用探针 . 纯化 . 分析 /Southern杂交，酶切Sequencing/
第八章 DNA文库的构建
DNA libraries
基因文库（Gene library）：由大量的含有基因组 DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同 DNA片段的克隆所构成的群体, 称之为基因文 库。一个完全的基因文库，应该能够保证从中 筛选到目的基因。 即 Genomic library
1976年L.Clark, J.Carbon提出了一个完全的基因 文库所需克隆的计算公式
发现目标基因在 8.3kb SpeI片段上
则 将SpeI切割的 基因组DNA中的 ~8.3kb片段回收， 用于构建DNA文 库
哺乳动物 3×109kb 若p=99% 平均20kb n=690773.2
p=99% f=10kb/4600kb n=2116
cDNA文库:
若这些大量的重组DNA分子所含的外源 DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的 特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经 反转录形成的cDNA，它们所构成的重组 DNA克隆群体，则称之为cDNA基因文库
第一节 基因组DNA文库的构建