芜菁皱缩病毒P38蛋白的原核表达及抗血清的制备

Ｐｒ ｏ ｋａ ｒ ｙ ｏ ｔ ｉ ｃ ｅ ｘ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｐ３ ８ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｔｕ ｒ ｎｉ ｐ Ｃｒ ｉ ｎ ｋｌ ｅ Ｖｉ ｒ ｕ ｓ ａ ｎｄ ｐｒ ｅ ｐａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｉ ｔ ｓ ｐｏ ｌ ｙ ｃ ｌ ｏ ｎ ａ ｌ ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｙ
张 静 朱 峰 ，陈应 娟 ，邓 星 光 ，刘 健 ，林 宏 辉 ，席德 慧
，
（ 四川 Ｉ 大 学 生 命 科 学 学 院生 物 资 源 与 生 态 环 境 教 育 部 国家 重 点 实 验 室 ，成 都 ６ １ ０ ０ ６ ４ ）
摘 要 ： 从 感 染 芜菁 皱缩 病毒 （ ＴＣ Ｖ） 的 拟 南 芥 中提 取 总 Ｒ ＮＡ，通过 反 转 录 Ｐ Ｃ Ｒ（ ＲＴ — Ｐ Ｃ Ｒ）
Ｇ Ｃ ＴＴ ＧＣ ＡＡ 一 ３ （ 划 线部分 为 Ｓ ａ ｃ 工酶 切 位 点 ） ． 用下游 引 物 Ｒ将 植 物 总 Ｒ ＮＡ反 转 录 后 ，加 入 Ｆ ， Ｒ扩 增 目 的 片 段． Ｐ Ｃ Ｒ 条 件 为 ：９ ４ ℃ 预变 性 ５ ｍｉ ｎ ， ９ ４ ℃５ ０ ｓ ， ５ ２ ℃４ ５ ｓ ，７ ２ ℃ｌ ｍｉ ｎ ，３ ２ 个 循环 后 ，
点 ） ； Ｒ： ５ Ｃ ＧＡＧ Ｃ Ｔ Ｃ Ｃ ＴＡＡＡＴ ＴＣ Ｔ ＧＡＧＴ —
Ｔ Ｃ Ｖ的 Ｐ ３ ８可 特异 性地 抑 制 Ｄ Ｃ Ｌ ４的活性 ＿ ７ ］ ．但
后来 的研 究表 明 ，在拟 南 芥 中 ，Ｐ ３ ８ 作 用 于 ＤＣ Ｌ ４ 的 表 象 只 是 其 抑 制 ＡＧＯ１蛋 白的 一 个 间 接 性 结 果 ．Ｐ ３ ８的 ＧＷ 基 序可直 接 与 ＡＧＯ１ 特 异性 结合 ，
扩 增得 到 ＴＣ Ｖ 的 外 壳蛋 白基 因 Ｐ３ ８ ．在 目的 基 因 Ｏ ＲＦ框 两 边 引入 酶 切 位 点 Ｂ ａ ｎＨ Ｉ和 ｒ
Ｓ ａ ｃ Ｉ ，并 连 接 到 表 达 我 体 ｐ Ｅ Ｔ ３ ０ 一 ａ上 ，导 入 大 肠 杆 菌 Ｂ Ｌ ２ １ （ Ｄ Ｅ ３ ） 中 ，３ ７℃ 经 ０ ． ５ ｍＭ ／ Ｌ Ｉ Ｐ ＴＧ 诱 导 ６ ｈ后 获 得 了 分 子 量 约 为 ４ ８ ｋ Ｄ 的 融 合 蛋 白 ．经 Ｎｉ — Ｎ ＴＡ 纯 化 目 的 蛋 白 ，注 射 大
Ｔａ ｋ ａ ｒ ａ 公 司 ，表 达 载 体 ｐ Ｅ Ｔ ３ ０ 一 ａ由 本 实 验 室 保
存．
２． ３ ＲＴ— ＰＣＲ
ｄ ｅ ｄ Ｒ ＮＡ） 大 小 的方 式 与 ｄ ｓ Ｒ ＮＡ结 合 ，从 而 阻碍
ｄ ｓ Ｒ ＮＡ 被 剪 切 成 ｓ ｉ Ｒ ＮＡ （ ｓ ｍａ ｌ ｌ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｆ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ
０ ． ５ ｒ ｎ Ｍ／ Ｌ Ｉ Ｐ ＴＧ ａ ｔ ３ ７℃ ｆ ｏ ｒ ６ ｈ ．Ｔｈ ｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｅ ｄ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｗａ ｓ ｐ ｕ ｒ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄ ｂ ｙ Ｎｉ — ＮＴＡ ａ ｎ ｄ ａ ｎ ｔ ｉ — Ｐ ３ ８ ｐ ｏ ｌ ｙ ｃ ｌ ｏ ｎ ａ ｌ
参 与［ ２ 。 ］ ．Ｐ ３ ８也 是 Ｔｃ Ｖ 的沉 默 抑 制 子 ］ ，可 通 过作 用 于 基 因 沉 默 （ ＲＮＡ ｓ ｉ ｌ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｇ ） 过 程 中 的
Ｒ ＮＡ 或者 蛋 白因子抑 制宿 主 的基 因沉 默 ．在 拟 南 芥中， Ｐ ３ ８能 以一种 独 立于 ｄ ｓ Ｒ ＮＡ（ ｄ ｏ ｕ ｂ ｌ ｅ ｓ ｔ ｒ ａ ｎ —
ｔ ｅ ｃ ｔ ｔ ｈｅ ｅ ｘ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏｆ Ｐ３ ８ ｉ ｎ ｉ ｎｆ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ Ａｒ ａｂ ｉ ｄｏ ｐｓ ｉ ｓ ｔ ｈ ａｌ ｉ ａｎ ａ．
Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄｓ ：ＴＣＶ ；Ｃｏ ａ ｔ ｐｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ；Ｐｒ ｏ ｋａ ｒ ｙ ｏ ｔ ｉ ｃ ｅ ｘ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏｎ；Ｐｒ ｅ ｐａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏｎ ｏ ｆ ａ ｎｔ ｉ ｓ ｅ ｒ ｕｍ
Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｌｉ ｆ ｅ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ，Ｓ ｉ ｃ ｈ ｕ ａ ｎ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｃｈ ｅ ｎ ｇ ｄ ｕ ６ １ ０ ０ ６ ４，Ｃｈ ｉ ｎ ａ ）
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｔｈ ｅ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｏ ｔ ｉ ｄ ｅ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ａ ｔ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ（ Ｐ ３ ８ ）ｇ ｅ ｎ ｅ ｏ ｆ Ｔｕ ｒ ｎ ｉ ｐ ｃ ｒ ｉ ｎ ｋ ｌ ｅ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｗａ ｓ ｏ ｂ ｔ ａ ｉ ｎ ｅ ｄ
Ｉ ａ ｎ ｄ Ｓ ａ ｃ １ ｗｅ ｒ ｅ ｉ ｎ ｔ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ＯＲＦ ｆ ｒ ａ ｇ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｐ３ ８ ． Ｔｈ ｅ ｎ ｔ ｈ ｅ ｆ ｒ ａ ｇ ｍｅ ｎ ｔ ｗａ ｓ ｌ ｉ ｎ ｋ ｅ ｄ ｔ ｏ ｇ ｅ ｔ ｈ ｅ ｒ ｗｉ ｔ ｈ
（ ３ １ １ ７ １ ８ ３ ５ ， ３ １ ２ ７ ０ ２ ９ ０ ） ；四川省 应 用 基 础项 目（ ２ ０ １ ２ Ｊ Ｙ０ ０ ７ ８ ） ；中央 高校 基 本 科研 业 务 费 （ ２ ０ １ １ Ｓ Ｃ Ｕ０ ４ Ｂ ３ ４ ）
作者简介 ： 张静（ １ ９ ８ ７ 一） ， 女 ，￣ ｌ Ｊ ｌ ｌ 遂 宁 人 ，硕 士 研 究 生 ， 主 要 从 事 植 物 病 毒 学 研 究 ．Ｅ — ｍａ ｉ ｌ ： ２ ９ １ ０ ２ ８ ３ ９ ８ ＠ｑ ｑ ． ｃ ｏ ｎ ｒ
对 感染 ＴＣ Ｖ 的拟 南芥 提 取 总 ＲＮＡ．Ｐ Ｃ Ｒ 引
物由 Ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ公 司合 成 ，上 游 引 物 Ｆ和 下 游 引 物 Ｒ 分别 引入 酶切 位 点 Ｂ ａ ｎＨ 工， ｒ Ｓ ａ ｃ Ｉ，引 物
序 列 为 Ｆ： ５ ｒ ＿ Ｃ ＧＧＧ ＡＴＣ Ｃ Ａ ＴＧＧ ＡＡＡＡＴＧＡＴ Ｃ －
ＺＨ ＡＮ Ｇ Ｊ ｉ ｎ ｇ ，ＺＨ Ｕ Ｆｅ ｎ ｇ ，ＣＨ ＥＮ ｇ ｉ ｎ ｇ — Ｊ ｕ ａ ｎ，Ｄ ＥＮ Ｇ Ｘｉ ｎ ｇ ～ Ｇｕ ａ ｎ ｇ， ＬＩ Ｕ Ｊｉ ａ ｎ，ＬＩ Ｎ Ｈｏ ｎ ｇ — Ｈｕ ｉ ，Ｘ Ｉ Ｄｅ － Ｈｕ ｉ
（ Ｋｅ ｙ Ｌａｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏｒ ｙ ｏｆ Ｂｉ ｏ — ｒ ｅ ｓ ｏｕ ｒ ｃ ｅ ｓ ａ ｎｄ Ｅｃ ｏ — ｅ ｎ ｖｉ ｒ ｏｎｍ ｅ ｎｔ ｏｆ Ｍｉ ｎｉ ｓ ｔ ｒ ｙ ｏ ｆ Ｅｄｕｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ，
１ 引
芜菁 皱缩 病毒 （ Ｔ ｕ ｒ ｎ ｉ ｐ Ｃ ｒ ｉ ｎ ｋ ｌ ｅ Ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ，ＴＣ Ｖ） 属 于番 茄 丛矮 病毒 科 （ Ｔ ｏ ｍｂ ｕ ｓ ｖ ｉ ｒ ｉ ｄ ａ ｅ ） 香石 竹 斑驳
轻 微 扭 曲 ，有 时 出 现 更 严 重 的植 株 畸 形 或 丛 矮 ．
白兔制 备抗 血 清．Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ 结果表 明制备好 的抗血 清 能成功检 测感 染 ＴＣ Ｖ 的拟 南芥．
关 键词 ：芜菁 皱 缩病毒 ；外 壳蛋 白 ；原核表 达 ； 抗 血 清制备
中图分 类号 ： Ｑ ７ ８ 文 献标 识码 ： Ａ 文章 编 号 ： ０ ４ ９ ０ — ６ ７ ５ ６ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ２ — ０ ４ ４ １ — ０ ５
Ｐ ＥＴ３ ０ 一 ａ ａ ｎ ｄ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ Ｅ． ｃ ｏ ｌ ｉ ＢＬ２ １ （ ＤＥ ３ ） ． Ｔｈ ｅ ｔ ａ ｒ ｇ ｅ ｔ ｆ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ（ ４ ８ ｋ Ｄ） ｗａ ｓ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄ ｂ ｖ
或者 在本 生烟 中的 细胞 间运 动都 需 要 Ｐ ３ ８蛋 白 的
为分析 纯．
２ ． ２ 菌 株 和载体
克 隆载 体 ｐ ＭＤ １ ９ 一 Ｔ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ，克 隆菌 株 大 肠 杆
菌 ＤＨ５ ａ ，表达 菌株 大 肠 杆 菌 Ｂ Ｌ ２ １ （ Ｄ Ｅ ３ ） 均购 自
Ｒ ＮＡ） ， 干 扰宿 主基 因沉 默ｌ ５ ］ ， Ｐ ３ ８还 能 抑 制初 级
ｓ ｉ Ｒ ＮＡ 的活 性 ，并 且 这 种抑 制 需 要一 种 乙烯 诱 导 的转 录 因 子 Ｒ ＡＶ２的 协 助 ］ ． 以前 有 研 究 显 示
Ｃ ＴＡＧＡＧ ＴＣ 一 ３ （ 划线部分为 Ｂ ａ ｍＨ 工酶 切 位
ｕｓ ｉ ｎｇ ＲＴ— ＰＣＲ ｆ ｒ ｏｍ Ａｒ ａｂ ｉ ｄｏ ｐｓ ｉ ｓ ｔ ｈａｌ ｉ ａｎ ａ ｉ ｎｆ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｗｉ ｔ ｈ ＴＣＶ． Ｒｅ ｓ ｔ ｒ ｉ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｅ ｎ ｚ ｙ ｍｅ ｃ ｕｔ ｔ ｉ ｎｇ ｓ ｉ ｔ ｅ ｓ ｏ ｆ Ｂａｍ Ｈ
通讯作者 ： 席 德 慧 ．Ｅ － ｍａ ｉ ｌ ：ｘ ｉ ｄ ｈ ＠￥ Ｃ Ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ
４ ４ ２
四 川 大 学 学报 （ 自然 科 学版 ）
第 ５ ２卷
将其基 因组 包裹 于 内形 成直 径 为 ３ ０ ｎ ｍ的 １ ２面体 的病毒 粒子 口 ；Ｔ Ｃ Ｖ 在很 多宿 主 中 的系统 性 移 动
第 ５ ２卷 第 ２期
Ｖｏ １ ． ５ ２ ＮＯ ． ２
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． ０ ４ ９ ０ — ６ ７ ５ ６ ． ２ ０ １ ５ ． ０ ２ ． ０ ３ ９
芜菁 皱 缩 病 毒 Ｐ ３ ８蛋 白的原 核 表 达 及 抗 血 清 的制 备
２ ０ １ ５年 ３ 月
四 川 大 学 学报 （ 自然科 学 版 ）
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ １ ｏ ｆ Ｓ ｉ ｃ ｈ ｕ ａ ｎ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ（ Ｎａ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ Ｅｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ）
Ｍａ ｒ ． ２ Ｏ１ ５
ＴＣ Ｖ除 了易 通过 机械 接 种传 播 外 ， 还 可 以靠跳 甲
的成 虫 和 幼 虫 传 播． Ｔ Ｃ Ｖ 属 于 正 义 单 链 ＲＮＡ （ ４ ０ ５ ０ ｎ ｔ ） 病 毒 ，含有 ５ 个 ＯＲ Ｆ框 ，其 中 Ｐ ３ ８蛋 白 由３ ’ 端 的亚基 因 Ｒ ＮＡ２ （ ｓ ｇ Ｒ ＮＡ２ ） 编码 ． Ｐ ３ ８是 Ｔ Ｃ Ｖ 的外 壳蛋 白（ Ｃ ｏ ａ ｔ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ，Ｃ Ｐ ） ，
ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｙ ｗａ ｓ ｐ ｒ ｅ ｐ ａ ｒ ｅ ｄ ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ ｒ ａ ｂ ｂ ｉ ｔ ．Ｗ ｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｓ ｈ ｏ ｗｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ａ ｎ ｔ ｉ ｓ ｅ ｒ ｕ ｍ ｃ ｏ ｕ ｌ ｄ ｂ ｅ ｕ ｓ ｅ ｄ ｔ ｏ ｄ ｅ —
病毒属（ Ｃ ａ ｒ ｍｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ） ．ＴＣ Ｖ 主 要感 染 十字 花科 植
物， 能 引起 芜菁 （ Ｂ ｒ ａ ｓ ｓ ｉ ｃ ａ ｒ ａ ｐ ａ） 叶 片 皱 缩 ，斑 驳 和期 ：
基金项 目： 国 家 自然 科 ￣