分离纯化的前期步骤优秀课件
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❖ 进一步提纯，一般使用层析法包括凝胶过滤， 离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。
❖ 必要时还可选择电泳法。
8.2 材料的选择与处理
❖ 含量高 ❖ 容易得到 ❖ 干扰物质少 ❖ 价格便宜 ❖ 容易分离 ❖ 安全性好
❖ 清理除杂 ❖ 冷冻 ❖ 干燥 ❖ 浓缩
❖ 含量高 ❖ 容易得到 ❖ 干扰物质少 ❖ 价格便宜 ❖ 容易分离 ❖ 安全性好 ❖ 提取工艺简单 ❖ 有综合利用价值
❖ 对动物材料的效果比微生物材料和植物材料要 好。
(3)渗透压法（高渗或低渗处理）
❖ 渗透压就是用来抗衡渗透倾向所需的一种力。
❖ 先将细胞置于高渗溶液(如蔗糖溶液)中平衡 一段时间后，突然将其转入到低渗缓冲液和水 溶液中，则细胞壁会因渗透压的突然变化而破 碎。
❖ 此法只适于处理细胞壁比较脆弱的细胞。
8.3 细胞破碎
❖ （1）碾磨法/组织捣碎法 ❖ （2）超声波破碎法（10-15KHz） ❖ （3）渗透压法（高渗或低渗处理） ❖ （4）冻融法
❖ （5）表面活性剂处理法（SDS、Tween、TritonX） ❖ （6）细胞自溶法（利用细胞自身的酶） ❖ （7）丙酮法（冷丙酮脱水抽提） ❖ （8）酶处理方法
（1）碾磨法/组织捣碎法
❖ 是最普通和常见的细胞破碎方法。 ❖ 既可以使用普通的高速组织捣碎机、细胞匀浆
器，也可使用专门的用于微生物细胞破碎的细 菌磨等。
(2)超声波破碎法
❖ 使用专一的超声波破碎仪，利用仪器所产生的 超声波（10~15kHz）机械震动后对组织细胞产 生的空化作用（Cavitation）使细胞破碎。
❖ 当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当 方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白质分离开 来。
❖ 一般这一步的分级用盐析、等电点沉淀和有机 溶剂分级分离等方法。
❖ 第三步是细分级(fine fractionation)，也就是样品 的进一步提纯。
❖ 样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白大 部分已被除去。
❖ 提取的温度要视有效成份性质而定。
❖ 一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高 而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时 间。
❖ 但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活， 因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般 采用低温（5度以下）操作。
❖ 为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋 白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸 等）。
分离纯化的前期步骤优秀课件
生化物质的制备和分离纯化
❖ 分离纯化的一般步骤 ❖ 选材 ❖ 细胞破碎 ❖ 抽提 ❖ 分离纯化 ❖ 结晶 ❖ 纯度鉴定 ❖ 保存
8.1 分离纯化的一般步骤
❖ 选材 ❖ 细胞破碎 ❖ 抽提 ❖ 分离（沉淀法、离子交换法） ❖ 纯化 （分子筛、电泳） ❖ 结晶 ❖ 纯度鉴定 ❖ 保存
❖ 分离提纯某一特定蛋白质的一般程序可以分为 ❖ 前处理 ❖ 粗分级 ❖ 细分级
❖ 第一步是前处理(pretreatment)。
❖ 分离提纯某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原 来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并 保持原来的天然状态，不丢失生物活性。
❖ 第二步是粗分级(rough fractionation)。
蛋白质（包括酶）的提取
❖ 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶 液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙 酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶 剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法
❖ 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、 溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常 用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的 搅拌，以利于蛋白质的溶解。
选材
❖ 微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料， 所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物， 应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核 酸的含量较高，可以获得高产量，
❖ 以微生物为材料时有两种情况:
❖ （1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞 外酶等；
❖ （2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞 内酶等。
❖ 植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长 发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大， 另外与季节性关系密切。
❖ 对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织 为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。
❖ 另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷 冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制 备。
（6Fra Baidu bibliotek细胞自溶法
❖ 利用细胞自身的酶
(7)丙酮法（冷丙酮脱水抽提）
❖ 丙酮等脂溶性溶剂可溶解细胞膜上的脂质化合 物，从而使细胞膜的结构破坏。
❖ 一般是将细胞制成丙酮干粉后，再加提取酶。
(8)酶处理方法
❖ 用外源的溶菌酶或细胞壁分解酶(如蛋白酶、脂 肪酶、核酸酶等)在一定条件下作用于细胞而使 细胞壁破碎。
❖ 但这种方法因需外加酶制剂，因此可能会对后 续目的酶的提取产生不利的影响。
8.4 抽提
❖ 物质的抽提常常和细胞破碎步骤协同进行 ❖ 根据被提取物质的溶解特性，选择适当的溶剂 ❖ 始终保持低温操作，防止生物活性物质变性 ❖ 提取的原则是“少量多次” ❖ 尽量去除干扰物质 ❖ 防止水解酶的作用 ❖ 加入一定的保护试剂 ❖ 其他影响因素：pH、溶剂极性与离子强度等
❖ 下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
❖ 1、pH值
❖
蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液 的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。
❖ 用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白 质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可 逆变化，
❖ 一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸 性蛋白质用偏碱性的提取液。
(4)冻融法：
❖ 将细胞在低温(-15℃)下冰冻后再在室温下融化， 如此反复多次就能使细胞壁破裂。此法也只适 用于胞壁易破的细胞。
(5)表面活性剂处理法：
❖ 在适当的温度、pH及低离子强度下，表面活性 剂（如SDS、Tween、TritonX）能与脂蛋白形 成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。
❖ 此法对膜结合的酶的提取是相当有效的，但对 其他蛋白质则易使之变性，甚至切断肽链。
❖ 必要时还可选择电泳法。
8.2 材料的选择与处理
❖ 含量高 ❖ 容易得到 ❖ 干扰物质少 ❖ 价格便宜 ❖ 容易分离 ❖ 安全性好
❖ 清理除杂 ❖ 冷冻 ❖ 干燥 ❖ 浓缩
❖ 含量高 ❖ 容易得到 ❖ 干扰物质少 ❖ 价格便宜 ❖ 容易分离 ❖ 安全性好 ❖ 提取工艺简单 ❖ 有综合利用价值
❖ 对动物材料的效果比微生物材料和植物材料要 好。
(3)渗透压法（高渗或低渗处理）
❖ 渗透压就是用来抗衡渗透倾向所需的一种力。
❖ 先将细胞置于高渗溶液(如蔗糖溶液)中平衡 一段时间后，突然将其转入到低渗缓冲液和水 溶液中，则细胞壁会因渗透压的突然变化而破 碎。
❖ 此法只适于处理细胞壁比较脆弱的细胞。
8.3 细胞破碎
❖ （1）碾磨法/组织捣碎法 ❖ （2）超声波破碎法（10-15KHz） ❖ （3）渗透压法（高渗或低渗处理） ❖ （4）冻融法
❖ （5）表面活性剂处理法（SDS、Tween、TritonX） ❖ （6）细胞自溶法（利用细胞自身的酶） ❖ （7）丙酮法（冷丙酮脱水抽提） ❖ （8）酶处理方法
（1）碾磨法/组织捣碎法
❖ 是最普通和常见的细胞破碎方法。 ❖ 既可以使用普通的高速组织捣碎机、细胞匀浆
器，也可使用专门的用于微生物细胞破碎的细 菌磨等。
(2)超声波破碎法
❖ 使用专一的超声波破碎仪，利用仪器所产生的 超声波（10~15kHz）机械震动后对组织细胞产 生的空化作用（Cavitation）使细胞破碎。
❖ 当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当 方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白质分离开 来。
❖ 一般这一步的分级用盐析、等电点沉淀和有机 溶剂分级分离等方法。
❖ 第三步是细分级(fine fractionation)，也就是样品 的进一步提纯。
❖ 样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白大 部分已被除去。
❖ 提取的温度要视有效成份性质而定。
❖ 一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高 而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时 间。
❖ 但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活， 因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般 采用低温（5度以下）操作。
❖ 为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋 白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸 等）。
分离纯化的前期步骤优秀课件
生化物质的制备和分离纯化
❖ 分离纯化的一般步骤 ❖ 选材 ❖ 细胞破碎 ❖ 抽提 ❖ 分离纯化 ❖ 结晶 ❖ 纯度鉴定 ❖ 保存
8.1 分离纯化的一般步骤
❖ 选材 ❖ 细胞破碎 ❖ 抽提 ❖ 分离（沉淀法、离子交换法） ❖ 纯化 （分子筛、电泳） ❖ 结晶 ❖ 纯度鉴定 ❖ 保存
❖ 分离提纯某一特定蛋白质的一般程序可以分为 ❖ 前处理 ❖ 粗分级 ❖ 细分级
❖ 第一步是前处理(pretreatment)。
❖ 分离提纯某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原 来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并 保持原来的天然状态，不丢失生物活性。
❖ 第二步是粗分级(rough fractionation)。
蛋白质（包括酶）的提取
❖ 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶 液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙 酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶 剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法
❖ 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、 溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常 用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的 搅拌，以利于蛋白质的溶解。
选材
❖ 微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料， 所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物， 应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核 酸的含量较高，可以获得高产量，
❖ 以微生物为材料时有两种情况:
❖ （1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞 外酶等；
❖ （2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞 内酶等。
❖ 植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长 发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大， 另外与季节性关系密切。
❖ 对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织 为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。
❖ 另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷 冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制 备。
（6Fra Baidu bibliotek细胞自溶法
❖ 利用细胞自身的酶
(7)丙酮法（冷丙酮脱水抽提）
❖ 丙酮等脂溶性溶剂可溶解细胞膜上的脂质化合 物，从而使细胞膜的结构破坏。
❖ 一般是将细胞制成丙酮干粉后，再加提取酶。
(8)酶处理方法
❖ 用外源的溶菌酶或细胞壁分解酶(如蛋白酶、脂 肪酶、核酸酶等)在一定条件下作用于细胞而使 细胞壁破碎。
❖ 但这种方法因需外加酶制剂，因此可能会对后 续目的酶的提取产生不利的影响。
8.4 抽提
❖ 物质的抽提常常和细胞破碎步骤协同进行 ❖ 根据被提取物质的溶解特性，选择适当的溶剂 ❖ 始终保持低温操作，防止生物活性物质变性 ❖ 提取的原则是“少量多次” ❖ 尽量去除干扰物质 ❖ 防止水解酶的作用 ❖ 加入一定的保护试剂 ❖ 其他影响因素：pH、溶剂极性与离子强度等
❖ 下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
❖ 1、pH值
❖
蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液 的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。
❖ 用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白 质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可 逆变化，
❖ 一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸 性蛋白质用偏碱性的提取液。
(4)冻融法：
❖ 将细胞在低温(-15℃)下冰冻后再在室温下融化， 如此反复多次就能使细胞壁破裂。此法也只适 用于胞壁易破的细胞。
(5)表面活性剂处理法：
❖ 在适当的温度、pH及低离子强度下，表面活性 剂（如SDS、Tween、TritonX）能与脂蛋白形 成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。
❖ 此法对膜结合的酶的提取是相当有效的，但对 其他蛋白质则易使之变性，甚至切断肽链。