思考题

第一章：基因工程概述
2．基因工程的三大要素是什么
3．重组DNA技术的五大单元操作过程分别是什么
4．简述外源基因稳定高效表达的主要战略思想
6．试比较四代基因工程的基本定义
7．如何理解重组DNA的安全性
8．简述基因工程（包括重组DNA技术）的三大用途。

第二章：DNA重组克隆的单元操作
1．用于DNA重组克隆的载体的功能是什么
2．质粒DNA和病毒（噬菌体）DNA作为载体的主要特征是什么
3．如何理解质粒的不相容性及其在DNA重组克隆过程中的运用意义
4．列举表达质粒、穿梭质粒、探针质粒和cos质粒的不同用途
5．II类限制性核酸内切酶的主要酶学特征是什么
6．在DNA重组克隆实验中为什么通常使用T4-DNA连接酶而不用其他连接酶
7．KLenow酶与大肠杆菌DNA聚合酶I在结构和功能上的主要区别
8．影响限制性核酸内切酶活性的主要因素有哪些？
9．如何理解粘性末端比平头末端更容易连接
10．在重组DNA技术中常使用的微生物转化方法有哪些？
11．为什么外源DNA难以转化野生型的微生物受体细胞
12．简述转化率和重组率的基本概念以及在DNA重组克隆实验中的指导意义。

13．简述转化子筛选与重组子鉴定的三大基本战略
14．探针、引物、接头的物质基础和用途分别是
15．简述分离克隆目的基因四大战略及其适用范围
16．简述基因文库的基本概念以及构建技术要点。

第三章：大肠杆菌的基因工程
7．简述包涵体复性工作的原理
9．简述大肠杆菌工程菌遗传不稳定性的主要表现形式和解决途径
酶系
用于核酸操作的酶有哪些：1限制性核酸内切酶2DNA连接酶3DNA聚合酶4核酸酶5核酸修饰酶
限制性核酸内切酶定义：能够特异性的识别双链DNA某段特殊序列，并切割DNA双链的酶，主要存在于原核细菌中。

主要作用有:1保护自身的DNA不受限制2破坏外源DNA使之迅速降解
限制性核酸内切酶的命名：属名+种名+株名寄主微生物属名的头一个字母（大写）种名前两个字母（小写）
II类限制性核酸内切酶特性：特异性识别特定回文序列，并在识别序列里或附近切割DNA双链。

一般会产生3’-OH粘性末端（Pst1）、或5’-P粘性末端（EcoR1）、或平头末端（Pvu11）
1U限制性核酸内切酶活性：在最适宜条件下反应1小时，完全水解1微克双链标准DNA所需的限制性核酸内切酶的量
不同盐度选择同时酶切还是先后酶切，处理：盐度相同：同时酶切，注意识别位点盐度不同，若要同时酶切，则选择贵重酶盐度，加大普通酶浓度，不同时酶切：先低盐度后高盐度或者先用一种缓冲液，再换一个缓冲液。

影响限制性核酸内切酶活性的因素：1物理因素：温度 pH等2DNA分子的纯度3DNA分子的甲基化程度（有识别序列，限制酶不一定能酶切成功）4缓冲液的性质。

（反应体系甘油浓度不能超过50%）
Star activity：指在极端条件下，限制性核酸内切酶的特异性降低，可以识别和剪切相似或类似序列的现象。

DNA连接酶：可以修复DNA双链的Nick的酶DNA连接酶不能够连接两条单链DNA分子，也不能连接环状单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。

（只能修补Nick，不能修补Gap）
T4-DNA连接酶：1可以修复DNA双链的Nick 2可以修复DNA-RNA杂交双链的Nick 3 可以连接平头末端
1U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全连接1微克λ-DNA所需要的DNA连接酶酶的数量。

为什么粘性末端连接比平头连接简单：因为在复性条件下，粘性末端之间的连接属于分子内反应，而平头末端间的反应属于分子间反应，所以反应速度慢得多。

粘性末端（低温连接，有利于氢键形成）平头末端（37℃高温连接增加末端碰撞几率）
5’-3’DNA聚合酶活性：单链DNA模板，带3’-OH的DNA引物
3’-5’核酸外切酶活性：切割5’-P端的双链上的核苷酸
5’-3’核酸外切酶活性：校正作用
DNA聚合酶：以一DNA单链为模板合成另一条链时，起将dNTP连接到链上的酶的分子。

大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA pol 1）缺口前移标记法（Nick translation）制备32P标记的探针：当双链DNA出现缺口时，DNA聚合酶的5’-3’DNA聚合酶活性会在3’-OH端开始添加脱氧核糖核苷酸（用α-32P-dATP 标记即可），而与此同时3’-5’DNA外切酶活性会从5’-P端将切除原有的核苷酸，从而切口前移。

Klenow酶：大肠杆菌DNA聚合酶I经过枯草杆菌蛋白酶处理后的C端2/3的大肽段，有5’-3’DNA聚合酶活性3’-5’核酸外切酶活性。

用途：1补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端2在cDNA克隆中，用于合成第二链3应用sanger双脱氧链末端终止法进行DNA测序
T4-DNA聚合酶1.5’-3’的DNA聚合酶活性和3’-5’的核酸外切酶活性2.无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切→切除3’-OH粘性末端3.只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止。

4.四种dNTP都在时DNA聚合酶活性占主导地位。

反转录酶5’-3’聚合活性用mRNA的poly（A）做模板，合成cDNA。

核酸酶
单链核酸内切酶：S1核酸酶来自稻谷曲霉素 Zn2+为必须[注意限制性核酸内切酶为Mg2+] 内切单链DNA或RNA 带有Nick的，切除；带有gap的，切除。

单链内切双链外切核酸酶：Bal31核酸酶来自艾氏交替胞菌 Ca2+依赖有Nick，Gap切除，完整双链的话进行外切。

用途：诱发DNA连续缺失突变，可以探测基因的左边界和右边界，基因定位；缩短DNA分子长度
核酸修饰酶：
末端脱氧核苷酰转移酶：TdT Mg2+依赖时给外源DNA片段及载体分子加上互补的同聚尾巴。

平末端必须是Co2+作用下TdT才能使得其发生反应。

碱性磷酸单酯酶CIP BAP催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，换成5’-OH 作用有：在DNA体外重组中为了防止线性化载体分子发生自我环化，用该酶处理即可。

T4多核苷酸磷酸激酶T4-PNP和碱性磷酸单酯酶合作使用，可以做到末端标记。

主要思路是，先用碱性磷酸单酯酶处理掉5’-磷酸端，再用T4-多核苷酸磷酸激酶处理，加上5’-同位素标记的磷酸基团。

适用于单链，双链，DNA RNA。