PFGE原理及参数设置..

影响分辨率的因素
影响分辨率的因素包括：脉冲时间、电场夹角、电场强度、 电影温度、缓冲液以及电泳时间等。在脉冲场凝胶电泳中 通常包括脉冲时间、电场强度、温度、缓冲液组成、琼脂 糖类型和浓度以及电场夹角等参数而只是改变脉冲时间来 控制分辨样品的范围，即通过增加脉冲时间分离较大分子， 减少脉冲时间来分离较小分子。
大部分基于CHEF脉冲场凝胶电泳系统的操作手册使用 的电场夹角为120度。
电场角度
120 °
2.2 Mb 1.6 Mb
105 °
100 °
96°
94° 随着电场角度的减 少，两个大片段分 的更开。但是同时 小片段也在逐渐的 压缩。所以为了兼 顾不同大小的片段 需要选择一个合适 的电场角度。
大部分基于CHEF脉冲场凝胶电泳系统的操作手册使用的电场夹角为120。
脉冲时间
脉冲时间是指电场在某个角度持续的时间。
例如：脉冲时间为30s，即电场方向将会在30s变换一次。脉冲时
间是脉冲场电泳的核心参数。通常实验中使用的脉冲时间为一个范 围值如：2－20S。这样是为了使一定范围内的DNA片段都可以得 到理想的分离。这种脉冲时间的变换可以是线性的或者是非线性的。 线性是指脉冲时间在一定的电泳时间内是均匀变换的；而非线性的 变换可以使一定的脉冲时间相对集中，从而使相应大小的片断得到 更好的分离。
PFGE原理及相关参数
目前常用的脉冲场凝胶电泳仪器为箝位匀强电场系统（contour-clamped homogeneous electric field, CHEF）
方框代表琼脂糖凝胶，一排长方形小框代表DNA加样孔，六边形代表CHEF系 统的电极（4X6）。当电泳工作时，DNA分子以箭头方向迁移。
通常使用的缓冲液的温度为12℃－15℃。在这个温度内
可以最好的兼顾电泳时间和分辨率。
琼脂的种类以及琼脂的浓度
使用的琼脂糖浓度越低，所能分离的DNA片段越大。但
是琼脂的浓度低，其机械强度也低，实验操作中的难度
也会加大。 在脉冲场凝胶电泳中使用的琼脂糖应当具备以下的特点： 1、机械强度大，利于实验操作 2、纯度高，高纯度的琼脂可提高电泳的分辨率
PFGE操作基本流程
PFGE操作的基本流程—革兰氏阴性菌
PFGE操作的基本流程
相对于容易破壁 的革兰氏阴性菌， 革兰氏阳性菌通 常需要使用溶菌 酶或者是其他试 剂对其进行预先 处理。
PFGE聚类分析原则
TENOVER原则与聚类分析
不同研究者对于同样的PFGE带型会有完全不同的解 释，对于这些菌株是否属于暴发相关或者暴发不相关 的菌株也会有完全不同的意见，对于PFGE带型上条 带的差异也有不同的解释。 TENOVER原则是在没有使用软件进行分析的时候 PFGE带型解释方法。这个标准对于临床实验室分析
基因组DNA的制备
为防止大的DNA片段断裂，PFGE所用的样品是从琼脂
糖包埋活细菌中制备的。预先细菌定量很重要，这是因
为PFGE中的DNA的泳动相对于普通电泳对浓度的要求 更高，过多的DNA会造成泳动异常减慢。
以上是脉冲凝胶电泳的基本原理以及其影响因素， 因为PFGE操作繁琐，其中影响因素很多，因此 需要仔细严格操作。
电场强度
电场强度以V/cm来表示的。因为通常的CHEF型脉冲场
凝胶电泳胶区的长度为33cm，所以200V的电压实际上
为6V/cm。使用较高的电场强度可以分离较大的DNA片 段，反之亦然。
大部分基于CHEF脉冲场凝胶电泳系统的操作手册使用
的电场强度为6V/cm。
缓冲液类型
脉冲场凝集电泳中的缓冲液选择需要考虑两方面的问题：
缓冲液的缓冲能力以及长电泳时间中液体的损耗问题。
பைடு நூலகம்
通常用于脉冲场凝胶电泳的电泳缓冲液包括两种 0.5XTBE和1XTAE，其中1XTAE常用于MB级的DNA片 断的分离（>3MB），而0.5XTBE常用于<1MB的片断
的分离。
电泳温度
脉冲场凝胶电泳通过冷凝以及循环系统实现对电泳缓冲液
的温度控制。
当缓冲液的温度越高，电泳所需要的时间也就越短。但是， 较高的温度会造成条带弥散，影响分辨率。
3、熔点低，包埋细菌时凝胶的温度不易过高
电泳时间
电泳时间需要在分辨率和总的实验时间之间寻找一个平 衡点。因为通常希望尽快完成实验，因此理论上说电泳 的时间越短越好。但是短的电泳时间会降低实验的分辨 率从而影响实验结果。
在PulseNet标准操作中的电泳时间并不是固定的,其要 求是标准菌种H9812中20Kb左右的片段达到胶的下沿11.5cm.
PFGE原理及相关参数
脉冲场凝胶电泳可以分离长至50MB的DNA分子。其原理是DNA分子在交替 变换方向的电场中做出反应的时间取决于它的大小。较小的分子重新定向较 快，因而在凝胶中移动也快，于是不同大小的分子被成功分离。DNA分子在 交替电场作用下的行为可以用分子的延展性和沿电场方向平行泳动前的重新 定向解释。DNA分子以蠕行（reptation）方式在琼脂糖凝胶的连续孔洞中迁 移。当电场变换方向时，DNA分子在新的方向泳动前必须再定向。所以，电 场方向有规律地变换，DNA也必须有规律地改变泳动方向。分子越大重新定 向需要的时间越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少， 最终达到了分离的目的。
PFGE分型技术和技术参数设置
金东 2010年6月
PFGE原理及相关参数
PFGE原理及相关参数
超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同 速率迁移。大于该极限长度后DNA的迁移速度几乎与分子 大小无关。当DNA分子的有效直径超过凝胶孔径时，卷曲 的DNA分子在电场作用下会沿电场方向拉伸变形挤过筛孔， 凝胶介质的分子筛效应不明显，此时DNA分子在电场中的 迁移速度主要取决于电场强度。 有实验证明长度大于40KB的DNA分子不能在恒强水平琼脂 糖凝胶电泳中分离。
脉冲时间—不同脉冲时间对带型的影响
随着大脉冲时间的缩短 大片段的位置也在逐渐 靠近加样孔，同时小片 段也有不错的分离效果。
2.2-54.2s
2-35s
2-30s
2-25s
电场夹角
使用较小的电场夹角可以分离较大的DNA片段，而大的 电场夹角分离较小的片段。当使用较小的电场夹角时， 小片段会变的相对集中。