瓯柑褐斑病病原鉴定
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１ ３ 病 原 菌 的 鉴 定 ．
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
经致病 性测定 证 实上述 菌株具 致病 性后 ，通过
培养性 状和 子实 体 的形 态学 以及基 因序 列鉴定 病原 种 类 。具体 为 ：肉眼 观 察 分 离物 在 Ｐ Ａ培 养 基 上 Ｄ 的菌 落特征 ，测 量菌 落直径 、计算 生长 速率 ；显微 镜 （ ｉｏ ｃｏｃｐ Ｃ ＩＳ ８ ｉ Ｎｋｎ Ｍｉ ｓｏ ｅＥ ＬＰ Ｅ ０ 显微 镜 ） 下 观察 ｒ 病斑 或培养 条件 下产 生 的分 生孢 子 梗 和分 生 孢 子 ， 记 录 形 态 特 征 ，测 量 大 小 （ 菌 株 ３ 每 ０个 以上 ） ； 提取基 因组 各 菌 株 的基 因组 Ｄ Ａ，扩增 、克 隆 和 Ｎ
测 定 多 聚 半 乳 糖 醛 酸 酶 ｅｄ Ｐ ｎ ｏ Ｇ基 因部 分 序 列 。
１ １ 病 菌的分 离培 养 ． 用 手 术 刀 片从 发 病 叶 片 的病 斑 上 刮下 分 生 孢
子 ，制 备成孢 子悬 浮液 ，根据 方 中达植病 研究 方法 进 行单 胞分 离 Ｊ ，培养基 为添加 ５ ｇ・ 的链 ０ ｔ ｍＬ ｘ 霉 素和 氨 苄青 霉 素 的 Ｐ Ａ，枝 梢 和 果 实 病 斑 上 产 Ｄ 生 的分 生孢 子 较 少 ，则 使 用 组 织 分 离 ，培 养 获 得 分生 孢 子 后再 进 行 单 胞 分 离 。 纯 化 菌 株 培 养 在 Ｐ Ａ斜 面 ，４℃保存 。 Ｄ
定 ，证 实 了 田间诊 断 。现将 鉴定结 果报道 如下 。
１ 材 料 与 方 法
１ｍｉ） ｎ ，弃 上 清 液 ，加 适 量 无 菌 水 悬 浮孢 子 ，配制成 １ ～ １ 。 ・ 的 孢子 悬 浮 液 （ ０ ０ 个 ｍＬ 血
ｍ ｌ ～ ‘ ｎ
，
球计数 板 ） ，吸 取 ２ ５ Ｌ滴 在幼 叶上 。同时 ，接种 ． 空 白无菌水 作 为对 照 。托盘 口封 上保鲜 膜保湿 ，置 ２ ７℃的培 养箱 中诱导 发病 。
中 图分 类 号 ：Ｓ４ ６ ６ ３ ． ６ 文 献标 志码 ：Ａ 文 章 编 号 ：０ ２ —０ ７ ２ １ ） ９ １ ８ — ５ ８ ９ １ （ ０ ２ ０ —２ １０ ２
瓯 柑 （ ｉｕ ｓａｉ ｉａ Ｈ ｒ ｅ ａ ａ ａ 是 温 Ｃｔ ｓ ｕ ｖ ｓ ｏ ． ｘＴ ｎ ｋ ） ｒ ｓｍ ｔ
：
兰 ± 垒！ 兰
！： 竺
圆
文 献著 录格 式 ：黄 峰 ，朱 丽 ，侯 欣 ，等 ．瓯 柑 褐 斑 病 病 原 鉴 定 ［ ］ 浙 江 农业 科 学 ，２ １ （ ） ２ １ ２ ２ Ｊ． ０２ ９ ：１８ —１ ８
瓯 柑 褐 斑 病病 原 鉴 定
黄 峰 ，朱 丽 ，侯 欣 ，李红 叶
孢 子悬 浮液 ，经 双层 纱 布 过滤 、离心 （ ００ ０ ｒ・ １ ０
州 瓯海 地 区的传统 栽培 品种 ，至 今 已有 １０ ０多年 ０
的栽 培 历史 ，主产 浙江 温州 ，近年 浙江丽 水也 有较
大规 模 的种 植 ，在 当 地 素 有 “ 林 皆 橘 树 ，无 水 有 不荷花 ” 的 诗 句 。此 外 ，福 建 、广 西 等 地 也 有 少 量 栽培 ¨ 。２ １ ０ １年 ５月 中旬 ，温 州 和 丽水 瓯 柑 普 遍 突发 落 叶 、落果 和枯 梢现 象 ，严重果 园 ，株发病 率 几 乎 是 １ ０ ， 当年 抽 发 的 春 梢 顶 部 发 黑 、枯 ０％ 死 ，仅 留下基 部少 量 叶片 ，幼果脱 落所 剩无几 。实 地 考察 了温州 市永 嘉县 上塘镇柯 师 湾村瓯 柑示 范基 地 、瓯 海 区泽 雅镇 丰伟 瓯柑 种植 场 以及 丽水 市莲都 区老竹镇 丽新 畲族 自治 乡双坑 村 ３个瓯柑 园 ，发现 病 害 的 田间症 状 与最 近在重 庆万 州发现 的红 橘褐斑 病极 为 相似 。为证 实这 个推 测 ，本文从 这 ３个果 园采集 发 病 的 叶 片 、枝 梢 和果 实 ，带 回实 验 室 鉴
ｌ ｘｇ２ （ 水 ，瓯 柑 ） 和 ｌｘ ｇ２ （ 水 ，槿 ｓ ｏｙ １ 丽 ｌ ｓ ｐｙ １ 丽 ｌ 柑 ） 进 行 接 种 试 验 。采 集 健 康 幼 嫩 的 桠 柑 （ ． ｃ ｒｔｕａａＢａ ｃ ｖ ａ ｋｎ 叶 片 ，用 自来 水 冲洗 ｅｃｌｔ ｌ ｏｃ．Ｐ ｎ ｏ ） ｉ ｎ 干净 ，再用 ７ ％ 的 酒 精擦 拭 ３ ～ ５次 ，晾 干 ，置 ５ 于垫 有吸水 纸 的托盘 中 ，以备接 种 。向 已产 生分 生 孢子 的培养 皿 （ ２ ｈ光 暗 交 替 ，１ ） 加 入 ３ｍＬ １ ０ｄ 无菌 水 ，用 灭 菌玻璃 棒刮擦 菌落 ，获得 带菌 丝 的粗
３０ ５ ） １０ ８ （ 浙江 大 学 生 物技 术 研 究 所 ，浙 江 杭 州
摘 要 ：为 鉴 定 温 州 和 丽水 地 区所 发 生 的 柑 橘 病 害 类 型 ，本 研 究 从 当地 多 个 果 园 进 行 采 样 ，检 查 和 分 离 培 养 获 得 大 量 的 链 格 孢 菌 株 （ ｌｒａｉ） Ａｔ ｎ ｒ 。致 病 性 试 验 证 明 这 些 链 格 孢 菌 中大 部 分 能 够 引起 类 似 褐 斑 症 状 。对 其 菌 ｅ ａ 株 进 行 形 态 学 和 培 养 性 状 的 观 察 ，并 扩增 其 多 聚半 乳 糖 醛 酸 酶 （ｎｏ Ｇ 基 因 的 部 分 序 列 进 行 分 析 ，确 定 该 病 ｅｄＰ ） 害的病原为交链格孢菌 （ ．ａ ｅ ａ （ ｒ）Ｋ ｉ ｌ ） ｌｒ ｔ Ｆ． ｅ ｓ ｒ ，该 病 害系 柑 橘 褐 斑 病 。 ｔｎ ａ ｓｅ 关 键 词 ：瓯 柑 ； 斑 病 ； 原 鉴 定 ； 链 格 孢 菌 褐 病 交
１２ ． 致 病 性 测 定
获 得 的 序列 到 ｈｔ ：／ ｗ ｗ ｃ ｉ ｎｍ．ｎｈ ｏ ｔ ｐ ／ ｗ ．ｎ ｂ． ｌ ｉ．ｇｖ
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
经致病 性测定 证 实上述 菌株具 致病 性后 ，通过
培养性 状和 子实 体 的形 态学 以及基 因序 列鉴定 病原 种 类 。具体 为 ：肉眼 观 察 分 离物 在 Ｐ Ａ培 养 基 上 Ｄ 的菌 落特征 ，测 量菌 落直径 、计算 生长 速率 ；显微 镜 （ ｉｏ ｃｏｃｐ Ｃ ＩＳ ８ ｉ Ｎｋｎ Ｍｉ ｓｏ ｅＥ ＬＰ Ｅ ０ 显微 镜 ） 下 观察 ｒ 病斑 或培养 条件 下产 生 的分 生孢 子 梗 和分 生 孢 子 ， 记 录 形 态 特 征 ，测 量 大 小 （ 菌 株 ３ 每 ０个 以上 ） ； 提取基 因组 各 菌 株 的基 因组 Ｄ Ａ，扩增 、克 隆 和 Ｎ
测 定 多 聚 半 乳 糖 醛 酸 酶 ｅｄ Ｐ ｎ ｏ Ｇ基 因部 分 序 列 。
１ １ 病 菌的分 离培 养 ． 用 手 术 刀 片从 发 病 叶 片 的病 斑 上 刮下 分 生 孢
子 ，制 备成孢 子悬 浮液 ，根据 方 中达植病 研究 方法 进 行单 胞分 离 Ｊ ，培养基 为添加 ５ ｇ・ 的链 ０ ｔ ｍＬ ｘ 霉 素和 氨 苄青 霉 素 的 Ｐ Ａ，枝 梢 和 果 实 病 斑 上 产 Ｄ 生 的分 生孢 子 较 少 ，则 使 用 组 织 分 离 ，培 养 获 得 分生 孢 子 后再 进 行 单 胞 分 离 。 纯 化 菌 株 培 养 在 Ｐ Ａ斜 面 ，４℃保存 。 Ｄ
定 ，证 实 了 田间诊 断 。现将 鉴定结 果报道 如下 。
１ 材 料 与 方 法
１ｍｉ） ｎ ，弃 上 清 液 ，加 适 量 无 菌 水 悬 浮孢 子 ，配制成 １ ～ １ 。 ・ 的 孢子 悬 浮 液 （ ０ ０ 个 ｍＬ 血
ｍ ｌ ～ ‘ ｎ
，
球计数 板 ） ，吸 取 ２ ５ Ｌ滴 在幼 叶上 。同时 ，接种 ． 空 白无菌水 作 为对 照 。托盘 口封 上保鲜 膜保湿 ，置 ２ ７℃的培 养箱 中诱导 发病 。
中 图分 类 号 ：Ｓ４ ６ ６ ３ ． ６ 文 献标 志码 ：Ａ 文 章 编 号 ：０ ２ —０ ７ ２ １ ） ９ １ ８ — ５ ８ ９ １ （ ０ ２ ０ —２ １０ ２
瓯 柑 （ ｉｕ ｓａｉ ｉａ Ｈ ｒ ｅ ａ ａ ａ 是 温 Ｃｔ ｓ ｕ ｖ ｓ ｏ ． ｘＴ ｎ ｋ ） ｒ ｓｍ ｔ
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兰 ± 垒！ 兰
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文 献著 录格 式 ：黄 峰 ，朱 丽 ，侯 欣 ，等 ．瓯 柑 褐 斑 病 病 原 鉴 定 ［ ］ 浙 江 农业 科 学 ，２ １ （ ） ２ １ ２ ２ Ｊ． ０２ ９ ：１８ —１ ８
瓯 柑 褐 斑 病病 原 鉴 定
黄 峰 ，朱 丽 ，侯 欣 ，李红 叶
孢 子悬 浮液 ，经 双层 纱 布 过滤 、离心 （ ００ ０ ｒ・ １ ０
州 瓯海 地 区的传统 栽培 品种 ，至 今 已有 １０ ０多年 ０
的栽 培 历史 ，主产 浙江 温州 ，近年 浙江丽 水也 有较
大规 模 的种 植 ，在 当 地 素 有 “ 林 皆 橘 树 ，无 水 有 不荷花 ” 的 诗 句 。此 外 ，福 建 、广 西 等 地 也 有 少 量 栽培 ¨ 。２ １ ０ １年 ５月 中旬 ，温 州 和 丽水 瓯 柑 普 遍 突发 落 叶 、落果 和枯 梢现 象 ，严重果 园 ，株发病 率 几 乎 是 １ ０ ， 当年 抽 发 的 春 梢 顶 部 发 黑 、枯 ０％ 死 ，仅 留下基 部少 量 叶片 ，幼果脱 落所 剩无几 。实 地 考察 了温州 市永 嘉县 上塘镇柯 师 湾村瓯 柑示 范基 地 、瓯 海 区泽 雅镇 丰伟 瓯柑 种植 场 以及 丽水 市莲都 区老竹镇 丽新 畲族 自治 乡双坑 村 ３个瓯柑 园 ，发现 病 害 的 田间症 状 与最 近在重 庆万 州发现 的红 橘褐斑 病极 为 相似 。为证 实这 个推 测 ，本文从 这 ３个果 园采集 发 病 的 叶 片 、枝 梢 和果 实 ，带 回实 验 室 鉴
ｌ ｘｇ２ （ 水 ，瓯 柑 ） 和 ｌｘ ｇ２ （ 水 ，槿 ｓ ｏｙ １ 丽 ｌ ｓ ｐｙ １ 丽 ｌ 柑 ） 进 行 接 种 试 验 。采 集 健 康 幼 嫩 的 桠 柑 （ ． ｃ ｒｔｕａａＢａ ｃ ｖ ａ ｋｎ 叶 片 ，用 自来 水 冲洗 ｅｃｌｔ ｌ ｏｃ．Ｐ ｎ ｏ ） ｉ ｎ 干净 ，再用 ７ ％ 的 酒 精擦 拭 ３ ～ ５次 ，晾 干 ，置 ５ 于垫 有吸水 纸 的托盘 中 ，以备接 种 。向 已产 生分 生 孢子 的培养 皿 （ ２ ｈ光 暗 交 替 ，１ ） 加 入 ３ｍＬ １ ０ｄ 无菌 水 ，用 灭 菌玻璃 棒刮擦 菌落 ，获得 带菌 丝 的粗
３０ ５ ） １０ ８ （ 浙江 大 学 生 物技 术 研 究 所 ，浙 江 杭 州
摘 要 ：为 鉴 定 温 州 和 丽水 地 区所 发 生 的 柑 橘 病 害 类 型 ，本 研 究 从 当地 多 个 果 园 进 行 采 样 ，检 查 和 分 离 培 养 获 得 大 量 的 链 格 孢 菌 株 （ ｌｒａｉ） Ａｔ ｎ ｒ 。致 病 性 试 验 证 明 这 些 链 格 孢 菌 中大 部 分 能 够 引起 类 似 褐 斑 症 状 。对 其 菌 ｅ ａ 株 进 行 形 态 学 和 培 养 性 状 的 观 察 ，并 扩增 其 多 聚半 乳 糖 醛 酸 酶 （ｎｏ Ｇ 基 因 的 部 分 序 列 进 行 分 析 ，确 定 该 病 ｅｄＰ ） 害的病原为交链格孢菌 （ ．ａ ｅ ａ （ ｒ）Ｋ ｉ ｌ ） ｌｒ ｔ Ｆ． ｅ ｓ ｒ ，该 病 害系 柑 橘 褐 斑 病 。 ｔｎ ａ ｓｅ 关 键 词 ：瓯 柑 ； 斑 病 ； 原 鉴 定 ； 链 格 孢 菌 褐 病 交
１２ ． 致 病 性 测 定
获 得 的 序列 到 ｈｔ ：／ ｗ ｗ ｃ ｉ ｎｍ．ｎｈ ｏ ｔ ｐ ／ ｗ ．ｎ ｂ． ｌ ｉ．ｇｖ