大肠杆菌及菌落总数

所谓细菌总数是指1mL 或 1g 检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平 板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落 (colony-forming unit ， cfu) 数，故 其单位应是

cfu/g(mL) 。它反映的是检样中活菌的数量。

所谓大肠菌群，是指在37r 24h 内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰

氏阴性无芽胞杆菌的总称， 主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成， 即埃希氏杆

菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。水中大肠菌群的检验方法，常 用多管发酵法和滤膜法。 多管发酵法可运用于各种水样的检验， 但操作繁琐， 需

较多、易于阻塞滤孔的水样。

( 三 ) 实验器材 (1) 菌落总数的测定：

1) 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基

用玻棒挑取， 放在小烧杯或表面皿中称量，

量杯中，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然 后立即取出纸片。在上述烧杯中先假如少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后， 加入琼脂， 再在石棉上加热使其溶解。 将药品完全溶解后， 补充水到所需的总体 积。在未调pH 前，先用精密pH 式纸测量培养基的原始pH,如果偏酸，用滴管向培 养基中逐滴加入1mol/L NaOH,边加边搅拌，并随时用PH 式纸测其PH ，直至PH 达 7.6。反之，用 1moI/LHCL 进行调节。

无菌生理盐水：需用生理盐水浓度是O.9%:称取O.9克氯化钠，溶解在少量蒸 馏水中，稀释到

1OO 毫升。

量筒 玻璃棒 电热炉 称量杯 灭菌三角瓶 灭菌的具塞三角瓶 灭菌平皿 灭菌吸管 灭菌试管

高压蒸气灭菌： 1.将内层锅去处， 再向外层锅中加入适量的水， 使水面与三角架

相平为宜。

2. 放回内层锅，并加入要灭菌的培养皿、试管、烧杯等物品（注

意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果）。

要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，

操作简单、快速，但不适用于杂质

牛肉膏 3.0 g 蛋白胨 lO.Og NaCI 5.0g

水 lOOOmL pH7.4 〜7.6

将培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、

蛋白胨、NaCI 放入烧杯中，牛肉膏常 用热水溶化后到入烧杯。 也可放在称

2) 器材试剂：牛肉膏

蛋白胨 NaCI 1moL/LNaOH

1moL/LHCL 灭菌水

高压蒸气灭菌锅 培养皿 三角烧瓶 带玻璃塞瓶

天平 试管 牛角匙

pH 试纸( pH5.5-9.O ) 棉花 记号笔

纱布 吸管 麻绳 牛皮纸

3. 加盖，并将盖上的排气管插入内层的排气槽内，再2两两对称

的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

4.本实验用0.1MPa, 121.5 J 20min灭菌。灭菌所需时间到后,

切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至

0”时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品。

（2）大肠菌群的测定；

1）培养基：

①乳糖胆盐蛋白胨培养基：

蛋白胨20g，猪胆盐（或牛、羊胆盐）5g，乳糖10g，

0.04%溴甲酚紫水溶液25mL水1000mL pH7.4。

制法：将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中，校正pH,加入指示剂，分装，每

瓶50mL或每管5ml,并倒置放入一个杜氏小管，115 J灭菌15min。

双倍或三倍乳糖胆盐蛋白胨培养基：除水以外,其余成分加倍或取三倍用量。

②伊红美蓝琼脂培养基：

蛋白胨10g，乳糖10g，K2HPQ 2g，2 %伊红水溶液20Ml, 0.65 %美蓝水溶液lOmL，

琼脂17g，水1000mL pH7.1。

制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装.121C灭菌15min 备用。临用时加入乳糖并熔化琼脂，冷至50-55 J，加入伊红和美蓝溶液，摇匀,

倾注平板。

③乳糖发酵管：

除不加胆盐外．其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基。

2) 器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。

四)实验方法

(1) 水样的采集：

1)自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流

5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。

2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸边5m处，取距水面10-15cm的

深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻

璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。如果不能在2h内

检测的，需放入冰箱中保存。

(2) 细菌总数的测定：

1) 水样稀释及培养：

①按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释:

⑦根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度(饮用水如自来水、深井水等，一般选择1、1:10 两种浓度；水源水如河水等，比较清洁的可选择

1:10、1:100、1:1000 三种稀释度；污染水—被选择1:100、1:1000、1:10000 三

种稀释度)，吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。

③将熔化后保温度45C的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL

并趁热转动平皿混合均匀。

④待琼脂凝固后，将平皿倒置于37C培养箱内培养24± 1h后取出，计算平

皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。

2) 计算方法：

作平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各

平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。

3)计数的报告：

①平板菌落数的选择：

选取菌落数在30-300 之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个重复时，应选取两个平板的平均数。如果一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。若片状菌

落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘 2

以代表整个平板的菌落数。

②稀释度的选择:

a.应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以该稀释倍数报告之（表1 例1）。

b .若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则视二者之比如何来决定。若其比值小于2,应报告其平均数；若比值大于2,贝U报告其中较小的

数字（I例2、例3） 0

C.若所有稀释度的平均菌落均大于300,则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数