技术：石油炼化废水处理技术

技术 | 石油炼化废水处理技术
石油炼化废水是污染较严重和治理领域中处理难度较大的一类工业废水，
其特征是高氨氮，污染物成份复杂、浓度高且多为生物难降解有毒有害有机物，水质、水量的波动幅度大。

相比物理法和化学法，生物法具有去除污染物的种
类多，效率高、抗冲击能力强、处理成本低等优点。

目前，针对可生化性差、可生化利用率低的石油炼化废水，石油炼化企业
通常采用A2/O和A/O等常规生物脱氮工艺技术，但这些技术的氨氮去除负荷低、溶解氧消耗量大，而且由于硝化细菌世代周期长，上述单污泥系统运行方式使
氨氮硝化易受复杂的高浓度有机物影响，运行不稳定。

新型处理技术，如臭氧
氧化技术，电化学和光化学法与氧化剂(如H2O2,O3和Cl2等)结合使用的技术
尽管对于污水的处理和回用方面存在一定的优势，但由于能耗和处理费用较高，生产上尚未大量应用。

厌氧氨氧化是指在厌氧条件下微生物直接以NH4+为电子供体，以NO2-为电子受体的氧化还原反应，产物为N2。

随着水处理技术的不断发展，厌氧氨氧化
技术以其独特的技术优势受到国内外学者的关注。

现阶段国内对于石油炼化废
水的处理工艺研究主要集中在A/O生物法曝气生物滤池、臭氧一曝气生物滤池、三元微电解-Fenton试剂氧化法、臭氧一固定化生物活性炭滤池和悬浮填料移
动床生物膜法等技术，但关于将厌氧氨氧化技术应用到石油炼化废水的处理和探究对其菌群影响的研究较少。

本实验利用已具有高效脱氮性能的厌氧氨氧化一反硝化细菌混培物建立生物脱氮反应器进行连续驯化实验，旨在探究石油炼化废水中COD和毒性物质对于脱氮处理应用过程中厌氧氨氧化一反硝化细菌混培物的影响。

1、实验部分
1.1实验装置
本实验装置由原水箱、上向流移动床厌氧氨氧化反应器、反应器进水泵三部分组成。

原水箱总容积为20L。

反应器材质为有机玻璃，形式为圆筒形，内径为42mm，高为400mm。

反应器底部为厚度70mm的承托层，由粒径为2-20mm 砂砾石组成。

承托层以上装填80mm高的由厌氧氨氧化细菌和反硝化细菌为核心的细菌混培菌块构成有效生化反应区。

反应器的总容积0.5L，有效反应容积0.11L，运行方式采用上向流。

反应器外表面用黑塑料薄膜包裹，以防光线对细菌混培物的负面影响。

反应器进水泵为蠕动泵，额定流量为0.2-2.0L/h。

具体实验装置见图1。

1.2细菌来源
该反应器中所用厌氧氨氧化一反硝化细菌混培物取自已稳定运行6个月的
厌氧氨氧化生物滤池反应器。

生物滤池运行工况:进水温度33℃，进水基质浓
度NH4+-N200mg/L(NO2--N与NH4+-N浓度比为1.0-1.3),TN去除负荷为
13.5kg·(m3·d)-1，三氮化学计量比为NH4+-N去除量:NO2--N去除量:NO3--N
产生量=1:1.34:0.20。

1.3实验原水
实验原水采用人工配制，由石油炼化废水和基础配制原水两部分组成，石
油炼化废水取自天津市大港区某石化企业气浮池出水，基本组分为:NH4+-N浓
度为80mg/L,pH为7.45,COD浓度为675mg/L;基础配制原水由脱除余氯的自来水、NH4Cl,NaNO2,KH2PO4、FeCl3·6H2O和NaHCO3等组成。

配制方法:不同阶段配制的实验原水成分为NH4+-N浓度278.28-
229.93mg/L;NO2--N浓度201.51-319.55mg/L(NH4+-N和NO2--N的浓度据实验
要求按需配制且比例控制在1:1.3左右);KH2PO4浓度10mg/L;NaHCO3浓度
200mg/L;FeCl3·6H2O浓度 4.0mg/L;COD由石油炼化废水带入，不需另行投加。

原水的pH值采用2.0mol/L的HCl进行调节。

原水配制过程中，为了补充微量
元索，另投加体积分数0.17%的灭菌生活污水。

原水成分及反应器运行条件见
表1。

1.4实验方法
实验装置进水流量为0.4L/h，水温为(29士1)℃，通过控制石油炼化废水的添加比例并采用连续进水的方式，将NO2--N与NH4+-N浓度比控制在1.30左右。

通过不同阶段石油炼化废水的添加，实现在不断增大难降解COD及毒性物质浓度的情况下，考察以厌氧氨氧化一反硝化细菌为核心的细菌混培物在脱氮生化过程中对COD和毒性物质的耐受能力。

同时，以第I阶段中NH4+-N去除量和第II阶段中反硝化总脱氮量分别作为衡量厌氧氨氧化细菌和反硝化细菌活性指标和变化标准，探究石油炼化废水中COD及毒性物质对厌氧氨氧化一反硝化细菌混培物的影响。

另外，采用聚合酶链式反应(PCR)技术与倍比稀释法(MPN)相结合的MPN-PCR技术，对驯化前后两类主要细菌进行计数，探究驯化前后菌群的数目变化情况。

考虑到反应体系的水力停留时间为1.25h，而针对该反应体系，重点考察的是石油炼化废水对于细菌混培物的影响而非脱氮效率，所以实验中未控制最终出水指标。

1.5分析项目及检测方法
实验分析过程中涉及到的分析项目及检测方法见表2。

MPN-PCR技术将聚合酶链式反应技术与倍比稀释法相结合，选取不同稀释梯度的样品分别做4组不同稀释度的16个平行样进行PCR扩增，根据扩增产物特征碱基序列的电泳条带确定阳性反应，结果用来计算各样品的阳性反应数确定数量指标，然后从MPN统计计算表中查出相应的细菌近似数。

1.6数据处理及分析方法
当采用分光光度法检测COD时，由于实验原理中采用氧化剂和助催化剂，水样中的还原性物质会与氧化剂进行反应，所以测定时，NO2--N可被氧化剂氧化而使测定值比实际值偏高，因此水样实际COD应扣除由NO2--N所导致的COD 误差。

在水样COD浓度计算中，采用式(1)的数据处理方法以消除NO2--N的影响。

当采用MPN-PCR结果进行分析计算时，按照MPN法的计数原则，计算样品中的细菌数量:统计出现扩增条带的最后3个连续的稀释度(10^x、10^x+1和10^x+2)，根据这3个稀释度平行样中条带的个数作为数量指标(abc)，从“每毫升稀释液的细菌近似值”MPN表中查询对应的数值，采用式(2)的计算公式来计算细菌数量。

每克菌块中的细菌数量(个/g)=(条带数量指标对应的数值x最后3个稀释度中第1个稀释度的稀释倍数x提取的DNA总量)/菌块质量(2)
2、结果分析
2.1驯化过程对脱氮过程的影响
厌氧氨氧化反应可能是厌氧氨氧化细菌主要能量代谢途径，所以反应生化活性主要体现在NH4+-N去除浓度值的变化上。

反硝化细菌在反硝化反应中可以利用多种代谢途径获取能量，所以反应生化活性主要体现在反硝化总脱氮量(NO2--N和NO3--N)上。

根据实验方法中建立的标准，分析石油炼化废水中COD 和毒性物质对于细菌混培物的影响。

各阶段的厌氧氨氧化细菌和反硝化细菌的生化活性见表3。

2.1.1第I一II阶段
图2所示为第I一II阶段的脱氮影响。

实验第I阶段为细菌混培物的适应期，所以采用与菌种原有环境相同(生物滤池运行工况)以缩短适应时间、保障处理效果。

该阶段实验原水中没有添加石油炼化废水，从NH4+-N与NO2--N去除值可以看到厌氧氨氧化反应相对稳定，此时的TN去除负荷为
11.978kg·(m3·d)，而反硝化细菌总脱氮量相对较小，所以该阶段的细菌混培物中主要体现厌氧氨氧化细菌生化活性，而反硝化细菌生化活性存在但不明显。

第II阶段是驯化实验的初始阶段，石油炼化废水的添加比例较小，原水中COD和毒性物质浓度均较低。

从图2中可以看到，该阶段中NH4+-N与NO2--N
的平均去除值分别增加了1.643和7.052mg/L，反硝化平均总脱氮量却增加了
3.56倍，同时以吸附作用和反硝化反应为主的去除方式可去除原水COD的61.1%左右，其中反硝化反应的去除比例占到45%左右。

对于由厌氧氨氧化细菌和反
硝化细菌组成的协同脱氮系统，添加的COD对反硝化反应产生了明显的促进作用，而对于厌氧氨氧化反应影响不大，说明该脱氮系统增强了对COD的抗冲击
能力。

2.1.2第III一V阶段
从图3和4可以看出，第III一V阶段中伴随着石油炼化废水添加比例的
增大，原水中COD和毒性物质浓度逐渐增加。

进行分析时，以第I阶段中
NH4+-N除量作为NH4+-N理论去除值，以第II阶段中反硝化总脱氮量作为反硝
化理论总脱氮量，并以此分别作为衡量厌氧氨氧化细菌和反硝化细菌活性指标
和变化标准。

对于厌氧氨氧化细菌，NH4+-N去除平均值出现降低并且变化量逐渐增大，
与NH4+-N理论去除值之间的差距依次增大，并且3个阶段内的NH4+-N去除值
均出现了波动，但稳定性却越来越好。

说明该阶段中厌氧氨氧化细菌生化活性
已经出现了明显的降低且降幅逐渐增大，也表现在整体TN去除负荷依次降低。

由于实验出水中厌氧氨氧化反应的底物NH4+-N和NO2--N均有剩余，所以不断
添加的石油炼化废水中COD和毒性物质对于厌氧氨氧化细菌产生了明显的不利
影响，但随着驯化阶段的进行，细菌混培物对水质产生了一定的适应性;对于反硝化细菌，利用原水中COD进行反应后，细菌生化活性出现了明显增强且脱氮量逐渐增大，但相比反硝化理论总脱氮量的差距越来越大，第V阶段的差量约是第III阶段的2倍，推测由于石油炼化废水添加比例的不断增大，原水中的COD和毒性物质浓度均增大，而进水中可利用的NO2--N和NO3--N充足，所以COD浓度的增大一定程度上对于反硝化细菌产生了有利影响，但毒性物质浓度的增加对反硝化细菌产生了明显的负面作用。

另外，从表3中可以看出，第V阶段细菌混培物中厌氧氨氧化细菌生化活性达到最低点而反硝化细菌生化活性达到最高点，推测原因:一方面是该阶段毒性物质作用显著，厌氧氨氧化细菌的世代时间较长(约为11d)，使得死亡率大于生长率，所以厌氧氨氧化活性出现了明显下降，并且2种细菌之间产生竞争和相互影响;另一方面由于高浓度COD对厌氧氨氧化细菌产生了明显冲击作用，反硝化细菌却可以利用部分COD保持正常的繁殖速率，使得生长率大于毒性物质造成的死亡率，所以反硝化细菌的数量增加对总体生化活性影响不明显，并且此时的混培体系中反硝化细菌相对厌氧氨氧化细菌逐渐成为了优势菌种。

2.1.3第VI阶段
第VI阶段全部由石油炼化废水组成，原水中高浓度的COD和毒性物质均未经过稀释。

从图5和表3中看出NH4+-N平均去除值相比上一阶段增加，阶段内NH4+-N去除值出现波动，并且与NH4+-N理论去除值之间的差距逐渐增大;反硝化平均总脱氮量相比上一阶段减少，阶段内反硝化总脱氮量同样波动明显。

说明该阶段中高浓度COD和毒性物质对于细菌混培物中的厌氧氨氧化细菌和反硝化细菌均产生了明显的不利影响，但由于长时间的运行可能出现了厌氧氨氧化细菌数量的增加或细菌适应性的加强，所以反硝化细菌生化活性可以表现在反硝化平均脱氮量上，脱氮量减少了25.6%，而厌氧氨氧化细菌生化活性则可以表现在氨氮的平均去除值上，增加了2.491mg/L。

2.2驯化过程对菌群的影响
采用分子生物学技术(MPN-PCR)对菌群在驯化阶段前后的变化进行分析，该方法最大的优点在于可以通过进行PCR体外快速扩增靶序列来取代细菌的分离
培养，不但极大地缩短了实验时间，而且对样品中不可培养的细菌种类也可进
行计数，从而使得结果更接近实际数量。

本实验首先在DNA提取方面尝试了改进的十六烷基三甲酸澳化钱
(CTAB)/NaCI化学裂解法、改进的传统蛋白酶K一十二烷基磺酸钠(SDS)一氯仿
异戊醇法(CPSCI法)和改进的溶菌酶-SDS-蛋白酶K细胞裂解法3种提取方法，
采用紫外分光光度法对提取的DNA进行定量测定，分别测定260nm和280nm的
吸光度值，提取DNA的完整性需要通过琼脂糖电泳进行检验。

经琼脂糖电泳验证，3种方法提取的DNA长度均为23kb左右，条带轮廓清晰，亮度适宜，没有
明显的弥散现象，表明提取的细菌基因组DNA质量较高，适用于后续实验。

吸
光度值测量使用UV-2550紫外分光光度计，测量结果如表4。

由表4可以看出3种方法的A260/A280比值都大于1.8,蛋白质去除效率和DNA提取质量较高，3
种方法均能够很好的去除蛋白质等有机杂质。

虽然存在一定程度的RNA干扰，
但并不影响后续PCR的操作。

所有3种方法都不需要进行纯化，可以直接得到PCR扩增产物，说明这3种方法提取DNA是可行的。

从提取的DNA浓度和纯度
两方面，综合考虑最终确定蛋白酶K-SDS法作为提取细菌混培物DNA的方法。

细菌混培物中的厌氧氨氧化细菌和反硝化细菌扩增所使用的引物见表
5,PCR扩增采用25μL体系，各组分:PCRbuffer2.5μL,MgCl22μL,dNTP0.5μL，
上下游引物各1μL,Taq聚合酶0.2μL上海生工合成)，模板1μL，无菌双蒸
水补足至25μL。

PCR扩增采用降落PCR(TD-PCR)技术，采用的扩增程序为:1)厌氧氨氧化细菌:95℃预变性5min;95℃变性30s,60℃退火40s,72℃延伸40s，每个循环退火温度降低0.3℃，以上步骤循环25次;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸
40s，以上步骤循环10次;72℃延伸10min;2)反硝化细菌:95℃预变性5min;95℃变性30s,60℃退火40s,72℃延伸1min，每个循环退火温度降低1.0℃，以上步
骤循环10次;95℃变性30s,50℃退火40s,72℃延伸1min，以上步骤循环20次;72℃延伸10min。

经过一系列实验方法和条件的尝试、摸索和优化，得到适用于该细菌混培物最适的DNA提取、PCR扩增和MPN计数相结合体系。

图6所示是细菌混培物中厌氧氨氧化和反硝化细菌在驯化实验前后计数的电泳图。

通过计算得到驯化前的厌氧氨氧化细菌和反硝化细菌数量为7.549x10^14和3.523x10^6个/g，驯化后的数量分别为8.212x10^8和4.693x10^16个/g。

对比2种细菌在驯化前后的数量，可以看出对于厌氧氨氧化细菌来说，厌氧氨氧化反应可能是厌氧氨氧化细菌主要能量代谢途径，由于世代时间长(约为
11d)、反硝化细菌数量的增加和毒性物质作用的原因，造成厌氧氨氧化细菌数量明显减少和生化活性降低。

而对于反硝化细菌来说，由于反应可以利用多种代谢途径获取能量，所以基质对细菌的影响相对较小，并且利用石油炼化废水中的COD在细菌增殖上没有受到影响而使数量增加，但毒性物质对于反硝化细菌的生化活性产生了明显的抑制。

3、结论
1)厌氧氨氧化细菌和反硝化细菌的混培脱氮体系的脱氮生化活性并未与细菌数目的变化情况呈正相关性变化，说明COD和毒性物质产生了不同程度的影响。

2)厌氧氨氧化细菌比反硝化细菌对于石油炼化废水毒性的作用更敏感。

由于厌氧氨氧化细菌本身世代周期长，所以初期毒性负效应作用较明显，但经驯化后厌氧氨氧化细菌对于高浓度COD和高毒性物质具有一定的适应性。

在石油炼化废水处理中，通过进水负荷的控制，可以实现高于目前常用工艺技术的脱氮效率并实现节能。

3)混培脱氮体系在一定程度上可有效地抵抗石油炼化废水高浓度COD、高毒性物质对于厌氧氨氧化生理、生化脱氮过程的负面影响。

反硝化细菌的存在对于厌氧氨氧化脱氮体系的稳定和出水总氮指标的降低，具有较好的促进和保障作用。