各种酶活性测定方法

各种酶活性测定方法

第一超氧化物歧化酶SOD测定

一、原理

超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD 可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料；水稻或小麦叶片

（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。

（三）试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100μmo l/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA －Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。

三、实验步骤

1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。

2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积

3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。

3. SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。

四、结果计算

已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD 活性。SOD总活性＝(A ck－A E)×V/(A ck×0.5×W×V t)

上式中，SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重。

SOD、POD、CAT、MDA的测定方法-非试剂盒法

缩写：SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶； MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：甲硫氨酸；

NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS: 磷酸缓冲液

1. SOD的测定方法

加样顺序：（V=3ml）磷酸缓冲液：1.5ml L-Met: 0.3ml NBT: 0.3ml

EDTA-Na2: 0.3ml 核黄素：0.3ml 酶液：0.05ml 蒸馏水：0.25ml

试剂配制：

(1) 0.05mol/L PBS：pH7.8

(2) 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用PBS定容至100ml

(3) 750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS定容至100ml(避光保存)

(4) 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用PBS定容至1000ml

(5) 20umol/L核黄素: 0.0753g用蒸馏水定容至1000ml(避光保存)

注：（1）对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管

(2) 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值

2.MDA的测定方法

试剂配制：

（1）5% TCA： 5g用蒸馏水定容至500ml

（2）0.5% TBA：2.5g用TCA定容至500ml

方法：

酶液1ml—3ml0.5%TBA和5%TCA—混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却，10000r/min 离心10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值

3.POD的测定方法

试剂配制：

（1）0.1mol/L的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液

A(0.2mmol/L的HAc溶液)—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中

B(0.2mmol/L的NaAc溶液)—13.6gNaAc.3H2O

（2）0.25%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中（临用前配制）

（3）0.75%H2O2溶液：1.25ml 30% H2O2定容至50ml（临用前配制）

方法：比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液—1ml 0.25%愈创木酚溶液—xml酶液（5min值为500-800即可）—0.1ml 0.75%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min

4.CAT的测定方法

试剂配制：

(1) 50mmol/L的PBS（pH7.0） (2) 0.3% H2O2—1ml H2O2定容至100ml

方法：(1)以不加H2O2的50mmol/L的PBS（pH7.0）为空白把A240调零

(2)50ul酶液—3ml 50mmol/L的PBS（pH7.0）—0.2ml 0.3% H2O2—迅速颠倒混匀，开始计时—1min后在240nm下比色，1次/1min(连续读取5min)。

2010年06月22日星期二 19:33