各种酶活性测定方法
酶活性测定的原理
酶活性测定的原理
酶活性测定的原理是通过测量酶催化下特定底物转化为产物的速率来反映酶的活性水平。
主要有以下几种常用方法：
1. 光度法：利用酶催化下底物与某些试剂反应产生有色产物或吸收物质，通过测量产物的吸光度变化来间接评估酶活性。
例如，过氧化物酶活性的测定可以使用过氧化氢和染色剂底物，通过测量产物有色化合物的吸光度变化来评估。
2. 放射性同位素法：将底物标记上放射性同位素，通过测量酶催化下放射性同位素的放射活性来确定酶活性。
例如，通过添加放射性标记的底物[^3H]葡萄糖，测量酶催化下的葡萄糖转化为[^3H]二氧化碳的速率来评估葡萄糖酶活性。
3. 荧光法：利用酶催化下底物与某些荧光试剂反应产生荧光物质，通过测量产物的荧光强度变化来评估酶活性。
例如，酸性磷酸酶活性的测定可以使用荧光底物4-甲基硝基苯磷酸，通过测量产生的荧光信号来评估酶活性。
4. 比色法：利用酶催化下底物与某些试剂反应产生可测定的颜色变化，通过测量产物的颜色强度来评估酶活性。
例如，硫酸酯酶活性的测定可以使用对硫酸酯类底物水解产生的有色产物对硝基酚，通过测量颜色强度来评价酶活性。
这些方法均基于酶催化下底物转化为产物的反应，并结合了不同的测定原理和技术手段来获取酶活性的定量数据。
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法有多种。
以下列举了常见的几种方法：
1. 酶动力学法：通过测定酶催化底物转化为产物的速率，来确定酶活性。
常用的酶动力学方法有初始速率法、双重倒数法、利用酶反应速率与底物浓度的关系等。
2. 比色法：利用酶与底物反应后产生的色素变化进行酶活性测定。
例如，过氧化物酶活性可通过测量其催化产生的有色产物浓度的变化来确定。
3. 荧光法：利用酶与底物反应后产生的荧光变化进行酶活性测定。
荧光法的灵敏度高，操作简便。
例如，酯酶活性可通过测量底物转化为产物后产生的荧光强度的变化来确定。
4. 放射性同位素法：将放射性同位素标记在底物上，通过测量酶催化底物与同位素的结合来确定酶活性。
例如，放射性同位素法可用于测定DNA聚合酶活性。
5. 电化学法：利用酶与底物反应后产生的电流变化进行酶活性测定。
常用的电化学方法包括循环伏安法和电化学阻抗法。
例如，葡萄糖氧化酶活性可通过测量产生的电流与葡萄糖浓度之间的关系来确定。
值得注意的是，不同酶具有不同的理化性质和催化机制，因此需要根据具体酶的
特性选择适合的测定方法。
各种酶活性测定方法
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。
此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。
因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。
2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。
反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。
每个处理设3 个重复。
（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。
用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。
取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 220mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。
酶的测定方法
酶的测定方法酶是一种生物催化剂，广泛应用于医药、食品、化工等领域。
酶的测定方法是评价酶活性的重要手段。
目前常用的酶测定方法有光度法、荧光法、比色法、电化学法等。
光度法是一种常用的酶测定方法。
该方法利用酶催化反应产生的物质吸收或发射光线的特性来测定酶活性。
例如，酶催化反应产生的NADH可以吸收340nm波长的紫外线光线，因此可以通过测定吸光度来评价酶活性。
光度法具有灵敏度高、操作简便等优点，但也存在一定的局限性，如受到其他物质的干扰等。
荧光法是一种新兴的酶测定方法。
该方法利用酶催化反应产生的荧光物质的特性来测定酶活性。
例如，酶催化反应产生的ATP可以发射荧光，因此可以通过测定荧光强度来评价酶活性。
荧光法具有灵敏度高、特异性强等优点，但也存在一定的局限性，如需要特殊的荧光探针等。
比色法是一种常用的酶测定方法。
该方法利用酶催化反应产生的物质的特性来测定酶活性。
例如，酶催化反应产生的葡萄糖可以与某些试剂发生比色反应，因此可以通过测定比色强度来评价酶活性。
比色法具有操作简便、成本低等优点，但也存在一定的局限性，如受到其他物质的干扰等。
电化学法是一种新兴的酶测定方法。
该方法利用酶催化反应产生的电化学信号的特性来测定酶活性。
例如，酶催化反应产生的电子可以通过电极传递，因此可以通过测定电流或电势来评价酶活性。
电化学法具有灵敏度高、特异性强等优点，但也存在一定的局限性，如需要特殊的电极等。
综上所述，酶的测定方法有多种，每种方法都有其优缺点。
在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的测定方法。
同时，还需要注意测定条件的控制，以保证测定结果的准确性和可重复性。
酶活性测定方法
酶活性测定1、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠）0.2mol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液(pH: 9.6)——buffer0.2mol/L NaOH测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min；(3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
计算：每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.704 (Eu)2、酸性磷酸酶(Acid phosphatase)试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠）0.2mol/L HAc/Ac缓冲溶液(pH: 4.8)——buffer0.2mol/L NaOH测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min；(3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
计算：每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.719 (Eu)3、a-葡萄糖甘酶(a-glucosidase)试剂：0.1% p-nitrophenyl a-D glucopyranoside（p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷）0.2mol/L Tris-HCl (pH: 7.6)测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷及Tris-HCl 37°C 孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL 0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷+2mL Tris-HCl 37°C孵化60 min；(3) 沸水加热3min 终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
酶活性测定方法
一、过氧化物酶（POD）活性的测定POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。
测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。
然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。
在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。
以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。
△470 ×V TPOD活性=0.01×t×Vs×W式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）t----反应的时间（min）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）W----样品鲜重（g）二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。
酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。
PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。
混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。
PPO活性= O D×V T0.01×t×0.5g×V s= O D×V T0.005OD——反应时间内吸光值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）T———反应时间(min)；三、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性的测定参照张志良等(1990)人的方法并稍作改动。
植物五种酶活性检测方法
欢迎阅读选择茶树不同品种，每个茶枝接种5头叶蝉，按不同的时间点(0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h)取样，每个样品重复三次，测定PPO/POD/PAL/CAT/LOX 五种酶活。
1、多酚化酶（Polyphenoloxidase ，PPO ）活性的测定适量茶鲜叶（3g ）,料液比1:2，加入内含5%PVP （w/v ）经遇冷的pH 为7.2的柠檬酸-，取上取 1.2ml （（37℃恒合液。
0.01为2离心20min 取酶提取液0.2ml ，加入由硼酸钠缓冲液配制的0.1mol/LL-苯丙氨酸，2.8ml 蒸馏水，摇匀，在40℃水浴上反应30min ，冰浴中终止反应，测定OD290值，以相同体积缓冲液代替酶液进行同样的反应为对照。
PAL 的酶活性以每小时在290nm 处吸光度变化0.01OD 为一个活力单位。
3、脂氧合酶(linoleate:oxygenoxidoreductase ，LOX )活性的测定取0.2g新鲜样品，加7ml经4℃预冷的1mol/L（pH7.6）的tris-HCL缓冲液冰浴上研磨。
4℃、12000r/min离心25min,上层清液即为LOX酶提取液。
Lox酶活性单位以每分钟在234nm处吸光度变化0.01OD作为一个活力单位。
4、过氧化物酶（PDA）的活性测定（愈创木酚法）取0.5克剪碎叶片于预冷研钵中，加入5ml的提取介质0.05mol/LPH7.8的磷酸缓冲液（含1%PVP[取2-3ml5分ΔA470积（ml，5取（含1%PVP12h。
1000r/min离心20min,得到酶初提液。
取200mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml30%的H2O2（原液）摇匀即可。
取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）。
（测定30s读数一次，5分钟）。
酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。
酶活性的检测方法
酶活性的检测方法
酶活性的检测方法通常包括以下几种常见的技术：
1. 吸收光谱法：利用酶底物与产物在不同波长下的吸光度差异，通过光谱仪测量反应过程中的吸光度变化来检测酶的活性。
2. 色谱法：利用色谱仪对酶底物和产物进行定量分析，可测定酶催化反应中底物和产物的浓度变化，从而确定酶的活性。
3. 比色法：利用对比试剂和酶底物反应后产生的色素溶液颜色深浅的变化来测定酶的活性。
比色法一般适用于检测酶对底物的催化活性。
4. 酶标测定法：利用酶对底物的特异性催化作用来标记或测定其他物质的方法，包括酶联免疫吸附分析（ELISA）和酶标记免疫测定法等。
以上是一些常见的酶活性检测方法，具体的选择取决于酶的特性和所需测定的参数。
值得注意的是，不同酶可能需要不同的检测方法，并且在进行实验时应根据实际情况选择合适的检测方法。
各种酶活性测定方法
各种酶活性测定方法第一超氧化物歧化酶SOD测定一、原理超氧物歧化酶〔superoxidedismutase,SOD〕普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶.本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑〔NBT〕在光下的还原作用来确定酶活性大小.在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收.而SOD可清除O2,从而抑制了甲腙的形成.于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高.据此可以计算出酶活性大小.二、材料、仪器设备与试剂〔一〕材料；水稻或小麦叶片〔二〕仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯〔反应试管处照度为4000Lx〕；5.试管或指形管数支.〔三〕试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液〔pH7.8〕；2. 130mmol/L 甲硫氨酸〔Met〕溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存；4. 100μmo l/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存.三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片〔视需要定,去叶脉〕0.5g于预冷的研钵中,1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml.取 1.5～2ml于1000rpm下离心20min,上清液即为SOD粗提液.2. 显色反应取5ml指形管〔要求透明度好〕4支,2支为测定管,另2支为对照管,按下列加入各溶液：试剂〔酶〕用量〔ml〕终浓度〔比色时〕0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met 溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处,其它各管于4000Lx日光下反应20min〔要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长〕.3. SOD活性测定与计算至反应结束后,以不照光的对照管做空白,分别测定其它各管的吸光度.四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示,按下式计算SOD活性.SOD总活性＝<A ck－A E>×V/<A ck×0.5×W×V t>上式中,SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积〔ml〕Vt测定时样品用量〔ml〕W样鲜重〔g〕蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重. SOD、POD、CAT、MDA的测定方法-非试剂盒法缩写：SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶； MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：甲硫氨酸；NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS: 磷酸缓冲液1. SOD的测定方法加样顺序：〔V=3ml〕磷酸缓冲液：1.5ml L-Met: 0.3mlNBT: 0.3mlEDTA-Na2: 0.3ml 核黄素：0.3ml 酶液：0.05ml 蒸馏水：0.25ml试剂配制：<1> 0.05mol/L PBS：pH7.8<2> 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用PBS定容至100ml<3> 750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS定容至100ml<避光保存><4> 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用PBS定容至1000ml<5> 20umol/L核黄素: 0.0753g用蒸馏水定容至1000ml<避光保存>注：〔1〕对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管<2> 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值2.MDA的测定方法试剂配制：〔1〕5% TCA： 5g用蒸馏水定容至500ml〔2〕0.5% TBA：2.5g用TCA定容至500ml方法：酶液1ml—3ml0.5%TBA和5%TCA—混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却,10000r/min 离心10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值3.POD的测定方法试剂配制：〔1〕0.1mol/L的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液A<0.2mmol/L的HAc溶液>—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中〔2〕0.25%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中〔临用前配制〕〔3〕0.75%H2O2溶液：1.25ml 30% H2O2定容至50ml〔临用前配制〕方法：比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液—1ml 0.25%愈创木酚溶液—xml酶液〔5min值为500-800即可〕—0.1ml 0.75%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min4.CAT的测定方法试剂配制：<1> 50mmol/L的PBS〔pH7.0〕 <2> 0.3% H2O2—1ml H2O2定容至100ml方法：<1>以不加H2O2的50mmol/L的PBS〔pH7.0〕为空白把A240调零<2>50ul酶液—3ml 50mmol/L的PBS〔pH7.0〕—0.2ml 0.3% H2O2—迅速颠倒混匀,开始计时—1min后在240nm下比色,1次/1min<连续读取5min>.20XX06月22日星期二 19:331 叶绿素含量测定：80％的丙酮液的配制：4L丙酮+ 1L蒸馏水.称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管〔做三个重复〕,加入25ml浓度为80％的丙酮液,放在黑暗处浸提大约36小时后取出,稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm 下测定光密度,以80％的丙酮液为空白.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35～36〕也可用95%乙醇溶液,在665、649、470nm处有最大吸收峰649Cx.c=<1000D470-2.05Ca-114Cb>/2452 抗氧化酶活性的定：〔2.5g样〕0.05mol/L磷酸缓冲溶液<PBS>〔pH=7.8〕溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285g NaH2PO4·2H2O, 定容到4L.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P134〕. 取低温保存的鲜样,称2g左右的叶片〔或根〕放在50ml的离心管,加入20ml浓度为0.05mol/L 磷酸缓冲溶液〔pH=7.8〕〔最好是较冷的磷酸缓冲溶液,防止研磨时温度过高使酶失活〕,研磨〔用磨碎机磨〕,8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟,上清液为粗酶液.2.1丙二醛〔MDA〕的测定：20％三氯乙酸〔TCA〕溶液的配制：称200g三氯乙酸,用蒸馏水定容到1000ml.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124〕；0.5% 硫代巴比妥酸〔TBA〕溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸〔TBA〕,用20％三氯乙酸〔TCA〕溶液溶解并定容到1000ml.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124〕〔先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解〕；0.5ml酶液〔对照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液〕〔做三个重复〕+ 3mlTBA――振荡――沸水浴上反应30min――冷却〔至少30min〕――比色〔OD600、OD532、OD450〕.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124〕2.2超氧化物歧化酶〔SOD〕的测定：NBT<400ml>混合反应液:392mlPBS<Ph=7.8>,+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液〔100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素〕.〔另配〕100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na测试时：取3ml反应液+0.05ml<根>或0.02 ml<叶>粗酶液,于光照培养箱中6-10分钟,OD650下测定吸光度.2.3过氧化物酶〔POD〕的测定：0.05mol/L磷酸缓冲溶液<PBS>〔pH=7.0〕溶液的配制：10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975g NaH2PO4·2H2O,定容到1000ml.0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS>定容到250ml.0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS>定容到250ml.2ml 0.3%H2O2溶液+ 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液+ 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS> + 0.02ml？？〔原来为0.01〕酶液〔根加0.05ml酶液〕〔对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液〕〔做三个重复〕,记录470nm处OD降低速度.将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121〕比色时加酶液,混合后即刻计时.2.4 脯氨酸的测定标准曲线的制作：编号1234567标准脯氨酸的量〔ml〕00.10.20.40.60.81.0H2O〔ml〕1.00.90.80.60.40.20冰乙酸〔ml〕2222222显色液〔ml〕3333333脯氨酸含量〔µl〕012468100.5ml酶液〔对照用0.5ml 80％乙醇代替〕〔做三个重复〕+ 1ml冰乙酸+ 1.5ml显色液―――混匀,沸水浴15min,冷却后测OD520.2.5可溶性蛋白的测定〔参考赵志杰,史国安,董新纯编的《植物生理学实验指导》〕牛血清白蛋白：配成100µg/ml和1000µg/ml.90％乙醇：90ml乙醇+ 10ml蒸馏水.？？？85％〔W/V〕磷酸：170ml磷酸+ 30ml蒸馏水.考马斯亮蓝G-250:称0.2g考马斯亮蓝G-250溶于100ml 90％乙醇中,加入85％〔W/V〕磷酸200ml,用蒸馏水定容到2L.常温下可保存一个月.标准曲线的制作：配制0～100µg/ml血清白蛋白血液管号123456100µg/ml牛血清白蛋白<ml>00.20.40.60.81.0蒸馏水量<ml>1.00.80.60.40.20蛋白质含量〔ml〕00.020.040.060.080.10配制0～1000µg/ml血清白蛋白血液管号789101112100µg/ml牛血清白蛋白<ml>00.20.40.60.81.0蒸馏水量<ml>1.00.80.60.40.20蛋白质含量〔ml〕00.20.40.60.81.00.1ml 酶液〔做三个重复〕+ 5ml考马斯亮蓝G-250―――混匀,放置2min后在595nm下比色.2.6过氧化氢酶〔CAT〕的测定：0.3%H2O2溶液的配制：吸5ml 30%H2O2,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS>定容到500ml.1 ml 0.3%H2O2溶液+ 1.9ml H2O + 0.1 ml 酶液,测定240nm处OD降低速度.将每分钟OD 减少0.01定义为1个活力单位.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121〕2.7 抗坏血酸〔ASA〕的测定：〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P125〕5％三氯乙酸〔TCA〕溶液的配制：25g三氯乙酸,用蒸馏水定容到500ml.10％三氯乙酸〔TCA〕溶液的配制：25g三氯乙酸,用蒸馏水定容到250ml.150mmol/L NaH2PO4〔pH 7.4〕溶液的配制：100ml.44％H3PO4溶液的配制：250ml.4％2,2-二联吡啶溶液的配制：250ml.3％FeCl3溶液的配制：100ml.首先标制作准曲线.粗酶液的提取：取低温保存的鲜样,称0.5g左右的叶片〔或根〕放在50ml的离心管,加入15m 5％三氯乙酸〔TCA〕溶液〔最好是较冷的三氯乙酸〔TCA〕溶液,防止研磨时温度过高使酶失活〕,研磨〔用磨碎机磨〕,15000r/min的冷冻离心机下离心10分钟,上清液为粗酶液,用于抗坏血酸〔ASA〕含量的测定.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125～126〕测定：0.2ml 粗酶液+ 0.2ml 150mmol/L NaH2PO4〔pH 7.4〕溶液+ 0.2ml H2O,混匀〔振荡〕,至少30秒后,再依次分别加入：0.4 ml 10％三氯乙酸〔TCA〕溶液+ 0.4 ml 44％H3PO4溶液+ 0.4 ml 4％2,2-二联吡啶溶液+ 0.2ml 3％FeCl3溶液,混合后在37℃水浴中保温60min,测定OD525处的值.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125～126〕2.8 谷胱甘肽的测定：4g新鲜材料+ 2ml 0.3mol/L醋酸汞+ 2ml 30％醋酸钠后研磨匀浆,转移到离心管中,以蒸馏水冲洗残渣,并以玻璃棒搅拌,净置10min,使之充分沉淀,离心后弃去上清液,沉淀以水〔每次10ml〕在摇动情况下冲洗2次.向沉淀中加入10ml 1mol/L盐酸以溶解其中的谷胱甘肽,以玻璃棒搅拌5min后加入1ml 20％的碘化钾溶液,混匀,离心.上清液转入供滴定用的100ml玻璃管中,沉淀在搅动情况下以10ml水冲洗.离心后溶液与第一次离心液合并.向得到的溶液中加入0.5ml淀粉液,用1mmol/L KIO3滴定,直至出现不消失的蓝色为止.1ml 1 mmol/L 的KIO3相当于0.307mg谷胱甘肽.〔参考《现代植物生理学实验指南》,中国科学院##植物生理研究所编〕.2.9天冬酰胺合成酶〔AS〕的测定：2.10 天冬酰胺转氨酶〔AspAT〕的测定：3 硝酸还原酶<NR>的测定采用离体法：〔1g样〕〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27～29〕亚硝酸钠标准溶液〔1µg/ml〕：称NaNO2 0.9857g ,定容到1000ml,再吸5ml定容到1000ml.0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液：30.0905g Na2HPO4·12H2O + 2.4965g NaH2PO4·2H2O,加蒸馏水定容到1000ml.3mol/L HCl：125ml浓盐酸加蒸馏水定容到500ml.1％磺胺溶液：5.0g磺胺溶于500ml 3mol/L HCl中.0.2％a-萘胺溶液：1.0g a-萘胺溶于125ml冰醋酸后用蒸馏水定容到500ml,贮于棕色瓶中.0.1mol/L KNO3溶液：5.055g KNO3溶于500mln 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液.0.025mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液：Na2HPO4·12H2O 8.8640g + NaH2PO4·2H2O 0.0570g,加蒸馏水定容到1L.提取缓冲液：1.211g半胱氨酸+ 0.372g EDTA,溶于1L 0.025 mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液. 2mg/ml NADH 溶液：0.5g NADH溶于250ml 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液〔临用前配制〕. 首先标制作准曲线:取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂,即配成0～2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液.摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min,然后在540nm波长下比色.以亚硝态氮〔μg〕为横坐标〔x〕,光密度值为纵坐标〔y〕绘标准曲线或建立回归方程.各试剂加入顺序管号1234567亚硝酸钠标准液<ml>00.20.40.81.21.62.0蒸馏水<ml>2.01.81.61.20.80.401％磺胺溶液<ml>44444440.2%α-萘胺<ml>4444444每管含NO2- <μg>00.20.40.81.21.62.01g 材料+15ml提取缓冲液后研磨匀浆,转移到离心管中于4℃、4000r/min下离心15min,上清液即为粗酶提取液,用于硝酸还原酶<NR>的测定.0.4ml+1.2ml 0.1mol/L KNO3溶液+ 0.4mlNADH溶液后混匀〔对照不加NADH溶液,而以0.4ml 0.1mol/L pH 7.5磷酸缓冲液代替〕,在25℃水浴中保温30min.保温结束后立即加入1ml 磺胺溶液终止酶反应,再加1ml 0.2％a-萘胺溶液,显色反应15min后于4000r/min下离心5min,取上清液在540nm下比色测定吸光度.根据回归方程计算.。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。
其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。
测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。
本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。
1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。
常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。
羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。
2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。
酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。
常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。
离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。
上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。
蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。
测定酶活性的方法
测定酶活性的方法
测定酶活性的常用方法有以下几种：
1. 吸光测定法：利用酶催化底物反应产生的产物对特定波长的光的吸收变化进行测定，常见的方法有比色法和荧光法。
2. 浊度测定法：在酶催化底物反应中，产生的沉淀、胶束或团聚物等形成浑浊或沉淀，通过测定反应溶液的浊度变化来确定酶活性。
3. 冷凝法：利用酶催化底物反应产生的产物，通过与特定试剂发生反应产生气体或形成沉淀，在特定条件下进行冷凝，并通过测定冷凝物的质量或体积变化来确定酶活性。
4. 离子选择性电极法：利用通过酶催化底物反应产生或消耗的离子浓度变化，通过检测特定离子选择性电极反应电位的变化来测定酶活性。
5. 标记物测定法：将底物或产物标记上特定的分子或放射性核素，通过测定标记物在反应中的变化来测定酶活性，如放射性测定法、荧光标记物测定法等。
这些方法根据不同的实验要求和酶的特性可以选择不同的测定方法来进行酶活性的测定。
酶活性测量的方法有哪几种
酶活性测量的方法有哪几种酶活性测量是评估酶在特定条件下，催化底物转化为产物的能力的一种方法。
根据不同的酶特性和底物/产物的特性，可以使用多种方法来测量酶的活性。
以下是常见的酶活性测量方法：1. 比色法：比色法是最常用的测量酶活性的方法之一。
在酶催化底物转化为产物之后，产生的有色化合物可以通过分光光度计来测量其吸光度。
比色法适用于各种酶的测量，包括氧化还原酶、氨基酸酶等。
2. 荧光法：荧光法是利用酶底物转化为产物之后所产生的荧光来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入荧光染料，通过测量荧光信号的强度来定量酶活性。
荧光法对于具有较高灵敏度要求的酶活性测量非常有用，例如蛋白酶、DNA酶等。
3. 发光法：发光法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的光来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入发光底物或荧光染料，通过测量其发光强度来测量酶活性。
发光法对于对时间分辨率要求较高的酶活性测量非常有用，例如ATP酶、NADH酶等。
4. 放射性法：放射性法是利用酶催化底物转化为产物后所释放的放射性物质测量酶活性的方法。
该方法需要在底物或产物中引入放射性同位素，通过测量其放射性强度来定量酶活性。
放射性法对于具有极高灵敏度要求的酶活性测量非常有用，例如DNA聚合酶、RNA酶等。
5. 电化学法：电化学法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的电流来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入可反应的电活性物质，通过测量电流来定量酶活性。
电化学法对于某些具有电催化酶活性的酶测量非常有用，例如葡萄糖氧化酶、酒精脱氢酶等。
6. 色谱法：色谱法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的物质在色谱柱上的分离来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入特定的标记物质，通过测量标记物质在色谱图谱上的峰面积或峰高度来定量酶活性。
色谱法对于某些底物或产物具有特定的分离性质的酶活性测量非常有用，例如激酶、酮糖酶等。
酶活性检测
④分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。
几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。
如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。
该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。
酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。
酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。
为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。
而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。
下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。
紫外-可见分光光度法测定酶活：1. β一半乳糖苷酶β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。
能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。
【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。
【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。
2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。
SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。
自1969年Mccord等人首次发现了SOD 生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。
欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。
【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。
酶活测定方法
酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
酶活性测定方法
酶活性测定方法磷酸酶是一类涉及重要生命过程的酶，研究它们在许多生理病理过程中的功能及其调控机制对了解细胞代谢，发育和信号转导的重要意义。
磷酸酶的活性可以通过测定其反应中形成的产物的数量来评价。
该测定可以为研究它们在特定环境中的活性变化提供重要的信息，因此，磷酸酶活性测定方法对于生物学研究显得尤为重要。
磷酸酶活性测定可以采用多种方法完成，其中，最常用的色谱法、光度法、EC法等。
一、色谱法色谱法是一种测定磷酸酶活性的常用方法，它采用磷酸酶催化把被测物质（典型的指磷酸核苷等）水解后形成可见的特异物质，其吸光度可以被检测和测定。
实施此方法的具体流程是：（1）振荡：将磷酸酶、被测样本、受体者和调节剂等组分，按照一定比例配制在离心管中，在一定温度下振荡混匀；（2）定量：经过一定时间的反应，取样经过色谱检测，测定经磷酸酶催化水解后形成的特异物质的吸光度，以计算出磷酸酶活性；（3）统计处理：比较样本和标准曲线，对测定磷酸酶活性做出统计处理，得出最终结果。
二、光度法光度法是直接测定磷酸酶反应中受体者的吸光度来计算磷酸酶活性的方法，其具体原理是：当受体者发生磷酸酶催化水解反应时，会形成有明显吸光度的特定产物，其吸光度及得数可以用来计算磷酸酶活性。
三、EC法EC法是用电导率检测磷酸酶引起受体物质离子化的方法，它是一种快速精确、方便有效的测量磷酸酶活性的方法；其原理是：当受体物质在磷酸酶的作用下水解发生时，电导率会发生显著增加，根据其程度及电导率值变化程度，可以直接由测试数据计算磷酸酶的活性。
以上就是磷酸酶活性测定的三种常用分析方法，它们各自具有自身的优缺点，实验者可以根据自身需求选择适合的分析方法，从而更直观的分析和了解磷酸酶活性的变化情况。
各种酶活性测定方法
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。
此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。
因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。
2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。
反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。
每个处理设3 个重复。
（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。
用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。
取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 20mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。
临床生物化学检验-第8章 连续监测法测定酶活性
(amylase, AMY)
1. 以天然淀粉为底物的测定方法：可测定淀粉水解前后粘度或浊度的改变；也可测产物葡 萄糖；还可测定淀粉与某些活性染料的呈色反应（如碘淀粉比色法 ，但准确性和重复性都 较差）。
2. 以人工合成的麦芽寡糖苷为底物的测定方法：底物的结构和相对分子量确定。
IFCC推荐法： EPS法：以4,6-亚乙基-4-硝基酚-“-D-麦芽七糖苷 (EPS) 做底物偶联多功能“-葡萄糖糖苷酶
9
“-
(alpha-L-fucosidase,AFU)
1. 以4-甲基伞形酮-“-L-岩藻糖苷为底物的荧光法： 灵敏度高 ，但需先用凝胶去除干扰物质。 2. PNPF法：以4-硝基苯-“-L-岩藻吡喃糖苷为底物经AFU水解释放4-硝基苯酚后 ，用碱性缓 冲液终止反应 ，使4-NP呈黄色的方法：需设样本空白并延长反应时间。
12
N-
(β-N-acetyl-D-glucosaminidase, NAG)
1. CNP-NAG法： 色原CNP解离常数 (PKa) 为 5.5 ，摩尔吸光系数大 ，可实现NAG的速 率法分析 ，无需设置样品空白 ，但底物的溶解性和稳定性较差。
2. PNP-NAG法：底物易得 ，反应速度快且稳定 ，是目前常用的方法。 3. MTP-NAG法：可用于尿液NAG测定 ，底物稳定 ，反应灵敏度高。
3. 连续监测法： CNP-NAG法、 PNP-NAG法、 MTP-NAG法。
测定原理： CNP-NAG NAG CNP + 氨基葡萄糖苷
PNP-NAG NAG PNP + 氨基葡萄糖苷
产物CNP、 MPT在405nm/ 340nm处的吸光度与NAG 的活性成正比。
MTP-NAG + H2O NAG N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖+ MPT (6- 甲基-2-巯基吡啶
各种酶活力测定方法及注意事项
各种酶活⼒测定⽅法及注意事项碱性蛋⽩酶及各种蛋⽩酶活⼒测定⽅法及测定有感因长期测定碱性蛋⽩酶酶活⼒与⾓蛋⽩酶活⼒与胶原酶活⼒和弹性蛋⽩酶活⼒，碱性蛋⽩酶活⼒测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可⼤⼤减少误差。
其余酶活⼒测定过程中因⽆统⼀标准且底物差异⼤，导致长期酶活⼒测定的混乱，各种酶活⼒测定⽅法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活⼒只能仅作参考。
以下是各种蛋⽩酶活⼒测定⽅法及标曲绘制：碱性蛋⽩酶测定⽅法根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋⽩酶活⼒测定福林法以下是⽅法碱性蛋⽩酶的测定⽅法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进⾏，即 1 个酶活⼒单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min ⽔解酪蛋⽩产⽣ 1 µg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。
2.2.6.1 标准曲线的绘制（1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。
表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form管号酪氨酸标准溶液的浓度/（µg/mL）取 100 µg/mL 酪氨酸标准溶液的体积/（mL）取⽔的体积/（mL）0 0 0 101 10 1 92 20 2 83 30 3 74 40 4 65 50 5 5（2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使⽤液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃⽔浴锅中显⾊ 20 min，⽤分光光度计于波长 680 nm，10mm ⽐⾊⽫，以不含酪氨酸的反应管作为空⽩，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。
图 2-1 L-酪氨酸标准曲线Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve根据作图或⽤回归⽅程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（µg），既为吸光度常数 K 值。
酶活力测定的方法
酶活力测定的方法
酶活力测定的方法有多种，下面列举常用的几种方法：
1. 比色法：通过测定酶反应产生的可见光吸收或色素形成来间接测定酶活力。
常用的比色法有尼林蓝法、间苯二酚法、对苯二酚法等。
2. 发光法：利用酶催化的氧化还原反应产生的发光信号来测定酶活力。
常用的发光法有荧光发光法、葡萄糖氧化酶法等。
3. 毛细管电泳法：通过测定酶催化反应产生的电荷变化、离子浓度变化或pH 值的变化来测定酶活力。
4. 毛细管电泳法：通过测定酶催化反应产生的电荷变化、离子浓度变化或pH 值的变化来测定酶活力。
5. 凝胶电泳方法：通过观察酶在凝胶上的迁移距离或酶活性的带状图案的强度来测定酶活力。
6. 标记物法：利用酶催化与标记物反应产生的物质变化来测定酶活力，常用的标记物有放射性同位素、酶标记物等。
以上是常用的酶活力测定方法，不同方法适用于不同类型的酶和反应体系。
在实
际应用中，需要根据具体情况选择最合适的方法来测定酶活力。
各种酶活性测定方法
各种酶活性测定方法酶活性测定方法是用来测量酶的活性水平和酶催化反应速率的实验方法。
酶活性测定是生物化学研究中的重要内容之一，能够帮助研究人员了解酶的特性和功能，并对酶的应用提供指导。
目前，常用的酶活性测定方法有以下几种。
1.酶动力学实验法酶动力学实验法是通过调整底物浓度、酶浓度和其他反应条件，绘制酶活性与反应速率之间的关系曲线，以了解酶的动力学特性。
常用的酶动力学实验方法包括酶动力学参数的测定、酶标曲线的绘制和酶动力学模型的拟合等。
2.酶活性基质法酶活性基质法是一种通过检测酶对特定底物的催化反应来测定酶活性的方法。
常用的酶活性基质法包括比色法、荧光法、放射性测定法等。
比色法是通过测量产生的产物颜色的变化来间接测定酶活性，如川氏法、本氏法和丙二醛法等；荧光法是通过测量产生的荧光强度的变化来间接测定酶活性，如ATP酶活性测定法；放射性测定法是通过放射性同位素的标记来直接测定酶活性，如液闪测定法。
3.酶活性电位法酶活性电位法是一种通过测量酶催化反应中的电势差变化来测定酶活性的方法。
常见的酶活性电位法有葡萄糖氧化酶活性电位法、酶反应连续监测法等。
葡萄糖氧化酶活性电位法是通过测量葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化反应产生的电势差变化来间接测定酶活性；酶反应连续监测法是通过测量酶催化反应中产生的电势差变化来直接测定酶活性。
4.酶活性蛋白质法酶活性蛋白质法是一种通过测定酶在反应条件下形成的酶-底物或酶-产物复合物的含量来测定酶活性的方法。
常用的酶活性蛋白质法包括凝胶酶体增活法、凝胶电泳法和酶免疫测定法等。
凝胶酶体增活法是通过测定酶在凝胶中形成的酶-底物或酶-产物复合物的含量来间接测定酶活性；凝胶电泳法是通过测定酶在凝胶中的迁移速度来间接测定酶活性；酶免疫测定法是通过测定酶的特异性免疫反应来直接测定酶活性。
5.酶活性循环法酶活性循环法是一种通过测定酶催化反应中剩余底物或消耗产物的浓度变化来测定酶活性的方法。
常见的酶活性循环法有连续监测法和衍生物测定法等。
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各种酶活性测定方法第一超氧化物歧化酶SOD测定一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD 可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。
（三）试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100μmo l/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA －Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。
三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。
取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。
2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。
3. SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。
四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD 活性。
SOD总活性＝(A ck－A E)×V/(A ck×0.5×W×V t)上式中，SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重。
SOD、POD、CAT、MDA的测定方法-非试剂盒法缩写：SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶； MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：甲硫氨酸；NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS: 磷酸缓冲液1. SOD的测定方法加样顺序：（V=3ml）磷酸缓冲液：1.5ml L-Met: 0.3ml NBT: 0.3mlEDTA-Na2: 0.3ml 核黄素：0.3ml 酶液：0.05ml 蒸馏水：0.25ml试剂配制：(1) 0.05mol/L PBS：pH7.8(2) 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用PBS定容至100ml(3) 750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS定容至100ml(避光保存)(4) 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用PBS定容至1000ml(5) 20umol/L核黄素: 0.0753g用蒸馏水定容至1000ml(避光保存)注：（1）对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管(2) 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值2.MDA的测定方法试剂配制：（1）5% TCA： 5g用蒸馏水定容至500ml（2）0.5% TBA：2.5g用TCA定容至500ml方法：酶液1ml—3ml0.5%TBA和5%TCA—混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却，10000r/min 离心10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值3.POD的测定方法试剂配制：（1）0.1mol/L的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液A(0.2mmol/L的HAc溶液)—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中B(0.2mmol/L的NaAc溶液)—13.6gNaAc.3H2O（2）0.25%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中（临用前配制）（3）0.75%H2O2溶液：1.25ml 30% H2O2定容至50ml（临用前配制）方法：比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液—1ml 0.25%愈创木酚溶液—xml酶液（5min值为500-800即可）—0.1ml 0.75%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min4.CAT的测定方法试剂配制：(1) 50mmol/L的PBS（pH7.0） (2) 0.3% H2O2—1ml H2O2定容至100ml方法：(1)以不加H2O2的50mmol/L的PBS（pH7.0）为空白把A240调零(2)50ul酶液—3ml 50mmol/L的PBS（pH7.0）—0.2ml 0.3% H2O2—迅速颠倒混匀，开始计时—1min后在240nm下比色，1次/1min(连续读取5min)。
2010年06月22日星期二 19:331 叶绿素含量测定：80％的丙酮液的配制：4L丙酮+ 1L蒸馏水。
称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管（做三个重复），加入25ml浓度为80％的丙酮液，放在黑暗处浸提大约36小时后取出，稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm 下测定光密度，以80％的丙酮液为空白。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35～36）也可用95%乙醇溶液，在665、649、470nm处有最大吸收峰Ca=13.95D665-6.8649Cb=24.96D649-7.32D665Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/2452 抗氧化酶活性的定：（2.5g样）0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=7.8）溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285g NaH2PO4·2H2O, 定容到4L。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P134）。
取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L 磷酸缓冲溶液（pH=7.8）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。
2.1丙二醛（MDA）的测定：20％三氯乙酸（TCA）溶液的配制：称200g三氯乙酸，用蒸馏水定容到1000ml。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）；0.5% 硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸（TBA）,用20％三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容到1000ml。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）（先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解）；0.5ml酶液（对照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液）（做三个重复）+ 3mlTBA――振荡――沸水浴上反应30min――冷却（至少30min）――比色（OD600、OD532、OD450）。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P124）2.2超氧化物歧化酶（SOD）的测定：NBT(400ml)混合反应液:392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液（100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素）。
（另配）100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na测试时：取3ml反应液+0.05ml(根)或0.02 ml(叶)粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟，OD650下测定吸光度。
2.3过氧化物酶（POD）的测定：0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=7.0）溶液的配制：10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975g NaH2PO4·2H2O,定容到1000ml。
0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。
0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。
2ml 0.3%H2O2溶液+ 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液+ 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS) + 0.02ml？？（原来为0.01）酶液（根加0.05ml酶液）（对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液）（做三个重复），记录470nm处OD降低速度。
将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121）比色时加酶液，混合后即刻计时。
2.4 脯氨酸的测定标准曲线的制作：编号1234567标准脯氨酸的量（ml）0.10.20.40.60.81.0H2O（ml）1.00.90.80.60.40.2冰乙酸（ml）2222222显色液（ml）3333333脯氨酸含量（µl）12468100.5ml酶液（对照用0.5ml 80％乙醇代替）（做三个重复）+ 1ml冰乙酸+ 1.5ml显色液―――混匀，沸水浴15min，冷却后测OD520。
2.5可溶性蛋白的测定（参考赵志杰，史国安，董新纯编的《植物生理学实验指导》）牛血清白蛋白：配成100µg/ml和1000µg/ml。