一例奶牛乳房炎的诊断

一例奶牛牛支原体乳房炎的诊断

彭清洁1,3，胡长敏1,3，陈颖钰1,2，巴晓亮1,2，白智迪1,2，郭爱珍∗1,2,3

（1.华中农业大学动物医学院; 2.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室;

3.国家肉牛产业技术体系疾病控制功能研究室，湖北武汉 430070）

摘 要：牛支原体（Mycoplasma bovis）是引起成牛乳房炎和犊牛肺炎、关节炎的主要病原之一。本

文从有乳房炎临床症状的奶牛中采集牛奶样本，经细菌培养和支原体培养、特异性PCR与LAMP扩增和16s

rRNA测序等病原学检测证实为牛支原体感染，同时还有其它细菌的混合感染。

关键词：奶牛；牛支原体；感染；乳房炎

1961年牛支原体（Mycoplasma bovis）首次在美国患有乳房炎的病牛中分离到[1]。据报道，牛支原体乳房炎给奶牛业造成了巨大的损失。湖北某奶牛场近期购入约300头奶牛，先后有186头奶牛发生乳房炎，治愈21头，死亡15头，其余牛由于长期不能治愈淘汰。经实验室确诊该场奶牛所患疾病为牛支原体乳房炎，现就该奶牛场临床发病与病原学鉴定情况报告如下。

1 材料与方法

1.1 样品

湖北某地奶牛场无菌采集并送检的患病牛奶样3份。

1.2 培养基的制备

胰蛋白胨大豆琼脂（Tryptose Soya Agar, TSA）按照试剂说明配置TSA固体培养基及TSB 液体培养基。支原体液体与固体培养基的配制及支原体的培养鉴定参照文献[2-3],但培养基中未加1% 醋酸铊溶液。PPLO肉汤粉、酵母粉、琼脂粉等购自BD公司，MEM培养基购自Sigma公司，马血清购自Hyclone公司，精氨酸购自上海伯奥生物科技有限公司。

1.3. 细菌的分离培养

按文献[4]吸15μL待检奶样置TSA平板上划线涂抹，培养皿倒置于37℃恒温箱内培养。过夜培养后观察划线处长出的菌落形态，接种环小心刮取不同菌落形态的细菌，革兰氏染色后在油镜下观察细菌形态，同时刮取少量细菌按同样的方法再次在平板上进行纯培养。

1.4 牛支原体的培养

吸15μL待检奶样涂于PPLO 固体培养基表面，放于含5%的CO2的细胞培养箱培养。同时吸20μL奶样投入到PPLO液体培养基中。2～3 d后，在光学显微镜观察菌落形态。支原体在固体培养基上菌落应具有“煎蛋样”典型特征，液体培养基由红色变为黄色，并且透亮。

1.5 牛支原体PCR的鉴定

牛支原体的鉴定通过PCR进行，具体的操作按照文献[5]所述步骤。

1.6 牛支原体的LAMP扩增

检测提取牛支原体总DNA：取新培养的牛支原体菌液500μL于1.5mL灭菌Eppendorf 管中，12000rpm离心15min，弃上清，沉淀溶于200μL灭菌ddH2O中。沸水浴10min后

∗基金项目：现代农业（肉牛）产业技术体系专项经费(nycytx-38)资助。

∗通讯作者. Tel: 0086-27-87286861; Fax: 0086-27-87282608。Email address: aizhen@

立即冰浴1-2min，待Eppendorf管冷却后-20℃保存备用。

环介导等温扩增反应：以F1P、B1P为内引物，以F3、B3为外引物对牛支原体DNA 进行恒温扩增。其反应体系为：1.4M betaine，200μM dNTPs，2.5 μL 10×Bst Buffer，8 U Bst NDA聚合酶大片段，2μL模板，外引物各0.08μM，内引物各0.64μM，ddH2O补齐至25μL。将上述除酶以外的所有试剂混匀置于PCR管中，95℃ 5min，立即冰浴1-2min，加入8 U Bst NDA聚合酶大片段，59℃ 60min，80℃ 10min终止反应。

将SYBR Green I荧光染料稀释100倍后即为工作液，在25μL的环介导等温扩增产物中加入3-4μL SYBR Green I工作液，在日光下用肉眼观察结果。

若扩增产物变为黄绿色则为牛支原体阳性，若扩增产物为棕色则为牛支原体阴性。

1.7 细菌的16 SrRNA鉴定

无菌牙签挑取分离纯化的细菌菌落，加入预先装入灭菌水的无菌离心管，煮沸10 min，冰浴1min，12000r/min离心30s，取上清作为DNA模板。按照本实验室事先合成的16 SrRNA 通用引物及扩增条件进行PCR 扩增[5]，所得PCR产物经回收后与pMD-18T 载体连接后送上海生物工程技术服务有限公司测序。获得的测序结果置GenBank中进行同源性比对，参照对比序列同源性的高低确定菌株鉴定结果。

2 结果与分析

2.1 发病牛的临床症状

自2010年2月起，湖北某奶牛场多头牛患乳房炎后相继倒地，患牛乳区发热、乳房肿胀（图1）、触诊捏粉样硬实；患牛乳汁呈豆花状，有的可见凝块、絮片状物或脓汁；部分牛精神沉郁、食欲差；部分牛呼吸急促，颈部和肢蹄肿胀，并出现跛行；大部分牛发热、食欲减退甚至拒食的现象。该场兽医人员采用大剂量的抗生素进行治疗，但效果不明显，表现为病情难控制且易反复，多头牛最终由于败血症死亡。

2.2 细菌分离鉴定结果

从送检1份奶样中分离到菌落形态为圆或椭圆的细菌，染色后镜检为革兰氏阳性球菌，扩增该菌的16SrRNA，测序分析后确定该菌为粪肠球菌。

2.3 支原体的分离结果

将送检奶样接种固体支原体培养基，平板上呈现典型的“煎蛋样”外观的菌落（图2）。取培养的支原体菌落进行特异性PCR扩增，获得阳性条带（图4）。进一步进行16SrRNA 测序分析，确定为牛支原体。

图1 患牛乳房肿胀 图2 牛支原体“煎蛋样”外观

2.4 牛支原体的LAMP扩增结果

扩增产物为黄绿色（图3）则为牛支原体阳性。

阳性阴性对照

图

物

1000

bp M 1 2 3

2000

500

250

100

750

238

4 mycoplasma. bovis的PCR扩增结果

1: 1号样的扩增产物; 2: 2号样的扩增产

;3：阴性对照

M: DL 2000 DNA Marker

图3 LAMP扩增结果

3 讨论与结论

3.1牛支原体是一类能在无活细胞培养基中繁殖的最小微生物，无细胞壁、繁殖形式多样、具有高度多形性。大部分支原体都是宿主特异性的黏膜常在菌，主要寄生在鼻腔，其次在乳腺[6]。1961年由Hale在美国首次从患乳腺炎的牛乳中分离到该病原，1976 年首次报道与牛呼吸系统疾病有关。该病在世界范围内大部分牛场存在，如美国由于牛支原体所致单个牛场最高感染率为70 %，损失达1.4亿美元[7]。我国1983年黎济申首次报道从患乳腺炎牛乳中牛分离到牛支原体[8]，本例是奶牛支原体乳腺炎的再次报道。

3.2在牛支原体乳腺炎的诊断方面，对其进行确诊仍然需要进行病原体的分离鉴定及核酸诊断等方法。牛支原体的分离培养鉴定虽然能够确诊，但操作复杂，所需条件高；生理生化特性检查，包括葡萄糖和精氨酸水解试验、尿素水解试验、酸酶活性试验，血清学鉴定也可以作为牛支原体的辅助诊断方法[9]。PCR方法有较高的特异性和灵敏性，但需要精密设备和细心操作，如有不慎，可能出现假阳性和假阴性结果。我们研制的牛支原体环介导等温扩增检测方法(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)，可以基于分子水平对牛支原体特异性基因进行PCR扩增，该方法所需设备为一台可以提供60°C恒温环境的仪器（如水浴锅），大大降低了检测的费用，而且给牛支原体病的临床诊断带来极大方便。总之，与PCR 方法相比，LAMP方法具有经济实用、灵敏度高、特异性强、检测简单等优点。

3.3牛支原体对大部分抗生素不敏感，大部分在体外药敏试验结果中表现敏感的药物，但在支原体乳房炎临床治疗时却不能产生良好的效果，有研究者认为与奶牛血乳屏障阻碍药物进入乳腺有关[10]。另据报道中西药结合治疗牛支原体乳房效果好，中药方面治疗用瓜萎散加味，西药用四环素、红霉素、土霉素以及卡那霉素等四环素类抗生素进行治疗[11]。在积极治疗原发病的同时，也应采取相应的对症治疗措施，如发热的牛可用安乃近、复方氨基比林等解热药；体质弱的牛补充能量和维生素C、复合维生素B、ATP等，亦结合樟脑注射液等进行强心治疗。

3.4从送检的奶样中分离到支原体的同时，也少量分离到粪肠球菌，这可能是因为支原体感染后的继发感染。

牛支原体病是严重危害养牛业的传染性疾病，本文是我国牛支原体导致奶牛支原体乳房