细胞生物学实验技术(二)

细胞消化液
由组织中分离细胞和细胞传代
常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)两 种溶液，单独或混合使用
➢ 胰蛋白酶溶液 • 主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散 • 消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消
化作用
➢ EDTA·4Na 溶液 • 一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，
价格低廉，使用方便 • 常用工作液浓度为0.02%。
➢ 注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净， 因残留的EDTA 会影响细胞生长
（四）细胞的原代和传代培养
鼠胎组织细胞原代培养
• 取材：
–用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
–把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟 消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
动物细胞生物学 实验技术
主要 内容
第一节 培养细胞的生物学 第二节 细胞培养基本实验室操作 第三节 细胞生物学实验技术
第二节、细胞培养
主要内容
（一）细胞培养所需条件 （二）细胞培养所需用品 （三）细胞培养液 （四）细胞的原代、继代培养 （五）细胞的冻存和复苏 （六）细胞污染
（一）细胞培养所需条件
过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限. • 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。 ➢ 药物辅助高温处理法 • 先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀
4. 蒸馏器与去离子纯水系统：
1）用三蒸水，通过去离子纯水 系统，电阻需达到170万欧姆以上。 2）专门的去离子水系统
5. 倒置相差显微镜：
需用相差镜头和滤光片，集光器的选择应与接物镜 的放大倍数一致。
纯水系统
倒置相差显微镜 1，物镜朝上 2，工作距离大 3，相差干涉
5，培养器皿
培养板与培养瓶
湿度以第二天第 一次开门，能看 到玻璃门上的水
珠
3．消毒设备：
A.高压消毒锅（Autoclave）：110 ºC，15 lb，20 分钟，
适合于橡皮、纸、布、塑料制品和液体（9 lb， 10 分钟）等。 消毒后必须在烤箱中低温烤干。
B.干热消毒箱：150-200 ºC， 2 -3小时。
适合于玻璃器皿、金属器械等。
垂直流超净工作台
超净工作台的清洁维护：
保持工作台上无死角，让空气得到充分过滤，
即试验完毕后，将所有的用品收藏起来，工作台 上只留有酒精灯及橡皮头。
工作前和工作完毕都要用酒精擦桌面，如果桌面 滴有培养液等物，实验结束后应先用水擦，然 后用酒精再擦。
还需定期检测工作台滤器过滤的效率。
整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速
细菌和真菌的清除
使用抗生素
• 抗生素对杀灭细菌较有效。 • 联合用药比单独用药效果好。 • 预防用药比污染后再用药效果好，一般用双抗生素。 • 污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍药物冲洗
法，于加药后作用24～48小时，再换常规培养液。此 法在污染早期有效。
支原体污染
95％以上是以下四种支原体：
常用细胞冷冻保存液
• 5%或10％DMSO＋完全培养液 • 10％甘油＋完全培养液
冷冻细胞注意事项
冻存液配制 : 现用现配，DMSO是易燃物
冻存液体积：要小，0.5-1 ml
冻存细胞数：与正常传代细胞数目要相当，避免复苏后细胞传 代比例发生变化
冻存速度： 降温缓慢
4C，10－30 min
-20C，1 -- 2 h
5，恒温水浴箱，血 清灭活，细胞解冻
6，移液管
7，低速离心机
（三）细胞培养基
• 干粉培养基和液体培养基
• 常用的培养基种类
– RPMI-1640（标准型）、DMEM高糖（标准型）、DMEM-低糖 （标准型）、McCoys 5A、M199、 F12等
Gibco干粉培养液
液体培养液
1，培养在使用之前需要加入的成分：血清、Na2CO3, 丙酮酸 钠、抗生素等
–用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖 腹取出子宫置于无菌平皿中。
–用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、 爪，以平衡盐溶液洗去血污
鼠胎组织细胞原代培养
• 切割：
–用PBS将取出的组织块清洗三次，
–然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直 到成1mm3左右的小块，
–再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。
谷氨酰胺
– 脱掉氨基后，L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、 参与蛋白质的合成和核酸代谢。
– L－谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确 切的降解率一直没有最终确定。
– L－谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞 具有毒性。
谷氨酰胺
• 配制方法为 ：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水 加至100ml即配成200mM的溶液，充分搅拌溶 解后（应加温30℃），过滤除菌，分装小瓶， -20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入 0.5-2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mM
-80C，1 hour – 过夜
-196C，1-- 2 year
完善记录：冻存细胞名称，冻存日期，冻存人，存放位置，其
它特殊信息等
细胞冻存管，做好标记
细胞复苏
• 速融 –冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻 摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分 钟）
• 解冻后的细胞可直接接种到含完全培养液中直接进行培养， 24 小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO
•口腔支原体（M.orale） •精氨酸支原体（M.arginini） •猪鼻支原体（M.hyorhinis） •牛莱氏无胆甾原体（A.laidlawii）
危害：
世界性问题，平均发生率达到11% 能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达 不能通过可视法对其进行检测 对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染 来源： •操作环境不良 •操作人员的疏失 •实验器具不洁等 •已受污染的细胞 •已受污染的培养基、血清
1. 热灭活（heat-inactivation）是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻之 血清。目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须， 一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物显著增多，且会影响血清 之品质。
1. 勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时 血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质
• 液氮罐 • 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 • 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管
1．超净工作台(Hood):
A.水平流超净工作台(Horizontal air flow) B.垂直流超净工作台(Lateral air flow)
水平流超净工作台 背送风，但病毒是不实用的，容易对人有害
Hyclone胎牛血清
Gibco胎牛血清
血清使用前要根据需要的量进行分装， 避免反复冻融，血清保存要放置－20℃
培养液的选择
没有一定的标准，有几点建议可供参考
选择培养这种细胞首选的培养液。可以查阅参考文献，或在购买细 胞株时咨询。
其它实验室惯用的培养液不妨一试，许多培养液可以适合多种细胞。
用多种培养液培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集 落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的 方法，但比较繁琐。
C.酒精消毒：解剖器械、塑料器皿、动物皮毛 等，酒精浓度为75－95％ 。
D.Co 60：放射性同位素
高压消毒锅
D. 滤膜过滤：
正压过滤: 负压过滤：
滤膜孔径为0.22μm，为延长滤膜寿命可同时添加 0.45 μm和1.2 μm 滤膜。
滤膜滤器
两种：1，一次性滤器；2，买滤膜自己装（需要消毒）
细胞换液
➢全量换液和半量换液 换液时机的选择：
➢培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物 质积累增多， pH值下降，营养液酸化变黄。
➢细胞状态
细胞传代
1. 原代细胞传代以便获得稳定的细胞株 2. 细胞系传代以得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续 3. 接触抑制 4. 营养枯竭
• 将培养的细胞从培养器皿中消化下来，以1:2或l:3以上的 比率转移到另外的器皿中进行培养，即为传代培养
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消化法传代培养步骤
(五)细胞冻存和复苏
冷冻保存要点
➢ 冷冻过程要缓慢：缓冻速溶 – 4℃ 30－60 分钟→-20℃ 30 分钟 →-80℃ 16－18 小时（或过
夜）→液氮长期保存 – 或使用程序降温盒，每秒下降1 ℃ – 更简单的方法：脱脂棉包裹，直接放-20度过夜，第二天可放液氮 ➢ 冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。 ➢ 细胞浓度控制在：5x106－2x107/ml。
支原体污染检测
➢荧光染色法 ➢电镜检查：扫描电镜、透射电镜 ➢支原体培养 ➢聚合酶链反应(PCR)法
支原体污染表现
细胞营养液常常仍清亮但变黄,细胞生长变缓，部分细胞发 生脱落等等，细胞间隙可见铺满细沙样小点。
荧光染料Hoechst33258染色法检测支原体
支原体的清除
➢ 支原体清除剂MRA （Mycoplasma Removal Agent）处理法 • 每4天换一次液，连续处理15天 ➢ 清洗纯化法 • 细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤 • 原理：由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通
等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。 • 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。 • 污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落
死亡。
真菌污染
• 真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及 毒性作用而使细胞脱落死亡。
中间长梭型的是正在分裂的念珠菌
白色念珠菌（倒置显微镜下）
酚红
• 大多数培养液中使用酚红作为pH 指示 –橙色表示中性pH –黄色代表酸性pH –紫色表示碱性pH
• 在一些特殊培养液中不含酚红 –因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤 其是雌激素）样作用，为避免固醇类反应，培养细胞， 尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚 红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不 使用加有酚红的培养基。
• 如果细胞对冷冻保护剂特别敏感 –解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接 种到含完全生长培养液的培养瓶中
（六）细 胞 污 染
• 细菌污染 • 真菌污染 • 细菌和真菌的清除 • 支原体污染 • 支原体的清除
细菌污染
• 细胞培养常见的污染 • 最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌
总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养， 各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）。
血清使用注意事项
1. 血清必须贮存于–20 ～ -70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。
1. 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至 室温下全溶后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气 泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至 37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
正确
错误
接种过程中尽可能达到悬空要求 防止操作带来的污染
正确
错误
接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口
正确
错误
瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口
正确
错误
2，CO2培养箱
➢CO2培养箱设定的条件为37 ℃，100%湿度，5％CO2 。
➢使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题
① 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 ② 保持培养箱内空气干净。 定期消毒（90 ℃，14 h)。 ③ 箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水， 以保持箱内湿度，避免培养液蒸 发。
1 营养需要
2 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3pH: 7.2-7.4 渗透压 湿度
3 无污染
4 无毒
（二）细胞培养所需用品：
• 无菌间、超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱， 滤器，酸缸，紫外灯
• CO2培养箱 • 倒置显微镜
–静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去 上清
鼠胎组织细胞原代培养
• 消化、接种培养：
–加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），与组织块混匀。 –置37℃水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管）， –静止，吸去上清，加入5～10ml细胞培养液，用吸管吹打混匀，
–移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养