细胞生物学实验步骤
细胞生物学实验教学备课教案细胞实验的操作与观察
细胞生物学实验教学备课教案细胞实验的操作与观察细胞生物学实验教学备课教案前言：本教案旨在为细胞生物学实验的准备工作提供指导，包括实验的操作步骤和观察要点。
实验内容涵盖细胞培养、染色和观察等方面，旨在帮助学生了解细胞结构和功能，培养他们的实验技能和科学思维。
实验目的：通过本实验，使学生了解细胞的基本结构和功能，培养他们的实验能力和观察分析能力。
实验材料和仪器：1. 细胞培养物：如细菌培养物、动物细胞培养物等。
2. 细胞培养器具：如培养皿、离心管、移液器等。
3. 染色剂：如荧光染料、溴酶、乙酰酚染料等。
4. 显微镜和载玻片。
实验步骤：步骤一：准备工作1. 检查实验材料和仪器是否齐全。
2. 清洗工作台和实验器具，保持清洁。
步骤二：细胞培养1. 取出细胞培养物，根据需要进行适当的稀释。
2. 将细胞培养物分装到培养皿中，每个培养皿的细胞密度控制在适当水平。
3. 采用无菌操作，将培养皿放入恒温培养箱中，设定适当的温度和培养时间。
步骤三：细胞染色1. 取出培养皿中的细胞，使用适当的方法将细胞附着在载玻片上。
2. 准备染色溶液，根据实验需要选择合适的染色剂。
3. 将染色溶液滴在载玻片上，与细胞接触一定时间。
4. 用适当的方法将载玻片洗净，准备观察。
步骤四：观察和记录1. 将载玻片放置在显微镜上，调整镜头和光源，观察细胞的形态和染色效果。
2. 用目镜和物镜逐步调整焦距，获得清晰的细胞图像。
3. 用规定的倍率进行观察，并记录细胞的结构特征和染色的结果。
步骤五：数据分析与讨论1. 根据观察结果，总结细胞结构和功能的特点，并进行分析讨论。
2. 分析不同染色方式对细胞观察结果的影响。
3. 理解实验中可能出现的误差，并提出改进的方法。
步骤六：实验总结1. 总结实验的目的、步骤和观察结果，梳理实验过程中的关键点和问题。
2. 分析实验结果的意义和应用价值，并展望进一步的研究方向。
3. 总结实验中的收获和不足之处，提出改进的建议。
细胞生物学实验教程
细胞生物学实验教程1. 细胞培养细胞培养是研究细胞生物学的重要工具。
其基本原理是将动植物等生物材料分离、挑选出优良细胞群体，通过合适的细胞培养基、培养条件、方法和设备，使细胞在体外生长和繁殖。
其常用培养细胞的类型有：肺、肝、胃肠、心肌、肌肉、神经、结缔组织、卵巢等。
2. 细胞分离将细胞组织挑选出来进行细胞分离，我们需要用到一般的分离试剂，如细胞酶、生物表面活性剂、离子液体、尼龙布、毛细管、细胞分选仪和细胞联合培养等，同时需要注意一些技术细节。
例如合适的分离环境和分离条件、合适的分离时间、细胞貌形的观察以及细胞去污的操作等。
3. 细胞染色细胞染色是存在于细胞的染色体、蛋白质和核酸等物质，借助不同染色剂使之显色的过程。
其优点是操作简便，速度快，结果直观且研究范围广。
根据它的使用范围和目的不同，一般分为核型分析、基因型分析、生化分析、免疫分析和化学分析等。
4. 免疫组化染色免疫组化染色是指利用抗体与细胞中的特定抗原之间的结合反应，使细胞中的抗原在细胞、组织切片或细胞培养物中可视化并得到定位的技术。
这种技术是现代生物技术与分子生物学的重要组成部分，也是研究细胞分子和生物学的密切联系。
5. 荧光标记技术荧光标记技术是指在一定条件下，荧光分子效应的物理特性。
将该技术运用于细胞生物学中，可以标记生物分子，如细胞内结构组分和生物分子中的蛋白质、核酸、糖等，以实现对其特性、运动和转化的动态和定量分析。
同时，它对于研究牛眼改良和细胞砂浆的研究、比较病理学和細胞生理学中细胞示踪标记的定位等过程中也有着积极的作用。
6. 电镜观察电子显微镜（EM）是一种利用电子束代替光束观察样品表面的高分辨率显微镜。
其操作方法较为复杂，需要像样的准备样本和设备，但提供的高分辨率和高对比度，使得研究者可以观察小于光学分辨率的细胞结构，并能发现小分子、细菌和病毒等细胞成分。
7. 分子生物学实验技术目前，分子生物学技术已经成为细胞生物学研究的重要手段之一。
细胞生物学实验
实验一细胞膜的渗透性一、实验目的1、了解细胞膜对物质渗透的一般规律。
2、了解溶血现象及其发生机制。
二、实验原理细胞膜为一种半透膜，对物质的通透具有选择性。
当红细胞放入低渗溶液时，细胞吸水膨胀而发生溶血。
当红细胞放入含有不同溶质的等渗溶液中时，由于细胞膜对不同溶质的透性不同，细胞发生溶血的时间也会不同，故发生溶血现象时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。
三、实验操作1、从集市买适量活鸡血，取5ml（防止污染），放入盛有20ml Alsever’s液瓶中，混匀后置冰箱保存备用（2周内使用）。
2、使用前取用Alsever’s液保存的新鲜鸡血5ml，加入8ml的0.128mol/L NaCl溶液，小心混匀，1000r/min 离心5min，如此3次洗涤，最后配成30%的鸡红细胞（CRBC）悬液。
3、取11支试管，按附表中所示测试溶液，分别取样各3ml，作出标记后，各管均加入红细胞悬液2滴，混匀后静置于室温中，观察各支试管中发生溶血的时间及变化。
四、观察结果1、试管内液体分两层：上层浅黄色，下层红色不透明为不溶血（―）,镜检红细胞完好呈双凹盘状。
2、如果试管内液体浑浊，上层带红色者，称不完全溶血（+或++），镜检部分红细胞呈碎片。
3、如果试管内液体变红色而透明者，称完全溶血（+++），镜检发现细胞全部呈碎片。
五、实验建议1、鸡血在离心时，试管均需在扭力天平上平衡。
2、目测红细胞体积或置于带刻度的离心管中，加入生理盐水配成30%的红细胞悬液。
、3、试管中有红细胞和测试溶液时，不应强力摇晃，以免造成人为的红细胞破裂。
实验报告及作业※目测判断标准：快速溶血：+++；慢速溶血：++或+；不溶血：―实验二核酸(DNA和RNA)的细胞核定位观察一、实验目的1、了解和学习两类核酸显示的原理及操作程序。
2、了解细胞中DNA和RNA的分布。
二、实验原理细胞内的DNA主要分布在细胞核内，RNA主要存在于细胞质中。
甲基绿和吡罗红两种染色剂对DNA和RNA的亲和力不同：甲基绿使DNA呈现绿色，吡罗红使RNA呈现红色。
细胞生物学自主实验
染色
• 1、把滴好的在载玻片放入染缸中，将稀释 后的Giemsa染色滴在染缸里中，室温染色 20分钟；
• 2、自来水轻轻冲洗（冲洗标本片的背面） 3～5秒钟，晾干（或烘干）； • 3、镜下观察染色体分带及染色情况。
五、注意事项
• 1 、细胞培养的环境必须无污染环境，温度保持 恒定，有适宜气体环境，pH适宜。 • 2、 操作及培养条件、培养仪器等无菌避免污染。 • 3、控制好离心速度，过快或过慢都会影响实验 结果。 • 4、低渗处理是实验成败的关键，其目的是使细 胞体积膨大，染色体松散，处理时间过长染色 体丢失会影响观察，处理时间不足，细胞内染 色体会聚集在仪器无法区分。
六、核型分析结果
女性染色体
男性染色体
结果分析讨论
一、在这次试验中我们做了4张片子，但其中一男一 女两张装片没有看到分裂相，分析原因可能有以下 几点： 1、片的高度不够，导致细胞没有摔开。 2、秋水仙素用量分配不均，导致用量不足。
• 二、核型结果分析： • 核型分析数据与正常的核型数据比较吻合。
• 女生组的细胞较好，经过三天的恒温培养 细胞的数目较多，分裂相也较多，但是男 生组的细胞数目就很少，分裂相也很少。 原因可能以下几点有: • 1、男生的细胞不容易被PHA诱导分裂； • 2、男生的细胞在制作装片的时候有损失； • 3、秋水仙处理时的用量太少（只有半滴）。
• • • •
细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告（经典版）编制人：__________________审核人：__________________审批人：__________________编制单位：__________________编制时间：____年____月____日序言下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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细胞生物学实验操作指南
细胞生物学实验操作指南目录1.洗涤与灭菌1.1细胞培育瓶1.2小烧杯、吹管1.3盐水瓶1.4瓶盖、胶塞1.5塑料器皿1.6附注：洗液配方〔次强酸液〕2.配置常用溶液2.1平衡盐溶液2.2pH 调整液2.3抗生素液2.3.1青霉素+链霉素2.3.2两性霉素2.3.3G4182.3.4潮霉素2.4消化液2.5培育基2.5.1配置2.5.2使用3.培育操作根本要求无菌操作一．洗涤与灭菌在组织培育中，离体细胞对任何有害物质都格外敏感。
有害物质包括微生物、细胞剩余物以及非养分成分的化学物质。
因此对承受和重使用的培育器皿，都要严格清洗。
1.细胞培育瓶：(1)浸泡：初次使用和培育用后的玻璃器皿都需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶解掉。
的玻璃器皿，玻面常带有很多枯槁的灰尘，同时在生产过程中，玻璃外表常呈碱性并带有一些对细胞有毒的物质，如铅和砷等。
瓶使用前应先用自来水简洁冲洗，然后用稀盐酸(5%)浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。
培育后的玻璃器皿往往附有大量蛋白质，枯槁后不易刷洗掉，故用后要马上浸入清水中；留意让水能完全进入瓶皿中，不应留有气泡。
(2)刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般仍旧要用毛刷沾洗涤剂洗涤，以除去器皿外表的附着较牢的杂质。
刷洗次数太多，能损害器皿外表光泽度，所以应选用软毛刷和优质的洗涤剂〔如高级洗衣粉或洗洁精〕，确定不能使用含沙粒的去污粉！洗刷时特别留意洗刷瓶角部位。
可以将洗涤剂倒入浸泡培育瓶的清水中，直接在水中进展刷洗，然后再以清水冲洗干净。
(3)泡酸：刷洗不掉的极微量杂质经过硫酸和重铬酸钾洗液的强氧化作用后，可被除掉。
洗液对玻璃器皿无腐蚀作用，去污力量很强，是清洗过程中关键的一环。
浸泡时，器皿要布满洗液，勿留气泡。
浸泡时间不应少于 6 小时，一般应浸泡过夜。
留意，泡酸时要戴防酸手套，否则将损伤皮肤。
(4)冲洗：泡酸后必需用水充分冲洗，使之不留任何残迹。
冲洗时每瓶都要用水灌满，倒掉。
冲洗程序是先用自来水冲洗20 遍，再用蒸馏水冲洗10 遍，最终用双蒸水冲洗两遍。
细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告实验名称：细胞培养实验实验目的：1. 了解细胞培养的基本原理和过程2. 观察细胞生长和分化的现象3. 掌握细胞培养的实验技术和方法实验原理：细胞培养是一种将生物体细胞从其原始生存环境中分离出来，在体外条件下进行培养的技术。
这种技术对于研究细胞生物学、发育生物学、药物筛选等学科具有重要意义。
本实验将通过观察细胞生长和分化的现象，加深对细胞培养技术的理解。
实验材料：1. 人体皮肤细胞2. 培养基（包含血清、抗生素、氨基酸、维生素等）3. 塑料瓶（培养皿）4. 显微镜5. 记录表实验步骤：1. 取适量人体皮肤细胞，用胰蛋白酶消化，使其从组织中分离出来。
2. 将细胞接种到塑料瓶（培养皿）中，加入适当浓度的培养基。
3. 将塑料瓶（培养皿）放入恒温培养箱中，定期观察并记录细胞生长和分化的现象。
4. 在合适的时间点，使用显微镜拍照记录细胞生长和分化的过程。
5. 实验结束后，整理数据和图片，撰写实验报告。
实验结果：经过一段时间的培养，我们观察到皮肤细胞在培养基中开始贴壁，并逐渐生长。
随着时间的推移，部分细胞开始出现分裂，形成相互连接的细胞团。
一些细胞逐渐伸展成梭形或扁平形，呈现出典型的贴壁生长形态。
在某些区域，我们观察到细胞开始分化为两种不同形态的细胞群，一种呈圆形或椭圆形，另一种呈多角形。
这些现象表明细胞已经开始分化。
实验分析：根据实验结果，我们可以得出以下结论：1. 细胞确实可以在体外条件下贴壁生长并增殖。
这证明了细胞培养技术的可行性。
2. 细胞分化是一个自然的过程，在本实验中得到了证实。
这说明细胞具有自我更新和多向分化的潜能。
3. 实验过程中需要注意无菌操作和适宜的培养条件，以确保细胞的存活和正常生长。
此外，不同种类的细胞可能需要不同的培养条件，因此在实际操作中需要针对具体细胞类型进行实验。
实验结论：通过本次实验，我们了解了细胞培养的基本原理和过程，观察了细胞生长和分化的现象，并掌握了细胞培养的实验技术和方法。
细胞生物学试验
实验目的
实验原理 实验步骤
作
思
业
考
细胞生物学实验
作 业：
总结细胞膜对不同性质物质 通透性的规律
实验目的
实验原理 实ห้องสมุดไป่ตู้步骤
作
思
业
考
细胞膜通透性的观察
细胞生物学实验
思 考：
比较鸡血和人血溶血时间， 说明什么问题？
实验目的
实验原理 实验步骤
作
思
业
考
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细胞膜通透性的观察
人工合成脂双层对不同物质的选择 性通透
细胞膜通透性的观察
实验原理：
本实验将红细胞分别放于各种等渗溶 液中，由于红细胞膜对不同溶质的通
细胞生物学实验
东北师大 生科院
透性不同，使得不同溶质透入细胞的
速度相差很大，有些溶质甚至不能透 入细胞。当溶质分子进入细胞后可引 使细胞膨胀，细胞膜破裂，血红素溢
实验目的
实验原理
起渗透压升高，水分子随即进入细胞， 实验步骤
低渗对细胞的影响
细胞膜通透性的观察
实验目的
实验原理 实验步骤
作
思
业
考
细胞生物学实验
实验步骤：
• 3．分别在以下几种等渗溶液中重 复同样实验，观察有无溶血，以 及溶血时间。 0.17mol/L氯化铵、0.17mol/L醋 酸铵、0.17mol/L硝酸钠、 0.12mol/L草酸铵、0.12mol/L硫 酸钠、0.32mol/L葡萄糖、 0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、 0.32mol/L丙酮、0.32mol/L乙二 醇。
细胞生物学实验
实验目的
细胞膜通透性的观察
细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告一、实验目的：了解细胞的基本结构、形态和生物学特性。
二、实验原理：在微观水平上，细胞是生命体的基本单位。
细胞通常由细胞膜、细胞质和细胞核组成，细胞质中含许多小器官和细胞器，如内质网、高尔基体、线粒体、溶酶体、细胞骨架等。
通过显微镜的观察，可以看到不同类型、不同来源的细胞的基本组成结构和形态特征。
三、实验步骤：1. 熟悉实验设备和原理，准备好实验所需的盖玻片、覆盖片、构建显微镜和目镜等设备；2. 用洗涤液彻底清洗玻璃片，用酒精棉轻轻擦拭干燥；3. 取一滴洗涤液滴在玻璃片上，用银夹取一片洋葱内皮，撕下一小块后放入滴在玻璃片中央；4. 用银夹按住洋葱内皮表面，轻轻地撕成细胞块后，再滴上一滴洗涤液，轻轻摇晃玻片，使洋葱细胞均匀分散在玻片表面；5. 取一块覆盖片，斜着压入滴在玻片表面的细胞悬液，使其平滑成一小片；6. 在玻片表面上放置一滴染料，如伊红染料或甲基蓝染料，然后再建立显微镜后调整到适当的放大倍率；7. 观察细胞的形态、细胞核的位置、大小和形状等。
四、实验结果分析：洋葱内皮细胞是一种球形或椭圆形的细胞，由细胞膜、细胞质和细胞核组成。
细胞膜是细胞的外边包围结构，它隔开了生物体环境与细胞内环境。
细胞质包含细胞器和细胞液。
细胞核是控制细胞体的生长、发育和遗传物质DNA的复制和转录的最重要的细胞器之一，它的位置比较固定在细胞的中央或靠近细胞膜的一侧。
在显微镜下，可以看到洋葱内皮细胞的大小和形状，并且细胞核位置明显。
染色后，细胞质和细胞核可以更清晰地观察到。
五、实验结论：通过本次实验，我们了解到细胞是生命体的基本单位，不同的细胞类型有着不同的结构和形态特征。
在细胞中，细胞膜、细胞质和细胞核的结构和功能较明显，可以通过显微镜观察到。
本实验通过观察洋葱内皮细胞的形态和染色，深刻理解了细胞的结构和生物学特性，并对进一步的生命科学研究提供了基础支持。
xu《细胞生物学实验》教案
实验一细胞形态结构的观察与显微测量（必做）一、实验目的：1．熟悉动物细胞、植物细胞的基本形态结构2．掌握临时装片的制作方法3．掌握显微测量的原理和方法4．掌握生物绘图的方法。
二、实验原理：细胞是生物体结构功能的基本单位，其形态与功能相适应。
不同类型的细胞具有不同的大小、形态和结构，以适应其功能。
通过制作临时装片，可以观察很多细胞的结构，并借助测微尺测量细胞直径，进而获得细胞的体积。
三、实验仪器、试剂及材料：仪器：光学显微镜（每人1台），载玻片、盖玻片、剪刀、镊子、牙签、滴管测微尺（镜台测微尺；目镜测微尺）试剂：1%碘液、瑞氏染液（如果观察血细胞，则需瑞氏染液）材料：洋葱、红辣椒、紫色落葵（或紫罗兰）、血细胞悬液、口腔上皮细胞四、实验步骤：1．洋葱鳞茎表皮细胞的观察在载玻片中央滴一滴1%碘液用剪刀在洋葱鳞茎叶内表面画一个1mm2的方框用镊子撕下表皮在碘液中铺平盖上盖玻片用吸水纸吸去多余碘液（也可帮助排除气泡）显微镜下观察（同法制红辣椒表皮细胞装片）2．人口腔黏膜上皮细胞的观察在载玻片中央滴一滴1%碘液用牙签刮取上皮细胞在1%碘液中搅动分散细胞染色1分钟盖上盖玻片观察3．血细胞观察（见《细胞生物学实验教程》第9页）在载玻片右端滴一滴血用另一张载玻片以30~45度角（两玻片夹角）推移血液成均匀薄膜滴一滴瑞氏染液染色1～3分钟自来水冲洗染液，吸水纸吸干镜检4．显微测量（1）原理： 测微尺由目镜测微尺和镜台测微尺组成，目镜测微尺位于目镜内，为玻璃圆片，上有一条带刻度的直线，精确度较镜台测微尺的低；镜台测微尺是一块载玻片，中央圆形区域内有一带刻度的直线，精确度较目镜测微尺高。
（2）测量：用目镜测微尺的格数度量细胞的大小，目镜测微尺每格代表的实际长度用镜台测微尺来校定。
A 、将镜台测微尺放入载物台上，转动目镜，使二者平行。
选择一处让二者重合，然后向右侧寻找再次重合处，记下二者的数值，并按照目镜测微尺和镜台测微尺的精度关系换算目镜测微尺每小格实际代表的刻度值。
细胞生物学实验
细胞生物学实验
一、细胞培养
1、细胞复苏
将冻存有细胞的冻存管从－70ºC 冰箱中取出，迅速置于已预热37ºC的水浴箱中不断摇动使冻存液在1 min 内解冻。
在超净工作台内吸出细胞悬液并滴加在含6 ml DMEM 培养基的离心管中，放入离心机1 000 rpm 离心6 min, 弃上清液，向离心管中加入DMEM 培养基6 ml 吹打混匀制成细胞悬液种于培养瓶中, 放入37ºC 5%CO2培养箱中继续培养，24 h 内换液，以除去残存冻存液和未贴壁细胞。
2、细胞培养与传代
当细胞长满培养瓶底约85%～90%时弃去原培养液，用PBS 轻洗2～3 次，弃去PBS，加入适量胰蛋白酶液，在倒置显微镜下观察，若胞质回缩，细胞间不再连接成片时，吸弃胰蛋白酶液，加入DMEM 培养基终止消化，轻轻吹打直至细胞全部脱落悬浮，将细胞悬液吸出分装至2~3 个培养瓶中，再加入适量DMEM 培养基和胎牛血清，血清浓度为10%，放入培养箱中静置培养。
传代第2 天吸出原培养
液，加入新培养液。
细胞约2~3 天传代1 次。
3、细胞冻存
细胞冻存前一天更换培养基，观察细胞生长情况，使细胞处于指数生长期。
按照细胞传代的方法收集，去少量细胞悬液在倒置显微镜下进行细胞计数。
然后将细胞悬液吸入离心管，1000 rpm 离心6min，弃上清，吸取细胞冻存液，吹打混匀细胞，使细胞密度为1×107个/ml，将细胞悬液吸入冻存管中严密封口，冻存管做标记。
先将冻存管放入4ºC 冰箱30 min，接着置于-20ºC 冰箱1 h，再移入超低温冰箱中保存。
《细胞生物学》实验指导书(不太全供参考).doc
《细胞生物学》实验指导书（不太全供参考）适用专业:生物科学、生物技术实验目录实验一植物原生质体的分离与融合•••]实验二动物细胞原代培养•••3实验三细胞传代培养…彳实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察••Y实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测“I实验六环境因素诱变染色体改组的观察实验七红细胞膜蛋白的分离及其电泳检测 (11)实验一植物原生质体的分离与融合实验项目类型:综合性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：7学时一、实验目的1.掌握原生质体分离的原理与技术；2.了解细胞融合的基本原理及应用；3.初步掌握PEG融合法和电融合法.二、实验原理植物原生质体是去除了细胞壁的裸露的细胞.原生质体可以从培养的单细胞、愈伤组织和植物器官（叶等）获得.但一般认为从叶肉组织分离原生质体是理想的材料，其优点是材料来源方便，供应及时，而且遗传性较为一致.原生质体的分离通常采用酶解法，对细胞壁成分进行降解后获得.原生质体培养的条件和对营养的要求与组织、细胞相似.但原生质体由于除去了细胞壁,所以需要一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定.常用的渗透压稳定剂包括甘露醇、山梨醇、蔗糖等. 其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响.2个或2个以上的细胞合并成为1个细胞的现象称为细胞融合.细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇(PEG)法和电融合3种方法，其原理基本相同，都是两细胞接触点的膜分子发生重组,然后由于表面张力作用,形成一个球形细胞. 原生质体分离融合和培养的意义：1.除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，为制造新杂种开辟了道路.植物原生质体融合和培养在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景.它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一.2.原生质体可摄入外源DNA,细胞器、细菌或病毒颗粒,这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础.3.获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料.三、实验仪器与材料1.材料:油菜叶子、白菜花2.溶液或试剂:(1)洗涤液:甘露醇0.7mol/L,CaC12 • 2H2O3.5mmol/L,KH2PO4 0.7mmol/L(pH 5.6),高压灭菌；(2)混合酶液:1.5%纤维素酶,1%果胶酶溶于洗涤液中(pH 5.6).(3)50%PEG(4)高pH高钙稀释液：(5)20%蔗糖溶液(6)DPD培养基：3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤(一)原生质体的制备：1.取材:取新鲜油菜叶和白菜花瓣自来水洗净，再用70%乙醇浸泡30S,0.5%次氯酸钠消毒lOmin,无菌水冲洗5次.2.酶解：材料切成1mm宽细丝，加入适量酶液，置摇床上(60〜70rpm),在25〜28°C黑暗条件下，酶解5〜7h.3.分离：用200目网过滤除去未完全消化的残渣，在lOOOrpm条件下离心5分钟,弃上清.加入3〜4ml洗涤液，相同条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml洗液.用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸出，轻轻铺于20% 蔗糖溶液上(5ml离心管装3ml 20%蔗糖溶液)，在lOOOrpm条件下离心5-10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖与洗涤液之间，破碎的细胞残渣沉入管底.用200 u 1移液器轻轻将状态好的原生质体吸出（注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液），放入另一干净的离心管中，加4ml洗涤液,1000rpm离心2-5分钟, 弃上清.（二）原生质体融合：1.将原生质体用DPD调节浓度为1*105个/mL.2.将原生质体混合物滴入小培养皿，静置8〜10分钟.3.然后滴入50%的PEG溶液，静置2分钟.4.依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml高钙高pH洗涤液.注意在第二、三次洗液加入前,用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体破碎死亡;最后用液体培养基洗1〜2次.制片，镜检.五、实验报告画出观察到的融合细胞，并计算融合率.六、思考题1.你认为要获得数量多、生活力强的原生质体，在实验中应注意那些问题？增多数量的方法:多取材且尽量切碎，增加酶浓度，提高酶解温度，延长酶解时间，操作轻柔，勿使原生质体破碎等.提高生活力的方法:取新鲜材料,采用合适的酶浓度、作用温度和时间2.举例说明原生质体融合的应用价值.实验二动物细胞原代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：4学时一、实验目的1.掌握动物细胞原代培养的基本方法和操作过程；2.熟悉原代培养细胞观察方法.二、实验原理用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养.原代培养是建立各种细胞系的第一步，该技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究.分为组织块培养法和消化法两种.三、实验仪器与材料1.材料:小鼠心、肝、脾、肾等2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、解剖器械、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.处死小鼠:将小鼠用颈椎脱臼法处死，放入75%酒精种浸泡消毒.2.取材:在超净工作台中用灭菌的解剖器械剖开小鼠腹腔，辨认并取下肝脏、脾脏和肾脏，放入灭菌的培养皿中，加入Hanks液清洗，然后加入2mL胰蛋白酶液,研磨并过滤.3.将液体转移到离心管,1200rpm离心5min收集细胞,加入适量培养液,C02培养箱培养.4.观察:逐日在倒置镜下观察细胞生长情况.五、实验报告画出细胞贴壁前和贴壁后的形态.六、思考题试述细胞原代培养成功的条件？实验三细胞传代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的1.熟练掌握贴壁细胞传代的培养方法；2.观察传代细胞贴壁、生长、繁殖过程中细胞形态的变化.二、实验原理离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养,细胞将逐渐衰老死亡.传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或其它比率转移，接种到另一培养瓶的培养.贴壁培养细胞的传代通常采用胰蛋白酶消化,把细胞分散成单细胞再传代.三、实验仪器与材料1.材料:原代培养的小鼠细胞或Hela细胞2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出,在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液.(以液面盖住细胞为宜)，静置5~10分钟.2.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆,相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入3〜5ml新鲜培养液,吹打, 制成细胞悬液.3.将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml 左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养.五、实验报告分别画出贴壁生长的小鼠细胞和Hela细胞,并说明二者的不同.六、思考题写出细胞传代培养成功的条件？实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的了解细胞骨架的结构特征及其制备技术二、实验原理细胞骨架是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维.它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换，信息传递，基因表达等起到重要作用.用适当浓度的Triton X-100处理细胞时，可将细胞质膜和细胞质中的蛋白质和全部脂质溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色或间接免疫荧光标记以后，可在显微镜下观察到细胞骨架结构.三、实验仪器与材料1.材料:洋葱鳞茎和口腔上皮细胞2.溶液或试剂：(1)M-缓冲液(2)6mmol/L(pH 6.8)磷酸缓冲液(3)l%Triton X-100(用M-缓冲液配制)(4)0.2%考马斯亮蓝R250(5)3%戊二醛3.仪器或其他用具:光学显微镜、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镶子、小剪刀、吸水纸、擦镜纸等.四、实验步骤1.撕取洋葱鳞叶内表皮若干片,大小约lcm2,置于青霉素小瓶或小烧杯中.2.用磷酸缓冲液(PBS)浸泡片刻.3.吸去磷酸缓冲液，用1% TritonX-100处理20分钟抽提细胞骨架以外的蛋白质,从而使骨架图像更加清晰.4.吸去TritonX-100,用M-缓冲液洗3次，每次3分钟.M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用.5.用3%戊二醛固定15-20分钟6.用PBS洗3次，每次3分钟7.考马斯亮蓝染色15分钟8.蒸馅水洗2次9.置于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察.五、实验报告绘出植物细胞骨架微丝结构图.六、思考题说出各步骤的目的和一些重要试剂的在此处的作用.实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测实验项目类型:创新设计性实验所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：9学时一、实验目的1.了解细胞凋亡的概念和原理;2.掌握细胞凋亡诱导的方法;3.认识细胞凋亡的特征.二、实验原理人体内的细胞注定是要死亡的，目前人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡.坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程.表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢,DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应.凋亡是细胞受到内、外因子刺激后发生的由基因调控的生理性死亡行为.其细胞及组织的变化与坏死明显不同.细胞凋亡的形态学变化: 首先细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后胞质密度增加, 核质浓缩，核膜核仁破碎,DNA降解,胞膜形成小泡，最终为为几个凋亡小体，无内容物外溢,因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬.凋亡细胞DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果,该酶在核小体连接部位切断染色体DNA,这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱,而坏死呈弥漫的连续图谱.三、实验仪器与材料1.鸡血细胞2.溶液或试剂：生理盐水,20mmol/LCaC12顺伯，姬姆萨染色剂，Tris.HCl,SDS, EDTA,乙醇，甲醇，蛋白酶K.3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤（一）细胞凋亡的诱导：1.采鸡血10ml,加0.85%的生理盐水混匀,1200r/min离心5min,弃上清液（重复三次），制备红细胞悬液，然后加入50ml血细胞保存液混匀放于4°C冰箱中备用.2.取4个试管，各加入鸡血细胞保存液2ml,在1号管中加入2ml生理盐水作为阴性对照,2号试管加入2ml 10ug/ml的顺伯溶液作为阳性对照;3号试管中加入2ml 20mmol/L的CaC12溶液进行胁迫处理;4号试管不加任何物质，实验时煮沸5 min使细胞坏死.（二）细胞凋亡的形态学观察：1.处理4h取样，用生理盐水稀释5倍，各取50ul细胞悬液均匀涂布于5 片载玻片上,晾干.2.用甲醇固定2min,然后在载玻片上滴加适量姬姆萨染液染色lOmin.3.用蒸馅水轻轻洗去染液，室温晾干，在光学显微镜下观察细胞形态变化.4.照相，并对试验组细胞进行凋亡计数统计.（三）DNA梯状条带的检测：1.离心收集鸡血细胞，弃上清.2.加入1ml的细胞裂解缓冲液重悬，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20 n 1,混匀.3.在65°C恒温水浴锅中水浴30min（也可转入37°C水浴12〜24h）,间歇振荡离心管数次.4.于台式离心机以12000 rpm离心5min,取上清液入另一离心管中.5.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul吸头挑出, 或12,000转/分离心5分钟，弃上清,晾干.6.用50ulTE 缓冲液(pH8.0)溶解沉淀,并加入RNase A(10ug/ul)5ul,于37 °C 保温10〜15分钟.7.1.2 %琼脂糖凝胶,75 V电压，电泳45 min左右，8.紫外灯下观察并照相.(琼脂糖凝胶电泳:称取 1.2克琼脂糖加入100ml1*TBE),加热使之溶解，取一个凝胶模子，两端用胶布封好，水平放置.将制孔器(即梳子)放在模子一侧约0.5cm处，其底部距模子约1mm.待琼脂冷至约70°C时，加入10ul 0.5mg/ml EB,混匀，倒入模子，待冷却凝固后，取下梳子，撕去两端胶布,放入电泳槽中，使有加样孔的一端放在负极一端.在电泳槽中加入1*TBE至超过凝胶表面约1mm.加入DNA 电泳样:1.5ul DNA 。
细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告实验目的：探究植物细胞与动物细胞在不同条件下的结构和功能差异。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 镜片- 显微镜- 植物叶片样本- 动物组织样本- 注射器或吸管- 0.9% NaCl生理盐水- 甘油或其他透明溶液2. 实验步骤：1. 取一片植物叶片，并在显微镜盖玻片上放上一滴生理盐水。
2. 将植物叶片放在生理盐水中，使用镊子轻轻剪碎叶片，使细胞释放。
3. 将显微镜盖玻片置于显微镜下，调节镜片使其聚焦在细胞上。
4. 观察细胞的结构，包括细胞壁、细胞膜、细胞核等。
5. 取一片动物组织，并在显微镜盖玻片上放上一滴甘油或其他透明溶液。
6. 使用镊子将动物组织放入溶液中，轻轻搅拌，使细胞释放。
7. 将显微镜盖玻片置于显微镜下，调节镜片使其聚焦在细胞上。
8. 观察细胞的结构，包括细胞膜、细胞核、线粒体等。
实验结果：通过观察植物细胞和动物细胞的实验，我们得出以下结论：1. 植物细胞具有细胞壁，而动物细胞没有。
细胞壁是植物细胞的一个重要特征，它能提供结构支持和保护细胞。
2. 细胞膜是植物和动物细胞共有的特征，它控制物质的进出，维持细胞内外环境的稳定。
3. 细胞核是细胞的控制中心，核内含有遗传物质DNA。
无论是植物细胞还是动物细胞，细胞核都是存在的。
4. 植物细胞内含有叶绿体，而动物细胞没有。
叶绿体是植物细胞中进行光合作用的重要器官，能够将阳光转化为化学能。
5. 动物细胞内含有线粒体，而植物细胞也存在但数量相对较少。
线粒体是动物细胞中的能量合成器官，能够产生细胞所需的能量供应。
实验结论：通过本实验，我们明确了植物细胞和动物细胞的结构和功能差异。
植物细胞具有细胞壁和叶绿体，能够进行光合作用，而动物细胞具有线粒体，能够进行代谢和产生能量。
另外，细胞膜和细胞核是所有细胞共有的结构，起着重要的生命活动调控作用。
实验意义：细胞是生命的基本单位，通过深入了解细胞的结构与功能差异，有助于我们更好地理解生物的生命活动和各种生物现象。
细胞生物学实验报告
1、通过对原核和真核各种形态细胞的光学显微镜观察，了解细胞的形态及其显微构造；2、学习显微测量的方法，对细胞的大小有向来观认识。
小白鼠肝细胞切片；鸡血红细胞；蚕豆叶片横切片；普通光学显微镜；目镜测微尺；镜台测微尺；载玻片；盖玻片。
(一)细胞形态观察l、动物细胞的观察〔1〕人肝细胞切片：在显微镜下子细观察肝细胞的形态构造。
〔2〕鸡血细胞涂片的观察：观察血细胞的组成；红细胞、白细胞、血小板的形态特点。
2、植物细胞的观察〔1〕取蚕豆叶片横切片的观察：注意表皮细胞和叶肉细胞的根本构造。
〔二〕细胞的大小和测量1、卸下目镜的上透镜，将目镜测微尺刻度向下装在目镜的焦平面上，再旋上目镜的上透镜。
2、将镜台测微尺刻度向上放在镜台上夹好，使测微尺分度位于视野中央。
调焦至能看清镜台测微尺的分度。
3、小心挪移镜台测微尺和转动目镜测微尺(如目镜测微尺分度含糊，可转动目镜上透镜发展调焦)，使两尺左边的向来线重合，然后由左向右找出两尺另一次重合的直线。
4、记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。
按下式计算目镜测微尺每格等于多少μm：1、目镜校正： 40倍显微镜目镜测微尺每格的微米数2、细胞大小的测量：1、血细胞按含量上下，主要含有：红细胞，白细胞，血小板。
白细胞最大，红细胞次之，血小板最小。
红细胞：主要的功能是运送氧。
白细胞：主要扮演了免疫的角色， 当病菌侵入人体时， 白细胞能穿过毛细血管壁， 集中到病菌入侵部位，将病菌包围，吞噬。
血小板：止血过程中起着重要作用。
细胞形态见以下图。
2、植物细胞普通比动物细胞大一些。
形态图见下。
3、在不同放大倍数下，测定的细胞大小根本一致，但有一些偏差。
放大倍数越大，在视野中同等实际距离下的两点视野距离更大，而更容易测量准确。
1、熟悉PAS 法原理及操作步骤；2、观察PAS 反响的染色结果，并观察多糖在组织细胞中的分布。
多糖是由多个单糖份子缩合脱水而生成的化合物。
一些不溶性的多糖构成植物和动物的 骨架， 如植物的纤维素和动物的甲壳素， 普通称为构造多糖。
细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告摘要：本实验旨在研究细胞的结构和功能。
通过显微镜观察和实践操作，我们对细胞的基本组成、细胞膜的特性以及细胞器的功能进行了研究和分析。
结果表明，细胞是生命的基本单位，各部分之间紧密配合，共同完成细胞的代谢和生长活动。
1. 引言细胞是生命的基本单位，是构成生物体的基本结构单元。
为了深入了解细胞的结构和功能，我们开展了本次细胞生物学实验。
2. 实验材料和方法2.1 实验材料- 显微镜- 盖玻片和载玻片- 显微镜玻璃片- 无菌注射器- 盐水和色素溶液- 植物和动物细胞样本2.2 实验方法2.2.1 制备细胞样本- 取一片新鲜的植物叶片，用剪刀剪下小块，并用无菌注射器吸取盐水和色素溶液分别滴在样本上。
- 取一片洋葱切片样本。
2.2.2 制备载玻片- 取一个载玻片，在玻片的一个小角上滴一滴盐水。
- 把叶片小块或洋葱切片放在盐水上，用另一个载玻片平铺在上方。
- 轻轻按压上层载玻片，让叶片或洋葱细胞均匀涂抹在载玻片上。
- 用棉签擦干载玻片边缘的溶液。
2.2.3 显微镜观察- 将制备好的载玻片放在显微镜台上。
- 转动显微镜的聚焦手轮，使细胞样本清晰可见。
- 观察不同放大倍数下的细胞结构和组织。
3. 结果与讨论在本次实验中，我们观察了植物和动物细胞的结构和功能。
3.1 植物细胞观察- 在低倍放大镜下观察植物细胞，可以看到细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核。
- 在高倍放大镜下观察植物细胞，可以看到细胞质内的细胞器，如叶绿体、高尔基体和线粒体。
3.2 动物细胞观察- 在低倍放大镜下观察动物细胞，可以看到细胞膜、细胞质和细胞核。
- 在高倍放大镜下观察动物细胞，可以看到细胞质内的细胞器，如内质网、高尔基体和线粒体。
3.3 细胞结构与功能的关系细胞的结构和功能密切相关。
不同的细胞器在细胞内部发挥着不同的功能。
例如，叶绿体是植物细胞中进行光合作用的地方，它含有光合色素，能够将光能转化为化学能。
而动物细胞中缺少叶绿体，无法进行光合作用。
细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告目录：1.实验目的2.实验原理3.实验步骤4.实验结果与分析5.实验结论6.实验心得1.实验目的本实验旨在通过观察细胞的结构和功能，了解细胞的基本特征和生物学意义。
2.实验原理细胞是生物体的基本单位，由细胞膜、细胞质和细胞核组成。
细胞膜起着维持细胞内外环境平衡和物质交换的作用；细胞质内含有各种细胞器，如线粒体、高尔基体等，对细胞的代谢和功能发挥重要作用；细胞核则是细胞的遗传物质DNA的储存和转录的场所。
3.实验步骤步骤1：制备观察细胞的标本将动植物组织样本切片并固定在载玻片上，用甲醛或酒精进行固定。
步骤2：观察细胞结构将载玻片放在显微镜下，视野适当调整，首先用低倍镜观察整个组织结构，再用高倍镜观察细胞的细节。
步骤3：细胞核染色在载玻片上滴加少许乙醇溶液，保持片面湿润，然后在玻片上滴加适量的苏丹红G溶液，使其覆盖整个标本，再用玻片一端旋转均匀。
然后，用甲苯将玻片内溶液洗净，再用约10%苏丹红醇溶液染色5-10分钟，最后用水洗净，挤去水分。
步骤4：观察细胞核结构将载玻片放在显微镜下，用高倍镜观察染色的细胞核。
注意观察核膜、染色质和核仁的形态和位置。
4.实验结果与分析通过实验观察，得出以下结果和分析：-细胞膜：细胞膜是细胞的外层包裹结构，具有选择性通透性，能够控制物质的进出。
观察结果显示细胞膜是一个薄膜状结构，包裹着细胞质和细胞核。
-细胞质：细胞质是细胞核和细胞膜之间的区域，包含各种细胞器。
观察结果显示细胞质呈胶状或颗粒状，其中可以看到线粒体、高尔基体等细胞器。
-细胞核：细胞核是细胞的遗传中心，储存了细胞的遗传物质DNA。
观察结果显示细胞核通常为圆形或椭圆形，含有染色质和核仁。
5.实验结论本实验通过观察细胞的结构和功能，深入了解了细胞的基本特征和生物学意义。
细胞膜起着筛选物质进出细胞的作用，细胞质中的细胞器对细胞的代谢和功能起着重要作用，而细胞核则是细胞的遗传中心。
6.实验心得通过此次实验，我进一步了解了细胞的结构和功能。
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冻存细胞的复苏
1、于液氮罐中取出冻存管。
2、37℃水浴锅中摇动，使之快速融化。
3、超净台内酒精棉球擦拭，打开冻存管，吸出细胞悬液，注入离心管中，再滴加2倍培养液，混匀。
4、离心：1500转/分，3分钟，弃上清。
5、吸取2-3ml培养液加入到离心管中，吹打制悬，接种到培养瓶中，37℃培养。
组织块法培养骨骼肌细胞
1、将新生大鼠处死，再用酒精棉球擦拭其全身消毒，带入超净台内于肩关节和髋关节处剪取四肢（去爪），置培养皿中。
2、PBS液中，清理血污，剥去皮肤。
3、用PBS液洗涤两次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
4、用将肌组织从骨骼上剪切下来，PBS液清洗后转移至干净培养皿中。
5、加少量培养液，将组织剪成1mm3小块，用吸管将其转移到培养瓶，贴附与瓶底面。
翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。
入37℃培养箱静置0.5-1小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。
贴壁细胞的传代和冻存
1、超净台中打开细胞培养瓶，用吸管将培养液吸出。
2、加入PBS液，使其覆盖培养瓶底部，轻轻摇动后倒掉。
3、加入消化液，以覆盖整个培养瓶底部，盖好瓶盖，于倒置显微镜下观察，待
见到细胞质回缩、细胞间隙增大后于超净台内倒掉消化液。
4、加培养液终止消化。
5、用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁，制备细胞悬液。
6、将细胞悬液吸入离心管中，离心1500转/分，3分钟，倒掉上清。
7、加入3ml培养液于离心管中，吹打制悬。
8、取2ml细胞悬液进行接种后，剩余细胞悬液继续离心1500转/分，3分钟。
9、去上清，加入1ml冻存液，制悬，转移到冻存管，再按照-4℃1小时→-20℃
2小时→-80℃2小时→液氮的顺序进行冻存。
细胞计数
血球计数板每一大方格长为1mm，宽为1mm，高为0.1mm，体积为0.1mm3，可容纳的溶液是0.1μl，那么每ml溶液中所含细胞数即是视野中每一大方格中数出的细胞数的10000倍。
实验步骤
（一）准备计数板：用酒精清洁计数板和盖玻片，然后用吸水纸轻轻擦干（二）制备细胞悬液：用胰蛋白酶消化单层培养细胞或收集悬浮培养细胞，制成单个细胞悬液。
要求细胞密度不低于104/ml，若细胞数很少，应将悬液离心（1000rpm，3min），重悬浮于少量培养液中。
（三）加样：将盖玻片盖在计数板两槽中间。
用吸管轻轻吹打细胞悬液，吸取少量细胞悬液，在计数板上盖玻片一侧加细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。
否则要将计数板和盖玻片擦干净重新加样。
（四）计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数，细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。
（五）计算：将计算结果代入下式，得出细胞密度。
细胞数/毫升原液=（4大格细胞数之和/4）×104×稀释倍数
转染
Lipofectamine 2000转染试剂转染步骤（24孔板）：
1、转染前一天，胰酶消化细胞并计数，在24孔板内放入玻片，细胞铺板，使其在转染日细胞密度为70-85％。
细胞铺板在1ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
2、配制溶液A和溶液B
（1）溶液A：对于每孔细胞，使用50ul无血清培养基稀释0.8ugDNA，轻轻混匀。
（2）溶液B:使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用50ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。
3、室温下孵育5min。
4、将溶液A逐滴加入溶液B中，轻轻混匀。
室温放置20分钟。
5、将24孔板中的旧培养液吸出，用无血清培养基清洗两次。
6、直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
在4-6小时后观察细胞，更换培养基。
（step1--step6: 转染1）
7、在37℃，5％CO
2
中继续培养。
8、48h后，用荧光显微镜观察。
细胞凋亡检测
1、取洁净盖玻片于多聚赖氨酸中浸泡5min，紫外消毒，无菌超净台内吹干。
将盖玻片置于培养皿中，接种细胞培养，使为50%-80%满。
2、加入H
2O
2
（200μmol/l）刺激细胞发生凋亡，2h后换液，继续培养过夜。
（step1—step2:凋亡1）(H
2O
2
储存浓度为：0.01μmol/μl)
3、取出细胞爬片（注意细胞面朝上），放入玻璃培养皿中，吸尽培养液，用丙酮溶液室温下固定细胞10 min。
4、去固定液，用PBS洗涤2遍，每次3min ，吸尽液体。
洗涤时宜用摇床或手动晃动数次。
5、加入0.5ml Hoechst 33342 染色液，染色5min，也用摇床轻轻晃动，注意避光。
6、用PBS洗两遍，每次3分钟。
7、滴10ul封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免空气，使细胞接触封片液（细胞面朝下），切勿弄反。
8、设空白对照：与试验平行不加H
2O
2
，只加培养液的空白对照。
细胞增殖的检测（MTT法）
1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板（96孔平底板）使待测细胞调密度至5000-8000孔，5%CO
2
，37℃培养过夜。
2、第二天加入浓度梯度的H
2O
2
（0、50、100、200、400、800μmol/l）。
药
物浓度6个梯度,设3个复孔。
3、5%CO
2
，37℃孵育2小时，倒置显微镜下观察，换液，每孔100ul培养液,继续培养过夜。
（step1—step2: MTT 1）
4、每孔加入20ul MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。
5、终止培养，小心去除孔内培养液。
6、每孔再加入150ul二甲亚砜，在酶联免疫检测仪中振荡混匀，使结晶物充分溶解，OD490nm处测量各孔的吸光值。
免疫荧光
1、细胞培养在盖玻片上，长到60-80%时取出（注意细胞面朝上）放到玻璃培养皿中。
2、PBS洗细胞3次，每次3min。
•3、丙酮溶液室温下固定细胞10 min，PBS洗两次，用滤纸吸干多余液体。
•4、10%羊血清温育10min。
•5、弃封闭液，直接滴加约15µL（1：50稀释）抗微管蛋白抗体(一抗)在生长有细胞的盖玻片上，放入湿盒内，4℃孵育过夜。
（step1—step6: MTT1）•6、PBS洗涤3次，每次洗3min。
用滤纸吸去水分，略干燥。
•7、在盖玻片上滴加20 µL左右FITC-羊抗鼠抗体（二抗），放在湿盒内，37℃温育45min，注意避光。
•8、用PBS洗细胞3次，每次5min。
•9、DAPI染色3min。
11、用PBS洗细胞3次，每次5min。
•12、略干燥后，用甘油-PBS(9:1)封片，置荧光显微镜下观察。