水稻转基因实验操作手册整理
水稻转基因组织培养步骤
水稻转基因组织培养步骤农杆菌介导的转化一．试剂1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-58982 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-07533 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-06404 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-51485 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-84076 Kanamycin USB Cat No. 179247 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-72908 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-0109 Cn (Carbenicillin) 国产分装10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-076511 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-866612 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-390213 Inositol Sigma Cat No. I-301114 Phytagel Sigma Cat No. P-816915 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-587916 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-378317 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG二．溶液1.MS maxNH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO4 1.7gMgSO4?7H2O 3.7gCaCl2?2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。
水稻转基因实验技术手册
水稻转基因实验技术手册遗传工程实验室Genetic Engineering Laboratory Discipline of Crop Genetics and BreedingFujian agricultural and Forestry University目录第一章DNA提取与纯化第二章引物设计与PCR第三章感受态细胞制备与转化（E. coli & 农杆菌）第四章电泳技术、琼脂糖凝胶DNA回收第五章质粒回收第六章RT-PCR第七章构建载体互补实验过量表达GFPGUSRNAi第八章水稻组织培养第九章原位杂交第十章石蜡切片技术第十一章扫描电子显微镜附录：第一章SDS-DNA微量提取法1、取新鲜叶片5cm 左右于1.5ml 离心管中，加入液氮研磨（电钻）。
2、加入700μl 预热至65℃的SDS 抽提液，迅速搅匀后置于65℃水浴30min 。
3、加入200μl 5M KAc ，颠倒混匀，-20℃冰浴30min 后，10,000rpm 离心5min ，将上清夜倒入另一新的1.5ml 离心管中。
注：若溶液中仍有植物组织，可进行二次离心。
4、加入等体积的异丙醇（700 μl ），-20℃冰浴30min ，11,000rpm 离心5min 。
5、弃上清，加入70%乙醇清洗液晾干。
6、将风干的DNA 溶于100 μl TE 溶液中，55℃水浴溶解1h ，再室温放置1d 。
实验准备：溶液配制：SDS-抽提液：1M Tris-HCl ：100ml 5M NaCl ：100ml 0.5M EDTA ：100ml 10% SDS ：125mlTE （pH8.0）：1M Tris-HCl （pH8.0）：5ml 0.5M EDTA （pH8.0）：1ml第二章 PCR定容至1000ml定容至500mlPrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer & TaKaRa LA Taq with GC BufferPCR体系和程序第四章琼脂糖凝胶DNA回收*第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇1、在长波紫外下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽力切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。
水稻、玉米、油菜转基因产品内标准基因检测方法及标准化
水稻、玉米、油菜转基因产品内标准基因检测方法及标准化下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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转基因水稻Bt汕优63外源插入结构验证和定量检测方法建立
转基因水稻Bt汕优63外源插入结构验证和定量检测方法建立一、背景介绍Bt汕优63是一种经过基因工程技术改造的转基因水稻品种，通过引入Bt基因，使其具备抗虫特性，有效减少农药使用，保障粮食安全。
为确保Bt汕优63中外源基因插入结构的稳定性和表达量，本研究旨在建立一套针对其外源插入结构的验证和定量检测方法。
二、外源插入结构验证方法1. DNA提取从Bt汕优63植株中提取基因组DNA，作为后续实验的模板。
2. PCR扩增设计特异性引物，针对Bt基因及其侧翼序列进行PCR扩增。
通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，验证Bt基因是否成功插入水稻基因组。
3. 序列分析将PCR扩增产物进行测序，与预期序列进行比对，确认插入位点和序列的正确性。
三、定量检测方法建立1. 实时荧光定量PCR（qPCR）以Bt基因为目标，设计特异性引物和探针，建立qPCR检测体系。
通过标准曲线法对Bt基因在水稻基因组中的表达量进行定量分析。
2. qPCR实验步骤（1）制备cDNA：以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA。
（2）配制qPCR反应体系：包括cDNA模板、引物、探针、dNTPs、Taq酶等。
（3）设置qPCR反应程序：包括预变性、变性、退火、延伸等步骤。
（4）数据分析：采用软件分析Ct值，根据标准曲线计算Bt基因的相对表达量。
四、方法优化与验证1. 优化实验条件：对qPCR反应体系中的引物浓度、探针浓度、退火温度等进行优化，确保检测体系的灵敏度和特异性。
2. 重复性实验：进行多次独立实验，验证检测方法的重复性。
3. 线性范围验证：通过制备不同浓度的标准品，构建标准曲线，验证检测方法的线性范围。
本研究成功建立了Bt汕优63外源插入结构的验证和定量检测方法，为后续转基因水稻的监管、研究和应用提供了有力的技术支持。
通过这些方法，可以确保Bt汕优63中外源基因的稳定性和表达量，为我国转基因作物的发展和安全提供保障。
六、实验操作注意事项1. DNA提取过程中的注意事项确保实验过程中使用的器械和容器无菌，避免DNA污染。
说明使用表型观察,pcr法鉴定转基因水稻的条件(一)
说明使用表型观察,pcr法鉴定转基因水稻的条件(一)说明使用表型观察、PCR法鉴定转基因水稻的条件1. 引言转基因技术的广泛应用使得转基因作物的鉴定成为农业领域中的重要任务之一。
其中，转基因水稻鉴定对于保障粮食安全、推动农业可持续发展具有重要意义。
本文将针对使用表型观察和PCR法鉴定转基因水稻进行详细介绍。
2. 表型观察鉴定转基因水稻的条件转基因水稻的表型观察鉴定通常需要以下条件：•生长环境：转基因水稻和非转基因水稻应在相同的生长环境下进行观察，包括温度、湿度、光照等因素。
确保生长环境的一致性有助于排除其他环境因素对水稻表型的影响。
•对照品种：选择与待鉴定水稻表型相似的非转基因水稻对照品种，用于对照比较观察结果。
这有助于辨别转基因水稻的特异表型特征。
•观察时间点：需要在适当的生长阶段进行观察，以确保转基因水稻的表型特征能够明显表现出来。
通常，在水稻植株出苗、分蘖、开花等关键生长阶段进行观察效果较好。
•观察指标：通过观察转基因水稻在相关生长阶段的形态特征、生理指标等来判断其是否为转基因品种。
例如，观察水稻株高、叶片形态、穗长等指标的变化情况。
3. PCR法鉴定转基因水稻的条件PCR法是一种常用的转基因鉴定方法，也可用于转基因水稻的鉴定。
下面是鉴定转基因水稻所需的条件：•提取基因组DNA：利用合适的DNA提取方法，从待鉴定水稻样品中提取基因组DNA。
确保提取的DNA质量和浓度适宜，以保证PCR反应的准确性和可靠性。
•选择适当的引物：根据需要鉴定的转基因特征，选择适当的引物。
这些引物应与目标转基因序列具有特异性，以确保可靠的扩增结果。
•反应体系设计：根据引物设计PCR反应体系，包括适当的引物浓度、Mg2+浓度、模板DNA浓度等。
并设置负对照和阳性对照，以确保实验的准确性和可靠性。
•PCR反应条件：设置合适的PCR反应条件，包括反应温度、反应时间、循环次数等。
根据引物的特性和PCR仪的要求进行合理调节，确保PCR反应能够成功扩增目标序列。
水稻转基因组织培养步骤
农杆菌介导的转化一．试剂1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-58982 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-07533 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-06404 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-51485 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-84076 Kanamycin USB Cat No. 179247 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-72908 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-0109 Cn (Carbenicillin) 国产分装10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-076511 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-866612 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-390213 Inositol Sigma Cat No. I-301114 Phytagel Sigma Cat No. P-816915 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-587916 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-378317 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG二．溶液1.MS maxNH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO4 1.7gMgSO4∙7H2O 3.7gCaCl2∙2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。
水稻转基因实验操作手册整理
水稻转基因实验操作一、水稻愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织）1．消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌三角瓶中，倒入70%酒精消毒1分钟；2）倒去酒精，加入100ml 3 %次氯酸钠（NaClO）溶液（次氯酸钠：水（V/V）=9:21），放入摇床振荡60分钟；3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿10颗；2）操作完毕用封口膜封好培养皿，在26℃培养箱，（光）暗培养10-15天；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在26℃光（暗）培养箱，继代培养2周（继代两次）。
(没有脱落的可在原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱)二、预培养将继代两次的状态较好的愈伤颗粒，接种到预培养基26℃暗培养4天。
预培养基碳源为20克蔗糖+20ml 50% 葡萄糖（115度灭菌30min）。
乙酰丁香酮（AS）浓度为100 μM (每毫升培养液中加入100 mM的AS 1微升)三、农杆菌（工程菌）培养把-70℃保存的菌种首先用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB液体培养基，在26-28℃，150 r/min振荡培养16-18 h，活化转入打靶载体的农杆菌。
在预培养的第2天，用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB固体培养基划线接种农杆菌菌株，28 ℃静止培养2-3 d。
3 d后将单菌落农杆菌刮入农杆菌悬浮液体培养基或者AAM培养基，28 ℃振荡培养3～4 h。
分光光度计测定菌液浓度，并将其浓度调至0.5-1.0 OD600四、感菌与共培养1）将预培养后的愈伤组织接入100 mL三角瓶,中，加入调制好的农杆菌悬浮液侵染30分钟，期间摇动数次；2）倒去菌液，将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上吸干表面菌液（30-40分钟）；3）将愈伤组织置于共培养基上(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)。
水稻转基因策略-第三版
水稻转化体系的构建（第三版，2015年3年10日）N6D 诱导愈伤，前培养2N6-AS 共培养N6DS 筛选MS-NK 再分化MS-HF 生根AB 农杆菌生长MSL 侵染N6D 1LChu N6 Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99gMyo-inositol 0.1gProline 2.878gCasamino acid 0.3gSucrose 30g2.4-D 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min2N6-AS 1LChu N6 Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99gMyo-inositol 0.1gCasamino acid 0.3gSucrose 30gGlucose 10g2.4-D 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃加1ml AS（200mg/L）不要吹的太干，该培养基要湿度高一些较好。
N6DS 1LChu N6Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99gMyo-inositol 0.1gProline 2.878gCasamino acid 0.3gSucrose 30g2.4-D 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃加1ml cef(100mg/ml) 1ml hyg(50mg/ml)MS-NK 1LMS Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）4.43g （包含0.1g Myo-inositol ）Casamino acid 2gSucrose 30gSorbitol 30gNAA 0.02mg/LKinetin 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃加1ml cef(100mg/ml) 1ml hyg(50mg/ml)MS-HF 1LMS Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）4.43g （包含0.1g Myo-inositol ）Sucrose 30gGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃AB 200mlGlucose 1gAgrose 3gAB Buffer(20倍) 10mlAB Salt (20倍) 10mlddH2O 180ml120℃15min 冷却至50℃加相应的抗生素。
转基因的步骤
1.5 农杆菌介导的水稻快速转化1.5.1 各种培养基成分水稻快速转化的培养基成分如表2-1，N6D培养基用于愈伤组织诱导和筛选，2N6-AS 为共培养培养基，AAM 用于配制农杆菌浸染液，RE-III 为分化培养基，HF 为生根培养基，AB 培养基用于农杆菌的活化。
其中，配制固体培养基时，固定剂使用0.4%的Gerite。
1.5.2 种子的消毒（1）水稻成熟种子去壳；（2）置70%乙醇1min，弃乙醇，用无菌水清洗5 次；（3）在每50ml 的 2.5%次氯酸钠溶液中滴 1 滴吐温20 混匀，然后放入乙醇处理过的水稻种子，浸泡15min，无菌水清洗 5 次；（4）在 2.5%次氯酸钠溶液中再灭菌15min，无菌水清洗 5 次。
1.5.3 种子的接种和愈伤组织诱导将灭菌后的成熟种子平摆于诱导培养基上，在常光照、32℃条件下培养5-8d。
1.5.4 浸染液的制备（1）取出 1.4 中所保存的含有目标质粒的单克隆，吸取50μl 保菌液均匀涂布于固体AB培养基上，AB培养基中含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平，28℃条件下培养2-3d；（2）刮取AB 培养基上的农杆菌，用AAM 重悬农杆菌，用AAM 稀释至OD600为0.1。
1.5.5 愈伤组织侵染和共培养（1）取出诱导5-8d 的水稻愈伤组织，切去胚乳和芽鞘；（2）将生长状态良好的愈伤组织置于浸染液中，浸泡5-8min；（3）取出愈伤组织，置灭菌滤纸上，吸取愈伤组织表面的侵染液；（4）在2N6-AS 培养基上铺一层无菌滤纸，并用AAM 浸湿；（5）将浸染后的愈伤组织均匀平放于2N6-AS 培养基；（6）在25℃、黑暗条件下共培养3d。
1.5.6 抗性愈伤的筛选（1）共培养愈伤组织的洗涤：取出共培养的愈伤组织，放入含400mg/L 羧苄青霉素的抑菌液中清洗，共洗 5 次，每次浸泡6min左右；（2）倒去洗涤液，将愈伤组织移到无菌滤纸上，尽量蘸干愈伤组织表面的液体；（3）将愈伤组织均匀平放于N6D+培养基上，32℃、常光照条件下培养，直到新的愈伤组织长出，需两周左右。
水稻转基因方法及培养基配放个
根癌农杆菌介导的转化方法将水稻成熟种子去壳。
仔细剔除有霉菌点籽粒，取饱满清亮籽粒先用７０％乙醇浸泡（表面消毒）1min ，再用含2%活性氯含量的NaClO溶液（加1-3滴Tween20）浸泡30min以上（最长可至1小时左右），并不断摇动，然后用无菌水冲洗4-5次；将灭菌后的成熟种子置于无菌滤纸上吸干多余水分，直接接种于N2D6培养基上，于24-26ｏC暗培养7-10 天，诱导出初生愈伤组织；将上述从成熟胚诱导的初生愈伤组织直接用于与农杆菌的共培养转化；农杆菌的准备是在含有50mg/mL km的LB 平板上划线，培养含有重组质粒的农杆菌，28ｏC培养36h。
挑取活化的单个农杆菌菌落，在28ｏC于3mL 含km 的LB培养基中振荡培养过夜，第2天按1.5/50（V/V）接种量在AB液体培养基中培养，培养程度以稍早于生长对数期为宜（OD600约为0.6-0.8 ）。
离心回收新鲜培养的农杆菌，并重悬于约1/2-1/3体积的AAM（含100-400mol·L-1乙酰丁香酮）液体培养基中，至OD600约为0.8-1.0左右为宜；将愈伤组织切下，立即投入含农杆菌的AAM重悬液中，浸泡15-20分钟，并不断摇动。
将感染后的愈伤组织置于无菌滤纸上吸干多余的菌液，转入共培养基N6D2C上培养3天（26ｏC，暗培养）。
转入筛选培养基N6D2S1上与24-26ｏC 暗培养条件下筛选2周。
新鲜长出的抗性愈伤组织或不褐化的愈伤组织转入筛选培养基N6D2S2上，继续筛选培养2次，每次2周。
将抗性愈伤组织转入MSPR培养基上进行预分化处理14天，其中先在暗条件下培养7天，然后转入光条件下培养7天；经预分化处理的愈伤组织转入MSR培养基分化再生，在光下培养；再生的小苗在1/2MS0培养基上生根壮苗。
农杆菌介导转化水稻所用培养基-1-1 626蔗糖，2mg·L-1 2,4-D, 2.5g·L-1Phytagel( sigma) ,pH5.8N6D2S1N6D2，25mg·L-1潮霉素B（Roche），500mg·L-1头孢霉素（cefotaxime）N6D2S2N6D2，50mg·L-1潮霉素B，300mg/mL头孢霉素2424442 150mg·L-1KCl, 10mg·L-1CaCl2, 2.5mg·L-1FeSO4·7H2O, 5g·L-1葡萄糖，pH7.0AAM AA（Toriyama和Hinata，1985）盐分和氨基酸，MS（Murashige和Skoog 1962）维生素，0.5g·L-1酪蛋白水解物，36g·L-1葡萄糖，68.5g·L-1蔗糖，100-400µmol·L-1乙酰丁香酮，pH5.2N6D2C N6D2, 10g·L-1葡萄糖，100-400µmol·L-1乙酰丁香酮（用时现加），pH5.2预分化与分化再生MSPR MS（Murashige和Shog，1962）盐分和维生素，0.5g·L-1酪蛋白水解物，50g·L-1蔗糖，2mg·L-16-BA，1mg·L-1NAA, 5mg·L-1ABA ，3.0g·L-1Phytagel, pH 5.8，50mg·L-1潮霉素B，200mg·L-1头孢霉素。
转基因水稻培育实验报告
一、实验目的本实验旨在通过基因工程技术，将具有特定功能的基因导入水稻中，培育出具有抗病、抗虫、抗逆等优良性状的转基因水稻，为我国水稻育种提供新的途径。
二、实验原理转基因技术是指将外源基因导入目标生物体基因组中，使目标生物体获得新的性状或功能。
本实验采用农杆菌介导法将目的基因导入水稻中，通过基因重组，使水稻获得抗病、抗虫、抗逆等优良性状。
三、实验材料1. 水稻品种：Oryza sativa L.（籼稻）2. 抗病基因：Xa213. 抗虫基因：Bt蛋白基因4. 抗逆基因：海藻糖合成酶基因5. 农杆菌：Agrobacterium tumefaciens EHA1056. 实验试剂：限制酶、DNA连接酶、质粒、抗生素等四、实验方法1. 目的基因的克隆与构建（1）从基因库中获取抗病基因Xa21、抗虫基因Bt蛋白基因和抗逆基因海藻糖合成酶基因的DNA序列。
（2）利用PCR技术扩增目的基因。
（3）将扩增的目的基因与载体质粒连接，构建重组质粒。
2. 农杆菌转化（1）将重组质粒转化农杆菌EHA105。
（2）将转化后的农杆菌接种于含有抗生素的培养基中，筛选阳性克隆。
3. 转化水稻（1）将阳性农杆菌接种于含有抗生素的培养基中，培养至对数生长期。
（2）将农杆菌与水稻叶片接触，进行转化。
4. 筛选转基因植株（1）将转化后的水稻苗移栽至田间，进行抗性鉴定。
（2）根据抗性表现，筛选出转基因植株。
5. 分子鉴定（1）提取转基因植株的DNA。
（2）利用PCR技术检测目的基因是否整合到水稻基因组中。
五、实验结果1. 成功构建了含有抗病基因Xa21、抗虫基因Bt蛋白基因和抗逆基因海藻糖合成酶基因的重组质粒。
2. 转化后的农杆菌能够将目的基因导入水稻中。
3. 通过抗性鉴定，筛选出具有抗病、抗虫、抗逆等优良性状的转基因水稻。
4. 分子鉴定结果显示，目的基因已整合到水稻基因组中。
六、实验结论本实验成功培育出具有抗病、抗虫、抗逆等优良性状的转基因水稻，为我国水稻育种提供了新的途径。
转基因水稻中间试验要求
转基因水稻中间试验要求
1.实验目的和设计：中间试验应明确实验目的，并且在试验设
计中包括转基因水稻的基因转导方法、检测方法、结果分析等。
2.样本获取和处理：中间试验应使用符合转基因水稻要求的样本，包括转基因水稻种子、培养细胞等。
在样本处理过程中，应按照转基因水稻的特点，采取适当的处理方法。
3.环境监测和管理：在中间试验过程中，应监测和管理试验环境，包括温度、湿度、光照等条件的控制，以及病虫害防治等。
4.基因检测和分析：中间试验应使用准确的基因检测方法，确
认转基因水稻中是否成功转导了目标基因。
此外，还需要对转基因水稻的性状、产量、抗病虫性等进行分析。
5.安全评估和风险评估：中间试验还需要对转基因水稻的安全
性和风险进行评估，包括对人类、动物和环境等方面的影响评估。
6.试验记录和数据分析：中间试验应详细记录试验过程中的各
项数据，并进行统计和分析，以验证试验结果的有效性和可靠性。
7.伦理审查和法律合规：中间试验应符合伦理审查和法律法规
的要求，确保试验过程符合科学伦理和法律要求。
以上是转基因水稻中间试验的一些基本要求，具体要求还可以根据实验具体情况和法律法规的要求进行确定。
说明使用表型观察,pcr法鉴定转基因水稻的条件
说明使用表型观察,pcr法鉴定转基因水稻的条件说明使用表型观察、PCR法鉴定转基因水稻的条件一、表型观察法鉴定转基因水稻的条件•选择适当的实验材料：准备一批包含转基因水稻与非转基因水稻的样本，确保有足够的样本数量以进行可靠的观察。
•创建合适的对照组：除了转基因和非转基因水稻样本外，还需设置一组非水稻种植物作为对照。
这样可以排除非水稻个体差异对观察结果的干扰。
•确定适当的生长环境：转基因水稻与非转基因水稻在相同的温度、光照、水分和土壤条件下进行生长，以尽量消除环境因素对表型差异的影响。
•进行精细观察：通过裸眼观察或借助显微镜、放大镜等工具，观察水稻植株的生长情况、叶片形态、根系结构、花期等表型特征是否存在差异。
•重复实验：为了提高实验结果的可靠性，需要多次重复实验，每次实验都要使用新的样本，并对实验进行严格的记录。
二、PCR法鉴定转基因水稻的条件•提取样本DNA：从转基因水稻与非转基因水稻样本中提取DNA，采用适当的提取方法，如CTAB法、碱裂解法等，确保获取纯净、高质量的DNA。
•设计引物和探针：根据目标基因的序列，设计适当的引物和探针，用于鉴定转基因水稻中是否存在目标基因的特定片段。
•PCR反应条件优化：确定适当的反应体系，包括引物和探针的浓度、反应缓冲液、酶的加入量、PCR循环参数等，以提高反应的特异性和灵敏性。
•进行PCR反应：使用上述优化后的PCR体系，将样本DNA与引物、探针一起进行PCR反应，扩增目标基因的特定片段。
•PCR产物检测与分析：使用凝胶电泳、荧光定量PCR 等方法对PCR产物进行检测，确定是否存在目标基因的扩增产物。
•结果判断与验证：根据PCR产物的大小、荧光信号等特征，判断样本是否为转基因水稻。
为了验证结果的准确性，可进一步进行测序、比对等实验。
以上是利用表型观察法和PCR法鉴定转基因水稻的基本条件。
在实际操作过程中，需要严格遵守相关实验操作规范，并结合其他鉴定手段，以确保鉴定结果的准确性和可靠性。
水稻转基因步骤
在植物转基因过程中，为了有效地识别和筛选转化子，常将目的基因和标记基因构建在同一表达载体中。
这种载体结构导致转基因植物中目的基因和标记基因始终共存，而标记基因（尤其是抗生素抗性基因）的存在可能给转基因植物的生物安全带来隐患。
目前已研发了多种方法剔除转基因植物中的标记基因，其中最常见的是共转化法(Komari 1996，McCormac 等2001)。
共转化系统是采用2个质粒或1个含有两套T—DNA表达盒的表达载体共同转化植物，其中一套表达盒含有抗性选择标记基因，另一套表达盒含有目的基因，它们转化植物时可能整合到植物基因组的不同位置。
转基因植株在减数分裂过程中，标记基因和目的基因发生分离，从而可在转基因后代中筛选到只含目的基因而不含选择标记基因的个体。
共转化从根本上排除了转基因植物中的选择标记，是保证人畜和环境安全的重要措施，因此受到了广泛的重视。
Zhou 等（2003）认为，用分别含一个T-DNA区的两个载体共转化的效率低于双T-DNA区表达载体的共转化效率。
目前关于利用双T-DNA区表达载体，获得无选择标记转基因阳性株系的研究已有不少报道（唐俐等2006，张秀春等2006，于恒秀等2005）。
花药培养与遗传转化技术相结合，可以快速获得纯合转基因植株（斯华敏等，1999，付亚萍等，2001），但是应用花药培养快速获得只含目的基因而无选择标记的转基因研究尚未见报告。
水稻是最主要的粮食作物，转基因水稻的安全显得尤为重要。
本实验室通过农杆菌介导的水稻转化体系，将包含人乳铁蛋白(hLF)、高赖氨酸(SB401)、高甲硫氨酸(RZ10)基因的表达载体p13HSR成功转化脆茎稻，由于该表达载体采用双T-DNA结构，将检测出含选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）和目的基因的转基因阳性T0植株按单株直接进行花药培养。
在189株二倍体花培植株中检出23株有目的基因没有选择标记hpt的转基因纯合植株，得率为9.87％。
实验七转基因水稻报告基因的检测
四、作业 1.目前在转基因植物研究中常用的报告基因有哪些？ 2.可采用哪些方法对GUS报告基因进行检测？
gus被称为转基因植物的报告基因。
未转基因植物中，β-葡萄糖醛酸糖苷酶酶及其所催化的反 应几乎完全不存在。
Xh LB 35S-ter Xh E Sa P E P S X B Sa
B
H
RB
hpt
35S-pro
232Wx-pro
232Int1 Wx frag
gus
Nos-ter
三、实验步骤
1.取转基因稻米24粒，剥去颖壳。 2.各切1/4胚乳放置于96孔板中，加适量X-gluc溶液 10ul。 3.37º C保温2小时。 4.GUS+、GUS- 计数，并计算比值。
实验七 转基因水稻GUS报告基因的检测
一、实验目的 通过本实验掌握在转基因植物中检测GUS报告 基因（gus）表达活性的操作方法，并掌握通过 GUS阳性和阴性分离比推测外源基中，编码β-葡萄糖醛酸糖苷酶，该酶的
作用底物是无色的X-葡萄糖苷酸（简称X-gluc）。当把表达β葡萄糖醛酸糖苷酶的转基因植物组织与X-gluc一起温育时，该 酶就会将反应体系中无色的X-gluc底物水解产生出深蓝色的5溴-4氯靛蓝。该反应很容易用普通的生化反应检测出来，由此
水稻转基因系的分子鉴定方法
水稻转基因系的分子鉴定1．目的1．1从T2不同转基因株后代中鉴定得到分离出的纯转基因株、杂合转基因株和非转基因株，为根系和生理学实验提供材料；1．2鉴定纯转基因株中插入T-DNA的拷贝数和插入方式；1．3鉴定纯转基因株中插入T-DNA的插入位置。
2．材料中华11 （CK）H05系列石狩白毛（CK）E10系列WD17系列3．主要试剂和配方3.1 DNA微量提取微量提取液：200mM Tris-HCl(pH7.5250mM NaCl25mM EDTA0.5% SDS酚/氯仿氯仿无水乙醇、70%乙醇TE缓冲液（pH8.0）10mg/ml RNase3.2 Htp的PCR鉴定Taq酶及Buffer 购自Takara公司dNTPs购自华美公司3.3 植物DNA大量提取抽提液： 1.5%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)75mmol/L Tris-HCl PH8.01M NaCl15mmol/L EDTA沉淀液： 1%CTAB50mmol/L Tris-HCl PH8.010mmol/L EDTA高盐TE: 1mol/L NaCl10mmol/L Tris-HCl PH8.01mmol/L EDTA3．4 Southern杂交Southern杂交液（1×）:20×SSC 250 mL5%SDS 5 mL10%Sarkosyl 10 mLddH2O 735 mLBlocking Reagent 5 g洗脱液(1x)：20x SSC 10 mL5%SDS 40 mLddH2O 950 mL3.5 RNA提取Trizol: 购自Invitragen公司10×MOPS: 80mmol/L NaAc0.2mol/L MOPS10mmol/L EDTA加DEPC处理的水定容，调pH值至7.0 RNA上样混合物：0.25%溴酚兰0.25%二甲苯菁50％甘油1 mmol/L EDT A1.2%甲醛变性胶(100ml)：1.2g grose73ml DEPC水10×MOPBuffer 10 mL2.2M甲醛 6 mL3.6 RT-PCR反转录酶SuperscriptIII试剂盒购自Invitragen公司 PCR所用试剂同前。
水稻原生质体制备及转化实验方法
单子植物叶片原生质体分离与转化水稻原生质体分离及转化1.需要准备的器材名称名称名称剃须刀片40um尼龙膜0.45um滤膜玻璃皿血球计数板真空泵及适配器70mm培养皿或100ml锥形瓶离心机（水平转子）滤布圆周摇床2ml圆底管10/50ml注射器50ml圆底离心管六孔板2.材料准备水稻种子，先用75%乙醇漂洗1分钟，再用30%次氯酸钠处理20分钟，无菌水洗涤5次以上。
放在1/2 MS培养基上培养2周左右，26℃，12h光照（150 umol m-2s-1）。
使用大玻璃培养杯培养，每瓶可放15粒种子。
40~60株幼苗可以做一次实验，分离出的原生质体量可以转化大约6个质粒。
3.原生质体分离（1）选取幼苗茎干和叶鞘部分分离原生质体，去除水稻顶部的叶子和茎干小的叶鞘，用锋利的刀片切成大约0.5mm宽的条块，可以20~30个放在一起切开；比例大约15ml酶解液/1g材料；（2）切开后立刻转移到0.6M Mannitol溶液中，避光放置10分钟；（3）过滤掉Mannitol溶液，将其转移到配好的酶解液中，避光，真空泵-15~-20 (inHg)抽真空30分钟；（3）再避光酶解5-6小时，同时缓慢摇动（圆周摇床，速度40）；（5）酶解结束后，加入等体积的W5溶液，稍有力地用手水平摇动10秒钟，释放原生质体；（6）使用40um尼龙膜过滤原生质体到50ml的圆底离心管中，再加W5溶液冲洗条块；（7）250 g水平离心3分钟沉淀原生质体，用5 ml移液器吸出上清；（注：离心机需采用水平转子，且升降速不可超过3，否则细胞可能破碎，以下所有离心步骤均需采用此设置。
）（8）加10ml W5重悬原生质体，250g离心3分钟，弃上清；（9）加适量MMG溶液重悬，原生质体浓度为2*106/ml，血球计数器计数。
（注：1、吸取原生质体所用枪头均需剪去枪头尖以防其对细胞造成伤害；2、以上所有步骤在室温进行。
）4.原生质体转化（1）加入10~20ug质粒到2ml离心管中，加入200ul原生质体（大约4*105细胞），再加入220ul新配的PEG溶液，混匀，室温避光放置10~20分钟诱导转化；（2）诱导转化结束后缓慢加880ul W5溶液，轻轻颠倒混匀，250g水平离心3分钟，弃上清；（3）加1ml WI溶液重悬，转移到六孔板中（已预先加入1ml WI溶液）室温（或28℃）暗处培养6~16小时，若用于提取原生质体基因组DNA，需培养48小时。
水稻基因编辑操作流程
水稻基因编辑操作流程一、准备工作。
咱要进行水稻基因编辑呀，那前期的准备可不能马虎。
首先得有合适的水稻材料，就像咱做饭得先准备好食材一样。
一般会选择那些生长状态比较好，生命力旺盛的水稻品种。
这就好比挑选手感好的面团来做面包，基础好才能有好结果嘛。
然后就是各种试剂啦。
基因编辑的试剂就像厨师做菜的调料一样重要。
像CRISPR Cas9系统相关的试剂，这里面包含了很多关键的小部件呢。
还有DNA提取试剂，这是为了能获取水稻的基因信息。
而且呀，这些试剂可得好好保存，要是放坏了，就像调料受潮了一样，整个操作都会受影响。
还有工具酶也不能少。
这些酶就像是小小的魔法助手，能在基因这个微观世界里准确地切割、连接各种片段。
要是没有它们，基因编辑就像没有剪刀和胶水的手工课，根本没法进行。
二、基因编辑的目标确定。
这一步可有趣啦。
我们要确定好到底想对水稻的哪个基因动手脚呢？就像我们给水稻做一个个性化的改造计划。
比如说，想要让水稻更加抗虫，那就得找到和抗虫相关的基因。
这个过程有点像侦探破案，要在水稻众多的基因里找出那个关键的“嫌疑犯”。
有时候可能要查阅好多资料，参考之前科学家们的研究成果，或者自己做一些预实验来确定这个目标基因。
这一步要是搞错了，就好比给一个想减肥的人制定了增肥计划，完全不对路呀。
三、构建基因编辑载体。
这就像是给我们的魔法助手打造一个专属的工作平台。
把我们想要编辑基因的信息都装载到这个载体里面。
载体的构建可不是一件简单的事，就像搭建一个复杂的乐高城堡一样。
要把各种基因片段按照正确的顺序拼接起来，还得保证这个载体在水稻细胞里能够正常工作。
这里面涉及到很多分子生物学的小技巧，像连接酶的使用呀，载体的选择呀。
有时候可能要尝试好几种不同的载体，才能找到最适合的那个。
就像试衣服一样，不合适就得换，直到找到最合身的那一件。
四、水稻的转化。
接下来就是把我们构建好的基因编辑载体送进水稻细胞里啦。
这个过程就像是给水稻细胞送一个神秘的包裹。
水稻转基因实验操作[2]
![水稻转基因实验操作[2]](https://img.taocdn.com/s3/m/ee8ee83143323968011c927c.png)
水稻转基因实验操作（谢越、赵建宁、艾鹏慧、孙淑斌整理）（2006.7）一、水稻（日本晴）愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织）1．消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒1分钟；2）倒去酒精，加入100ml 30%次氯酸钠（NaClO）溶液（5.2%次氯酸钠），浸泡30分钟；3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿12－14颗；2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在30℃光照培养箱，培养4周；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在30℃光照培养箱，继代培养1-2周。
(没有脱落的可在原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱)二、农杆菌（工程菌）培养挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌（EHA105）菌液100µl于4ml YEP（含50mg/LSpec和50mg/L Str）培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0。
三、感菌与共培养1）取培养好的工程菌液1ml于1.5ml离心管中，4℃，5000rmp，离心1min，去上清。
用含200µmol/LAs的30ml AAM感菌液制成悬浮液。
2）将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟（愈伤量没过50ml离心管锥形部位即可）。
3）将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟；4）将愈伤组织置于共培养基上(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)。
28℃（组培室）暗培养2.5天。
四、愈伤组织的抗生素筛选将愈伤组织取出，用无菌水清洗6次，其间需不停的振荡（组培室震荡机最大速率）。
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水稻转基因实验操作一、水稻愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织）1．消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌三角瓶中，倒入70%酒精消毒1分钟；2）倒去酒精，加入100ml 3 %次氯酸钠（NaClO）溶液（次氯酸钠：水（V/V）=9:21），放入摇床振荡60分钟；3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿10颗；2）操作完毕用封口膜封好培养皿，在26℃培养箱，（光）暗培养10-15天；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在26℃光（暗）培养箱，继代培养2周（继代两次）。
(没有脱落的可在原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱)二、预培养将继代两次的状态较好的愈伤颗粒，接种到预培养基26℃暗培养4天。
预培养基碳源为20克蔗糖+20ml 50% 葡萄糖（115度灭菌30min）。
乙酰丁香酮（AS）浓度为100 μM (每毫升培养液中加入100 mM的AS 1微升)三、农杆菌（工程菌）培养把-70℃保存的菌种首先用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB液体培养基，在26-28℃，150 r/min振荡培养16-18 h，活化转入打靶载体的农杆菌。
在预培养的第2天，用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB固体培养基划线接种农杆菌菌株，28 ℃静止培养2-3 d。
3 d后将单菌落农杆菌刮入农杆菌悬浮液体培养基或者AAM培养基，28 ℃振荡培养3～4 h。
分光光度计测定菌液浓度，并将其浓度调至0.5-1.0 OD600四、感菌与共培养1）将预培养后的愈伤组织接入100 mL三角瓶,中，加入调制好的农杆菌悬浮液侵染30分钟，期间摇动数次；2）倒去菌液，将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上吸干表面菌液（30-40分钟）；3）将愈伤组织置于共培养基上(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)。
19-20℃（组培室）暗培养3天。
五、愈伤组织的抗生素筛选将共培养后的愈伤组织取出，用无菌水快速摇动清洗4次，然后加入无菌水浸泡10min,使愈伤内部的菌体游离出来；倒去洗液，再用含400mg/L头孢的无菌水浸泡20min。
再用含400mg/L头孢的无菌水冲洗一次，最后置于无菌滤纸上沥干3h。
第一轮筛选：将沥干的愈伤转入含400 mg/L羧苄青霉素（Car）和400 mg/L头孢霉素的选择培养基（没有选择压力）上，26℃暗培养5-7天；然后将愈伤转到含400mg/L羧苄青霉素（Car）、400 mg/L头孢霉素和50mg/L潮霉素的培养基上进行选择，26℃，暗培养，两周一次，培养两次。
六、抗性愈伤组织的诱导分化和生根1）将筛选获得的抗性愈伤组织接入预分化培养基中，26℃，暗培养5-7天。
2）预分化培养的抗性愈伤转入分化培养基（改用三角瓶或者平底试管）26℃，2000Lx 光照培养，再生转基因植株。
3）待小苗长到3-5cm;转入生根培养基上发根。
4）将根系健壮的植株移入盆砵，凉棚过渡3-5天；然后移到自然条件下生长，直至成熟。
注：分化过程中不可将愈伤继代培养，转基因苗从分化到移栽时间大约为三个月左右。
将根部和茎叶分化得较完好的苗从试管挑出（苗长至试管顶部，就要及时开盖），打开封口膜，加入适量无菌水（防止培养基长菌），炼苗3天至一周左右，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，检测。
以上操作步骤皆在无菌条件下进行。
七、转化苗的检测验证1）GUS检测：将准备好的材料浸泡在染液里，37℃保温过夜。
GUS染液成分见附录。
2）GFP检测：将材料放在共聚焦显微镜下观察成像。
3）PCR检测：设计潮霉素抗性基因引物HYG-F 5` CTTCTGCGGGCGATTTGT 3` HYG-R 5` CAGCGTCTCCGACCTGAT 3` PCR 反应条件为：95℃变性5min，55℃退火2min，72℃延伸2min，72℃保温10min。
反应结束后，PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。
4）潮霉素快速检测转基因幼苗的方法（具体见附录）。
附录：各种母液及培养基的配制方法一、激素的配制激素溶解方法母液浓度6-BA; KT100mg样品加稀碱1ml振荡溶解（1M KOH），再用蒸馏水定容100mL；4℃保存1 mg/mlNAA; IAA100mg样品加稀碱1ml振荡溶解（1M KOH），再用蒸馏水定容100mL；4℃保存1 mg/ml2，4-D 2,4-D 100 mg加少量酒精溶解，再用蒸馏水定容100mL; 4℃保存1mg/mlAS 0.196g AS加10mL二甲基亚砜（DMSO）溶解，用1.5mleppendorf管分装成小份-20℃贮存。
配制时注意带乳胶手套操作。
100mM1）抗生素链霉素（Str）50mg/ml：溶解0.5g链霉素硫酸盐于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存。
利福平50mg/ml：溶解0.5g利福平于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存壮观霉素（Spec）125mg/ml：溶解1.25g壮观霉素于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存。
羧苄青霉素（Car）400mg/ml：溶解4g羧苄青霉素二钠盐于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存。
头孢霉素400mg/ml：溶解4g头孢霉素于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存卡那霉素（Kan）50mg/ml：溶解0.5g卡那霉素于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存。
二、各类基本培养基成分表：1）有机母液储存液（4度保存）：B5 有机工作液为从序号为1、2、3 各取1mL；序号4取10 mLMs 有机工作液从序号为1、2各取0.5mL, 3取40μl；4取10ml;5取1mlN6 有机工作液从序号为1、2各取0.5 ml ,3取100μl；4取10ml;5取1ml2）铁盐配制（4度保存）：注：配制顺序如下1.称取2.78g FeSO4·7H2O溶解于200ml去离子水中（A）。
2.称取3.73g Na2-EDTA·2H2O溶解于200 ml去离子水中（B）。
3.将B置于70℃水浴锅中直至溶质完全溶解（C）。
4.将A倒入C中混合，置于70℃水浴锅中保温2h。
5.定容至1L。
三、农杆菌生长的YEP液体培养基配方（每升含量）：酵母提取物1g蛋白胨10g蔗糖5gMgSO4·7H2O 1.027pH 7.0-7.4灭菌结束后加抗生素至终浓度为：利福平50mg/L壮观霉素（Spec）125mg/L四AA培养基储存液(室温储存)微量元素配制中Na2MoO4·2H2O 单独溶解后与其他物质混合后定容到1L,室温保存。
3）水稻苗期水培营养液配方：注:1．制备大量元素营养液母液时，各种盐类分别溶解，分别储存，使用时每升营养液加1mL 母液。
2．制备微量元素营养液（除Fe外）时，先放500mL去离子水，称取各种盐类逐一溶解后，入容量瓶加蒸馏水稀释至1L，制成母液，使用时每升营养液加1mL母液。
3．Fe的制备：溶解5.57g FeSO4·7H2O于200 mL蒸馏水，再另溶解7.45g Na2-EDTA 200mL 蒸馏水中，加热Na2-EDTA（大约70度），加入FeSO4·7H2O，不断搅拌，然后于70度恒温箱中螯合2h，冷却定容至1L，储于棕色瓶中，使用时每升营养液加1mL母液。
4．调节pH为5.5。
5．铵营养时，加入硝化抑制剂（双氰胺），每升营养液加2mg双氰胺（终浓度）。
各人配制时，应注意所用的盐类和分子量，检查盐用量准确无误。
五、GUS染色液配方(1)制备方法：A液：称取NaH2PO4·2H2O3.12g溶于蒸馏水，定容至100ml。
B液：称取Na2HPO4·12H2O7.17g溶于蒸馏水，定容至100ml。
(2)取100ml B液与40ml A液混合（混合后pH值约7.03），用NaH2PO4·2H2O调至pH7.0。
(3)染色液：说明：1.除了TritonX-100, 甲醇, X-Gluc不用灭菌外其他的母液都要灭菌.其中K3[Fe(CN)6]和K4[Fe(CN)6]要用过滤灭菌的方法2.GUS活性的精确定位需要有亚铁离子。
GUS酶水解其底物X-Gluc产生可溶性无色的吲哚基衍生物，它可扩散到其他部位，必须经氧化缩合成二聚体，才能形成不溶性的蓝色沉淀，二聚体化由氧化催化剂(如亚铁氰化钾、过氧化物酶或过氧化氢酶等)催化，若不加Fe2-，则仅形成可溶性中间产物而扩散，加亚铁氰化钾后因吲哚基二聚体化而不扩散，不溶性蓝色沉淀形成越快，GUS酶的定位越精确。
材料准备：(1) 瞬时表达检测取浸染后的愈伤，稳定表达取分化前的愈伤。
(2) 叶片、幼根等制成徒手切片（或剪成小块、小片）。
直接染色法将准备好的材料浸泡在染液中，于37℃保温过夜。
六、潮霉素快速检测转基因幼苗的方法1、检测培养基成分：0.7% agar，1ml/L的6-BA，200mg/L的Hgy。
方法：先将只含有agar的去离子水煮沸，等冷却至55℃时加相应浓度的6-BA和Hgy，倒至培养皿中。
注：6-BA用于叶片的保鲜，检测培养基的配制无需灭菌处理，但培养皿需要烘干。
2、取样剪取并收集待检测苗1cm左右长的新鲜绿色叶片（两端均留有切口），平放于培养基上，30℃，16h光/8h暗培养48h,叶片依旧保持鲜绿的即为阳性植株，而阴性幼苗的叶片出现块状坏死。