石蜡切片的制作过程

石蜡切片的制作过程
（一）花药切片制片法
1．取材
2．固定：FAA液中固定24h，并保存在其中。

3．脱水：经70％乙醇、85%乙醇，每级3~4h，含1%伊红的95％乙醇中3~4h（可以过夜），无水乙醇2次，每次1~2h。

4．透明、加蜡：5级氯仿透明，每级3~4h，纯氯仿2次，每次2h，加碎蜡，然后置36℃温箱中1~2d
5．浸渗、包埋：50%、70%蜡各3h，再经纯蜡A、纯蜡B、纯蜡C三杯，每杯1h，包埋。

6．修蜡块、切片：粘蜡块时组织块直立于台木上，并用单面刀片切除先端石蜡，浸水软化后放在切片机上坐横切片，切片厚12μm。

7．展片、粘片、烘片：蜡片先镜检，每张载玻片上放2个蜡片，展片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃温箱中烘干。

8．脱蜡、透明：二甲苯脱蜡、透明各1次。

9．染色（番红-固绿双重染色）：在已脱蜡的材料上滴注无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、蒸馏水各4~5s，苯胺番红染色5~10min，用蒸馏水洗去浮色。

10．脱水、透明：各级乙醇脱水（30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇），苯胺固绿复染30~40s，再经95%乙醇，无水乙醇，1/2无水乙醇+1/2二甲苯、二甲苯2次，各约4~5s，最后置二甲苯缸中。

11．封片、烘片：加拿大树胶封片。

封片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃左右的温箱内烤数天即可烤干。

最后，将干燥好的切片上的浮色擦净，并在玻片的左端粘上标签，注明组织切片的名称、染色方法、固定方法、年月日。

制片日程
（二）花芽纵切片制片法
1．取材
2．固定：FAA液中固定24h，并保存在其中。

3．整染：经70％乙醇、50%乙醇各2~4h，转入爱氏苏木精稀释液（爱氏苏木精原液1份，加入50%乙醇及乙醇各半的混合液1份）中整染2~3d。

4．水洗、反蓝：蒸馏水浸洗，勤换水至无浮色渗出，再转入自来水中，换1~2次水，至样品由紫色变深蓝色为止，共需时约1d。

5．脱水及复染：经30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇，每级3~4h。

含0.5%~1%伊红的95％乙醇中4~6h（可以过夜），无水乙醇2次，每次2h。

6．透明、加蜡：5级氯仿透明，每级2~4h，纯氯仿2次，每次2h，加碎蜡，然后置36℃温箱中1d。

7．浸渗、包埋：50%、70%蜡各3h，再经纯蜡A、纯蜡B、纯蜡C三杯，每杯1h，包埋。

8．修蜡块、切片：纵切花芽，切片厚8μm。

9．展片、粘片、烘片：蜡片先镜检，每张载玻片上放2个蜡片，展片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃温箱中烘干。

10．脱蜡、透明：二甲苯脱蜡、透明各1次。

11．封片、烘片：加拿大树胶封片。

封片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃左右的温箱内烤数天即可烤干。

制片日程
（三）子房纵切片制片法
1．取材
2．固定：纳瓦申固定液中固定24h。

3．保存：经30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇，每级30min，并保存于70%乙醇中备用。

4．脱水：经85%乙醇，含0.5%~1%伊红的95％乙醇中3~4h，无水乙醇2次，每次2h。

5．透明、加蜡：5级氯仿透明，每级3~4h，纯氯仿2次，每次2h，加碎蜡，然后置36℃温
箱中1~2d
6．浸渗、包埋：50%、70%蜡各3h，再经纯蜡A、纯蜡B、纯蜡C三杯，每杯1h，包埋时子房横卧，使扁平面与纸盒底部平贴。

7．修蜡块、切片：沿子房扁平面纵切，切片厚12μm。

镜检，只保留切到胚囊的蜡片，其余淘汰。

8．展片、粘片、烘片：蜡片先镜检，每张载玻片上放2个蜡片，展片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃温箱中烘干。

9．脱蜡、透明：二甲苯脱蜡、透明各1次。

10．复水：1/2无水乙醇+1/2二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、蒸馏水。

11．媒染：4%铁矾10min。

铁矾即绿矾，硫酸亚铁。

12．水洗：自来水流水洗10min。

13．染色：0.5%苏木精10min。

14．水洗：自来水流水洗5min。

15．分色：2%铁矾分色至适度（镜检确定）。

16．水洗、反蓝：自来水流水洗10~15min至反蓝。

17．脱水、透明：滴注蒸馏水、各级乙醇脱水（30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、），含1%伊红的95％乙醇中复染，再经无水乙醇，1/2无水乙醇+1/2二甲苯、二甲苯滴注后，置二甲苯缸中。

18．封片、烘片：加拿大树胶封片。

封片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃左右的温箱内烤数天即可烤干。

超薄切片法
（一）以Epon 812为包埋介质的植物组织制样流程
1 取材：常温取样，低温保存（0~4℃）。

2 固定和浸洗：1%~3%戊二醛固定液固定2h，最多不超过1周。

PBS缓冲液20~30min(更换1~3次)，然后1%~2%OsO4固定液固定1~2h，PBS缓冲液20~30min(更换1~3次)。

3 脱水：30%丙酮水溶液，50%丙酮水溶液，70%丙酮水溶液（或冰箱过夜）10~20min，在常温条件下，90%丙酮水溶液，100%丙酮水溶液，“纯丙酮”（更换2次）每次10~20min。

4 渗透：Epon 812混合液：纯丙酮（1:3）12h，Epon 812混合液：纯丙酮（1:1）12h，Epon 812混合液：纯丙酮（3:1）12h，Epon 812混合液（35~40℃）12h。

5 包埋和聚合：将组织放入胶囊（或包埋板）中，加入新鲜的Epon 812混合液，放烘箱中加热35℃12h ，45℃12h ，60℃24h ，树脂聚合后，待冷却到室温，进行切片。

6 制刀：用制刀机制出刀刃锋利的玻璃刀。

若用钻石刀则省略此步。

7 修块：经粗修，将包埋块修整合适。

8 切片：在切片机上固定好包埋块和切片刀，调整刀位后对刀、进刀，完成细修后切片，厚度60~80μm，铜网捞片，风干或灯下烤干。

9 染色：常规铅-铀染色。

（把一张滤纸平铺在有盖平皿底部。

用配制染剂的溶液将其润湿，上放一小片干净牙科蜡。

将染液滴于蜡块上，迅速盖上平皿盖。

将欲染载网浮在液滴上，注意切片朝下。

一般采用铀-铅双染法：先用1～3％醋酸双氧铀水溶液或70％酒精溶液将载网按上述方法染20～30min。

染后必须清洗，一般用钟表镊子夹载网浸入清洗液中，反复清洗，清洗液可放在试管中或小瓶中。

经三瓶清洗液即可。

注意将镊子中间夹缝液体用一小片滤纸将其吸干。

用硝酸铅与柠檬酸钠配制成柠檬酸铅，将其溶于氢氧化钠，可得到稳定的强碱溶液（pH12）。

染、洗方法同前。

用铅染时，可用0.1MNaOH浸湿滤纸，以吸收空气中CO2，防止生成碳酸铅沉淀污染切片。

或将NaOH放在牙科蜡周围。

配制染液用的蒸馏水应煮沸10min以驱除CO2，染毕，用0.02NNaOH(准确称取取0.8g的氢氧化钠，溶于500ml蒸馏水中，再移入到1000ml容量瓶中，定容至刻度。

)和无CO2蒸馏水连续冲洗以除去载网上多余染液，载网清洗后置于培养皿的滤纸上干燥。

）
10 镜检：将染色后的切片放入干燥器中干燥后，在透射电镜下观察实验结果。

（二）整体样品表面结构观察的制样方法
1 取材：取样要准确，体积不宜过大，以减少不必要的观察量。

取样时动作要轻巧，防止挤压损伤样品。

2 固定：一般采用双固定法，即先用1%~3%的戊二醛/缓冲液在室温或4℃下固定。

一般单细胞可固定10~30min，较大的样品固定1~2h，甚至更长，再用1%OsO4/缓冲液在4℃下固定30~60min。

3 清洗：对于表面凹凸不平，且粘有很多杂质的样品，在固定前后都要进行彻底的清洗，以免影响成像的质量。

一般采用缓冲液冲洗法：缓冲液在4℃下彻底冲洗3次，每次15min。

4 脱水和置换：用系类乙醇或丙酮逐级脱水。

一般30%，50%，70%，80%，90%，100%，每步15~20min。

用乙酸异戊酯置换100%的乙醇，在室温下，置换20min以上。

5 干燥：CO2临界点干燥(1 置换：把已经固定好，并脱水到100%乙醇的样品浸入乙酸异戊酯中20min以上，室温或4℃。

2 仪器准备：打开总电源，先向HCP-2中注入少量液体CO2，再用放气阀排出，以检排放是否通畅。

同时对样品室预降温，以低于室温10℃为宜。

3 准备样品：把样品笼的底和盖都垫好干净的滤纸，并滴上乙酸异戊酯，将样品面朝上放入，扣牢样品笼盖。

将样品笼放入样品室，用旋转棒旋紧样品室盖。

4 注入液体CO2：打开进气阀，控制流量，使液体CO2缓缓进入样品室。

通过观察窗判断液面，以液面充盈样品，略高出样品笼高度为宜。

压力表指示60~70kg/cm2。

注入完毕时，将进气阀关闭。

5 调温：调节控温钮至20℃，保持15~20min，使液体CO2充分置换乙酸异戊酯。

然后再调节至35~4 0℃，使压力维持在73kg/cm2以上，不要超过110kg/cm2，稳定后维持5~10min。

6 排气：在维持原温度的条件下，轻轻打开慢排气控制钮，控制排气量，以计量管中的小球悬浮在中间微微地上下跳动为宜，或使排气管在水中吐出的气泡既连续不断又可数清为宜。

7 取出样品：气压降至零后，将温度调至略高于当时室温，打开盖，取出样品，迅速放入玻璃干燥器中。

)。

6 粘样：将干燥好的样品用导电胶或双面透明胶纸粘在样品台上，做好标记。

7 喷涂：喷涂要在真空条件下进行，有专门的仪器，一般喷涂10~20μm厚的金或铝，使样品有良好的导电性，能顺利释放二次电子。

离子溅射镀膜法:1 样品准备：将样品充分干燥。

2 样品放置：样品放在靶电极的正下方，间隔2.5~3cm。

样品个数不限，但总面积不能超过靶面积的30%，并盖好真空罩。

3 抽真空：达0.01托（1Torr=1 mm Hg=133 Pa）。

4 加高压：先定时2min，再打开高压开关，并调节放电电压（1200~1400V），此时电流应达5mA以上。

5 镀膜：先确认电流指示已达到2mA以下，再慢慢打开针状阀门，将电流指示调到7~9mA，并保持30s。

接着再微微关闭针状阀门，将电流调到5~6mA，镀膜，直到所定时间结束，镀膜完毕。

真空喷镀镀膜法：1 把样品放在样品台上，盖好钟罩，抽真空至10-6~10-5托。

2 慢慢带来加热器，使金-鈀合金丝缓慢融化并蒸发。

3 打开样品台的倾斜装的速度旋转约1min，完成喷镀。

一般膜厚3~30nm。

4 关闭加热器，停留若干分钟，使样品镀膜稳定，再缓缓向钟罩中放入空气，直至恢复到标准大气压后，再取出样品。

常用固定液的配制
1. 福尔马林-醋酸-酒精固定液(FAA)
50%或70%酒精90ml + 冰醋酸5ml + 福尔马林(37%~40%甲醛)5ml
可用作固定植物的一般组织,但不适用于单细胞及丝状藻类,也不适宜作细胞学研究。

幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，可防止材料收缩。

若材料坚硬，可略减冰醋酸，略增福尔马林。

若材料易收缩，可稍增加冰醋酸。

久置时另加入5ml甘油以防蒸发和材料变硬。

此液又可作保存液。

固定时间最多10h。

如果用在植物胚胎的材料上，改用下面的配方，效果较好：50%酒精89ml + 冰醋酸6ml + 福尔马林5ml。

2. 福尔马林-丙酸-酒精固定液（FPA）
福尔马林5ml + 丙酸5ml + 70%酒精90ml
固定一般的植物组织，通常固定8~24h，可长久保存。

3. 酒精-醋酸-氯仿固定液（卡诺固定液，Carnoy fixative）
配方Ⅰ：纯酒精3份+ 乙酸1份
配方Ⅱ：纯酒精6份+乙酸1份+ 氯仿3份
配方Ⅲ：甲醇6份+乙酸1份+ 氯仿3份
4. 7. 铬酸-醋酸-福尔马林混合液
这3种药品混合在一起所配成的各种固定液，通常称纳瓦申固定液（Nawashin fixative），简称Craf。

配方见下表：
甲、乙两液均为贮备液，使用之前才将二者混合。

适用于组织学和细胞学的研究材料。

柔嫩而含水多的材料，可选用Ⅰ或Ⅱ固定，坚韧而成熟的材料，可用高浓度的Ⅳ或Ⅴ，一般材料
多用Ⅲ。

制作染色体和有丝分裂的纺锤体标本时，常用桑弗利斯固定液。

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ固定液的固定时间为12~48h，桑弗利斯液固定时间为4~6h。

常用粘贴剂及其配制
1 蛋清甘油及其配制
将鸡蛋一个打破让蛋清流入烧杯内，用筷子充分条大雪花状泡沫，然后将它用双层纱布过滤到量筒中，经数小时或一夜，过滤出透明的蛋白液，此时再加入等量的甘油，稍稍振摇使两者混合，最后加入麝香草酚（thymol）（1:100）做防腐作用，可保存几个月到一年（4℃冰箱中）。

常用染料的配制
1苏木精水溶液
0.5g苏木精溶入100ml煮沸的蒸馏水中，静置24h后可使用。

2爱氏苏木精（Ehrlich’s haematoxylin）
苏木精1g + 无水或95%酒精50ml + 蒸馏水50ml + 甘油50ml + 冰醋酸5ml + 硫酸铝钾（钾矾）3~5g。

配制时，先将苏木精溶于酒精中，然后依次加入蒸馏水、甘油和冰醋酸，最后加入研细的钾矾，边加边搅拌，直到瓶底出现钾矾结晶为止。

混合后溶液颜色呈淡红色，放入广口瓶中，用纱布封口，自然氧化1~2月，至颜色变为深红色时即可过滤备用，可长期保存。

若加入0.1g碘酸钠即可成熟。

已成熟的原液，须用瓶塞密封，置低温暗处长期保存。

3 番红水溶液
番红0.1g溶入蒸馏水,定溶至100ml。

用前过滤。

4 番红乙醇溶液
番红1g溶入50%（或95%）酒精,定溶至100ml。

用前过滤。

5 苯胺番红液
番红5g，95%乙醇50mL，蒸馏水450mL ，苯胺20mL。

用前过滤。

6 固绿染液
固绿0.1g溶入95%酒精，定溶至100ml。

用前过滤。

7 苯胺固绿染液
固绿1g溶入95%酒精40ml，苯胺10ml。

用前过滤。

8 伊红水溶液：伊红0.1~1g、蒸馏水100ml。

伊红乙醇溶液：伊红0.1~1g、95%酒精溶液。

100ml。

10×PBS缓冲液:800ml蒸馏水+80g NaCl+2g KCl+14.4g Na2HPO4+2.4g KH2PO4用HCl 调pH7.4，定容到1L。

高压蒸汽灭菌20min，室温保存。