观察Zc3h12d在急性肺损伤大鼠肺中的表达情况

观察Zc3h12d在急性肺损伤大鼠肺中的表达情况

小肠缺血再灌注损伤( small intestinal ischemia-reperfusion injury，IIＲI) 是一种临床常见的病理现象，常危及生命。肠系膜上动脉( superior mesentericartery，SMA) 阻塞或失血性休克等许多损伤因素都能导致小肠缺血再灌注损伤的发生。小肠缺血再灌注可导致严重的局部创伤并引起多器官功能障碍，常可累及到肺组织，而且有研究显示继发的急性肺损伤( acute lung injury，ALI) 或/和急性呼吸窘迫综合征( acute respiratory distress syndrome，AＲDS) 是造成小肠缺血再灌注损伤病人死亡的主要原因。因此，为找到新的防治措施，降低小肠缺血再灌注损伤患者的死亡率，进行小肠缺血再灌注肺损伤分子机制的研究是非常关键和必要的。具有CCCH 锌指结构域的蛋白12D( zinc fingerCCCH type containing 12d，Zc3h12d) ，也称为TFL 或P34，是近期发现的包含单个锌指结构域蛋白家族中的一员，拥有相对分子质量( Mr) 58 000 和36 000 两种剪接体，在炎症因子或脂多糖( lipopolysaccharide，LPS) 刺激单核细胞时其表达量会发生变化，从而对细胞的生理和病理过程产生影响。然而Zc3h12d 在动物肺损伤中的表达尚未见报道。本实验通过建立大鼠II Ｒ肺损伤模型，初步观察Zc3h12d 在急性肺损伤大鼠肺中的表达情况并探讨其可能的作用及意义，为进一步了解IIＲ肺损伤发生、发展的分子机制奠定基础。 1 材料和方法1．1 材料纯化LPS、兔抗大鼠β-actin 抗体、辣根过氧化酶标记的兔抗山羊IgG、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 购自Sigma 公司; 山羊抗大鼠Zc3h12d 抗体购自Santa Cruz 公司; 大鼠TNF-α、IL-1β ELISA 试剂盒购自北京鼎国生物技术公司; 两步法免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司; TＲIzol 试剂盒、逆转录试剂盒及实时定量PCＲ( realtime quantitative PCＲ，qＲT-PCＲ) 试剂盒购自大连TaKaＲa 公司; SDS 细胞裂解液、ECL 显色液购自西安晶彩生物技术公司; BCA 蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。电热恒温干燥箱为北京科伟永兴仪器有限公司产品，荧光显微镜为徕卡公司产品，紫外分光光度计为Beckman 公司产品，实时定量PCＲ仪、Western blot 蛋白电泳仪为Bio-Ｒad公司产品。1．2 方法1．2．1 实验动物分组与模型制备健康雄性SPF 级SD 大鼠40 只，体质量200 ～230 g，由第四军医大学动物实验中心提供。大鼠随机分为对照组( contro1) 、缺血再灌注30 min 组( IＲ30 min) 、缺血再灌注60 min 组( IＲ60 min) 和缺血再灌注120 min 组( IＲ120 min) ，每组10 只，均适应性饲养7 d 后用于实验。实验前禁食12 h，自由饮水。10 g/L 戊巴比妥纳40 mg / kg腹腔注射麻醉，经大鼠口气管插管并连接呼吸机。麻醉后常规备皮消毒，行正中开腹手术，切口3 ～4 cm 入腹，探查大鼠腹腔内情况; 探查后将全部消化道及网膜向右掀起，找到腹主动脉分支肠系膜上动脉( superior mesenteric artery，SMA) 并钝性分离; 对照组大鼠缝合切口，3 个缺血再灌注组以无创伤动脉夹夹闭SMA 起始部，缺血60 min 后恢复再灌注，分别再灌注30 min、60 min 和120 min; 过量戊巴比妥纳腹腔注射，麻醉处死。1．2．2 肺组织湿质量/ 干质量( W / D) 比值测定取大鼠右肺上叶称取质量为湿重，而后放入70℃恒温干燥箱中烘烤12 h 称质量为干质量，以湿质量/干质量得出肺湿干质量( W/D) 比值。1．2．3 ELISA 检测血清及肺组织上清液中IL-1β 及TNF-α 水平心脏取血制备血清，取左肺叶一部分制备组织匀浆液，采用ELISA 检测血清及肺组织上清IL-1β 及TNF-α 的水平。心脏取血约3 mL，37℃水浴加热30 min 后，4℃ 2 000 g 离心20 min，收集上清即血清，取肺组织约300 mg，用0．01 mmol / LPBS( pH7．4) 1．5 mL 充分匀浆后，4℃ 12 000 g 离心20 min，收集上清，两者均采用双抗体夹心ELISA 进行检测。1．2．4 肺组织病理学检查取右肺中下叶置于100 mL / L 的中性甲醛中固定24 h、梯度酒精脱水、石蜡包埋，保存于4℃ 。使用时切片( 厚度 3 μm) 、HE 染色、中性树胶封片，光镜下观察肺组织病理形态学改变。

1．2．5 肺组织Zc3h12d 蛋白免疫组化染色肺组织石蜡切片常规脱蜡至水后，尿素消化; 柠檬酸缓冲液中微波加热修复抗原，50 g/L 过氧化氢封闭内源性过氧化物酶。按两步法免疫组化染色: 滴加BSA 封闭30 min，封闭后甩去BSA，加山羊抗大鼠Zc3h12d 抗体，4℃冰箱孵育过夜; 37℃水浴复温45 min，滴加辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊二抗室温孵育45 min; DAB 显色、适时终止; 苏木素复染胞核，中性树胶封片。光学显微镜下观察拍照。阴性对照以PBS 代替一抗。1．2．6 qＲT-PCＲ检测使用TＲIzol 试剂盒提取肺组织总ＲNA，紫外分光光度计测定ＲNA 含量、纯度。根据含量将提取的ＲNA 调制成相同浓度，进行逆转录，Zc3h12d 上游引物为5' -GGTCAGCACAATCCACCATCA-3' ，下游引物为5' -TG-TATCCCACCTACCCAAGCA-3' ; 内参照为β-actin，上游引物为5' -GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3' ，下游引物为5' -GACT-CATCGTACTCCTGCTTGCTG-3' 。反应条件为37℃ 孵育40 min，70℃ 10 min。使用SYBＲGreen℃Ｒeal Time PCＲ法扩增cDNA，扩增条件: 95℃ 10 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，重复30 个循环。以β-actin 为内参照，使用2－℃℃Ct相对定量计算公式计算Zc3h12d 的mＲNA 相对表达量。1．2．7 Western blot 检测肺组织Zc3h12d 蛋白的表达取肺组织100 ～200 mg，加入适量SDS 细胞裂解液、PMSF，于冰上充分匀浆; 4℃、12 000 r/min 离心20 min，取上清，BCA 法蛋白定量; 加上样缓冲液煮沸 5 min，保存于－70℃。每孔上样蛋白浓度为40 μg 进行SDS-PAGE，电泳后转移到NC 膜上。滴加50 g/L 脱脂牛奶50 mL 封闭1 h，使用山羊抗大鼠Zc3h12d 抗体及辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG 孵育目的蛋白，以观察Zc3h12d 蛋白两种剪接体的表达情况，用兔抗大鼠β-actin 抗体及山羊抗兔IgG 孵育内参照β-actin 蛋白。ECL 显色，凝胶成像系统观察并照相。1．2．8 统计学分析实验数据录入SPSS16．0 统计软件进行统计分析。各组数据以x ± s 表示，组间比较采用单因素方差分析( One-way ANOVA) 。检验水准α = 0．05，P ＜0．05 表示差异有统计学意义。 2 结果2．1 肺组织湿/干质量比值小肠上动脉缺血再灌注肺损伤( IIＲI) 模型组与对照组相比，IＲ30 min 组比值开始增大( F =6．56，P ＜0．05) ，表明肺微血管通透性开始增加，肺水肿形成，IＲ60 min 组比值大于对照组( F =3．19，P ＜0．05) ，I Ｒ120 min 组比值增幅较IＲ60 min 减小但仍大于对照组( F = 1．66，P ＜0．05) ，表明在IＲ60 min 组和IＲ120 min 组大鼠仍有肺水肿( 图1) 。2．2 血清和肺组织匀浆中TNF-α 和IL-1β 的变化ELISA 检测结果显示IＲ致伤后，IＲ30 min 组大鼠血清和肺匀浆中TNF-α 浓度较对照组升高( F =43．91，P ＜0．05; F = 41．44，P ＜0．05) ，同时肺匀浆中IL-1β浓度也较对照组升高( F = 9．80，P ＜0．05) 。IＲ60min 组较IＲ30 min 组血清和肺匀浆中TNFα 浓度升高( F =28．81，P ＜0．05; F =20．30，P ＜0．05) ，血清中IL-1β 浓度也升高( F = 8．89，P ＜0．05) 。IＲ120min 组较IＲ60 min 组血清和肺匀浆中TNF-α 浓度升高( F =28．95，P ＜0．05; F =10．23，P ＜0．05) ，同时血清中IL-β 浓度也升高( F =4．60，P ＜0．05，图2) 。2．3 肺组织病理学变化对照组肺小叶结构完整，肺泡间隔无增厚，无渗出，血管周围未见炎症细胞浸润。IＲ致ALI 模型组可见肺泡毛细血管破坏，肺泡壁明显增厚，肺泡腔内可见大量粉红色渗出液和红细胞，间质大量炎症细胞浸润，有明显的炎症改变( 图3) 。2．4 肺组织Zc3h12d 的表达肺组织Zc3h12d 主要在肺泡细胞和肺间质细胞中表达，分布于细胞质中，呈棕黄色，而细胞核中未见明显表达，IＲ30 min 和IＲ60 min 组与对照组相比染色无明显变化，IＲ120 min组染色与对照组相比明显变浅，呈淡黄色，为弱阳性( 图4) 。2．5 qＲT-PCＲ检测样本肺组织Zc3h12d mＲNA 的表达紫外分光光度计检测大鼠肺组织A260 / A280比值，均在1．8 ～2．0 之间，显示总ＲNA 完整性好，纯度较高。肺组织中的Zc3h12d mＲNA 荧光定量扩增曲线呈S 型，溶解曲线为单峰，无非特异性扩增及引物二聚体形成，结果可靠，故使用qＲT-PCＲ测定Zc3h12d 的mＲNA 相对含量，发现I