大鼠肺微血管内皮细胞培养及鉴定

大鼠肺微血管内皮细胞培养及鉴定*

谢　崧　杨晓静　钱桂生　王关嵩

(第三军医大学新桥医院,　重庆　630037)

摘要　取大鼠周边肺组织进行肺微血管内皮细胞培养。将肺组织切成小块,用含有20%新生牛血清、肝素90L g/ ml、L-谷胺酰胺4mmol、青霉素100U/ml和链霉素100L g/m l的R PM I-1640培养基培养。血细胞立即从肺组织周围游出。继而是肺微血管内皮细胞。成纤维细胞及其他细胞72h才游出。培养60h后取出肺组织块,培养瓶中只有微血管内皮细胞和血细胞。后者可通过传代除去。获得的肺微血管内皮细胞具有规律的鹅卵石样形态和对异植物血凝素结合试验及八因子相关抗原免疫荧光染色均阳性。

关键词　大鼠　肺循环　微循环　内皮细胞　细胞培养

　肺微血管在生理和病理情况下都起着重要作用,如与成人呼吸窘迫综合征、肺动脉高压[1]等的发生有关。目前仅限于肺动脉内皮细胞的研究,而肺微血管和大血管之间据文献报道在表型和功能有着显著的不同[2]。故有培养和研究肺微血管内皮细胞的必要。

虽然肺有大量的血管内皮细胞,但同时存在40多种类型的细胞尤其成纤维细胞和平滑肌等细胞的迅速生长,使内皮细胞生长受抑制。分离和培养纯的肺微血管内皮细胞较为困难。国内未见肺微血管内皮细胞培养的报道。本文采用简单的方法成功地分离和培养出大鼠肺微血管内皮细胞。

1　材料和方法

1.1　主要试剂　RPM I-1640培养基为美国Gibco 公司产品。新生牛血清由华西医科大学公共卫生学院生产。兔抗人八因子相关抗原抗血清为DAKO公司产品,华美分装。荧光标记异植物血凝素为Sigm a 公司产品。荧光标记羊抗兔1gG由卫生部上海生物制品研究所生产。抗菌素为青霉素钠盐和硫酸链霉素。L-谷氨酰胺为第二军医大学分装。胰蛋白酶和肝素钠均为上海生化试剂商店提供。大鼠肺动脉内皮细胞按本研究所建立的方法[3]培养。

1.2　取材　选重200-300g健康雄性Wistar大鼠,10%乌拉坦(10L l/mg)腹腔麻醉。颈动脉放血后,将整个大鼠泡于75%酒精中2-3s,以后用组织剪逐层剪开胸腔。切下心肺放入盛有含青霉素200U/m、链霉素200L g/ml和Hanks液的三角烧瓶内备用。

1.3　大鼠肺微血管内皮细胞培养

大鼠肺微血管内皮细胞原代培养:将盛有心肺组织的无菌三角烧瓶置于超净台,抗生素Hanks液冲洗心肺组织的血迹。眼科剪剪去肺组织表面的脏层胸膜,剪取胸膜下肺组织(厚度不应大于1.5mm)。并将肺组织用锋利的手术刀切成1.5×1×1mm3大小的组织块。贴入无菌的25cm2培养瓶(1%明胶预置过夜,4℃,用前2h移入CO2培养箱,培养液冲洗)中进行培养。每瓶贴10块,置培养箱固化2h后,加入含20%新生牛血清、肝素90U/m l、L-谷氨酰胺4mm ol、青霉素100U/ml和链霉素100L g/ml的RPM I-1640培养基3m l,放入培养箱中培养。60h后将肺组织块取出。继续培养7-10d,细胞汇合成单层细胞。肺组织贴瓶后3d换液,以后每两天换液一次,每次均换1/2。

大鼠肺微血管内皮细胞传代培养:　将长成单层的原代细胞用0.08%胰蛋白酶进行消化,每瓶加入1ml,置常温5m in左右。镜下观察,当细胞间连接疏松时立即倒出消化液,加入培养基3ml,用吸管吹打使细胞脱落并充分混匀,吸出0.1m l计数,得出细胞总数后,将含细胞的培养液稀释成(2.5-3.0)×105个细胞/ml的接种浓度。每25cm2培养瓶接种3ml细胞悬液,与肺微血管内皮细胞相混的血细胞就通过传代除去了。

1.4　肺微血管内皮细胞的鉴定

制片:　如同细胞传代将细胞消化成细胞悬液。再以800rpm离心5min除去含血清的培养液。向沉降的细胞中加少许Hanks液,用吸管轻轻吹打漂洗后,取少许细胞悬液薄涂于玻片上。用吸水纸吸干后甲醇固定5-10min取出备用。

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中国应用生理学杂志1997;13(2)

X1996-9-20收稿　1997-2-6修回

八因子相关抗原间接免疫荧光染色:　用PBS 液冲洗3×3m in。样品片加1:50兔抗人八因子相关抗血清50L l37℃下密封孵育30min,然后PBS液冲洗3×3min,吸水纸吸干,缓冲甘油封片。加1:25荧光标记的羊抗兔1g G50L l,并孵育、PBS液冲洗、水吸干及封片后荧光显微镜观察。对照片第一抗体用PBS液代替,其它步骤同样品片。

异植物血凝素结合试验:　用PBS液冲洗,水汲干后加入25L g/ml荧光标记的异植物血凝素, 50L l在室温密封孵育30min,PBS液冲洗3×3m in,水吸干和封片后荧光显微镜检查。样品片为肺微血管内皮细胞,对照片为肺动脉内皮细胞。两者染色过程一样。

2　结果

2.1　生长情况　肺组织块贴于培养瓶壁后,血细胞立即从肺组织块边缘向四周游出。24h肺微血管内皮细胞游出。60h将肺组织贴块取出后培养瓶中只有肺微血管内皮细胞和血细胞。7-10d后这两种细胞一起形成细胞单层。此时进行传代,血细胞被除去,培养瓶中只有肺微血管内皮细胞。

2.2　细胞形态　细胞呈鹅卵石镶嵌状排列,状如梭形或多角形,大小均匀。胞核清晰,呈卵圆形。胞浆丰富。

2.3　鉴定情况　八因子相关抗原间接免疫荧光染色样品片阳性,呈明亮的黄绿色荧光,对照片阴性。异植物血凝素结合试验示肺微血管内皮细胞呈明亮的黄绿色荧光,而肺动脉内皮细胞阴性。

3　讨论

M agee[2]曾报道的肺微血管内皮细胞的培养方法采用了含肝素等的选择培养基,使内皮细胞纯度较高。但分离肺微血管内皮细胞使用昂贵的胶原酶,同时组织剪碎,过滤等程序较为复杂。而Chen[4]提出一种简单的贴块分离培养肺微血管内皮细胞方法,但由于未使用抗生素,细菌污染的可能性大,培养成功率较低;另外培养中未加用对细胞生长起选择作用的试剂,使内皮细胞混有较多其他细胞。本文吸取两者优点:进行简单的贴块法分离肺微血管内皮细胞,从而避免使用胶原酶和对细胞有毒性的胰蛋白酶;采用肝素进行选择性培养,使细胞纯度较高;使用抗菌素,减少细菌的污染,提高成功率。此方法具有简单经济、重复性好、分离培养出的内皮细胞纯度较高的特点。鉴定采用最常用的八因子相关抗原间接免疫荧光染色和对肺微血管内皮细胞最具特异性的异植物血凝素结合试验[2],两者均阳性。证实分离培养的确为肺微血管内皮细胞。

4　参考文献

1.宋　为,蔡英年,邓希贤,等.慢性缺氧时肺腺泡内动脉肌

化与内皮结构变化的关系.　中国应用生理学杂志　1993;9(4):292-296

2.M agee J C,et al.Isolatio n,cultur e and char act erization

o f r at lung micr ov ascular endo thelial cell.　A m J p h y siol 1994;267:L433-L441

3.谢　崧,钱桂生,杨晓静.大鼠肺动脉内皮细胞的简易培

养和鉴定　第三军医大学学报　1997;已修回

4.Chen S F,et al.A new simple metho d fo r isolation of

micr ov ascular endothelial cells av oiding both chemical and mechanical injuries.　M icr ovascular Resear ch　1995;50:119-128

CULTURE AND CHARACTERIZATION OF RAT LUNG

MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS

Xie Song,Yang Xiaojing,Qian Guisheng,Wang Guansong

(Xin qiao Hos pital,T hird M ilitary M edical University,C hongqing　630037)

ABSTRAC T

Cultures of r at lung m icrovascular endothelial cells(RLM ECs)w ere obtained from perepheral lung tissue.The lung tissue w as cut into sm all pieces and cultured with RPMI-1640containing20%bo vine calf serum,90L g/m l heparin,4mmo l/L L-g lutam ine,100L/m l penicillin and100L g/ml streptomy cin.Erythro-cy tes and leuko cytes left the tissue first,follow ed by RLM ECs.Fibroblasts and other cells g rew after72 hour s of culture.After60hour s of cultur e,the lung tissue w as discarded.RLMECs in flask show ed regu-lar co bblestone m orpholog y and po sitive for binding of the lectin Bandeiraea simplicifo liaⅠand indirect immunofluor esence staining with factorⅧantiserum.

KEY WORDS rat;　pulmo nar y circulat ion;　micro cir culatio n;　endo thelial cell;　cell cultur e 190Ch in J Ap pl Ph ysiol1997;13(2)