大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

相类似。

本研究提示SARS 病毒并非来源于人工驯养的野生动物,而是来源于野生动物,其中蛇、鹰、蛤蚧、鳖最为可能。

广西原发病例接触病死猫后发病,因而老鼠仍很可能是SARS 病毒的最原始宿主,但其极低携带率和极低病毒量不但难于直接传给人类,而且也难检测到阳性老鼠。

SARS 抗体阳性的鹰,蛇、龟、蛤蚧均为食肉动物,而且高空飞翔的鹰和冬眠的蛇均有利于病毒繁殖和携带的低氧分压状态。

这些野生动物通过对鼠等动物的猎食而感染、富集。

然后在其体内繁殖和携带。

当被人类猎捕后,在冬末早春气温较暖湿度大的南方,长途运输严重缺氧使病毒发生变异,形成毒力和侵袭力强的SARS 病毒,在贩运人员和厨师近距离接触和捕杀过程中受伤感染而发病,然后通过家人护理或就医的医院医护人员诊疗中密切接触造成人间传播和暴发流行。

2003年我国成功扑灭SARS 的疫情,其中严格禁止捕猎贩运和宰杀野生动物是最主要的措施之一,与本研究结果相吻合。

因此,应禁止捕猎贩运和宰杀野生动物、每年冬春季节加强对发热肺炎病人监测,尤其是捕猎贩运和宰杀野生动物史或实验室病源研究史的发热肺炎病人监测排查、同时大搞爱国卫生运动、降低甚至消除鼠类等传播疾病的病原媒介是防范SARS 的发生和控制扑灭SARS 疫情的首要措施。

至于疑为SARS 病毒最原始宿主鼠类和蝙蝠及其通过食物链进入二级宿主野生动物的过程和机理仍有待以进一步的研究。

(参加本文工作的还有杨庆利、钟革、蓝光华、冯向阳、熊绮梦、陈岳波、韦东禄、刘志高、石友盟、李建民、蒙世安,在此一并致谢)
参　考　文　献
1　王汉章,王茂武,王建伟,等主编1传染性非典型肺炎防
治培训教材(修订版).北京:中国协和医科大学出版社,
2003.3210.
2　廖祯华主编.广西壮族自治区地图集.北京.星球地图出
版社.2003.42247.
广西医科大学学报　2006Feb ;23(1)
3广西区卫生厅资助课题(Z2002098)收稿日期:2005202201
大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定3
滕晓茗　周微雅　黄　燕　周祥祯
(广西壮族自治区人民医院　南宁　530021)
摘要　目的:探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础。

方法:用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养;用光镜、电镜及免疫组化检测进行鉴定。

结果:分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养一周左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈“铺路石样”排列,透射电镜可见Weibel 2Palade 小体。

第Ⅷ因子相关抗原免疫组化测定阳性。

结论:该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞。

关键词　脑微血管;内皮细胞;体外培养
中国图书资料分类法分类号　R331;R322113
THE METH ODS OF CU LTURING AN D IDENTIFYING CEREBRAL MICR OVASCU LAR EN 2DOTHE L IAL CE LL IN RATS
Teng Xiaoming ,Zhou Weiya ,Huang Yan ,et al.(The People ’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region ,Nanning 530021China )Abstract Objective :To explore t he met hods of cult uring rat cerebral microvascular endot helial cells (RC 2M ECs ),so as to build up t he basis for t he st udies of vascular endot helial cells.Methods :After t he RCM EC were digested wit h collagenase Πto make suspension which are cultivated ,t he RCM EC were identified by immunohistochemical met hods and observed wit h light micro scope and elect ron microscope.R esult :Isolated RCM ECs grow to mo nolayer after one week of external cultivation.They present polygonal and arrange like pavement stones under light micro scope.Weibel 2Palade (W 2P )body can be seen under transmission e 2lect ron micro scope.Correlation antigens of Ⅷfactor are positive by fluorescent stain.Conclusion :The met hods for t he cultivation and identification of RCM ECs could cultivate cerebral microvascular endot helial
cells.
K ey w ords cerebral microvascular ;endot helial cell ;cultivation in external
・
05・广西医科大学学报　2006Feb ;23(1)
以往体外培养的血管内皮细胞主要来自动物胸、腹大动脉和人脐静脉,随着血管内皮细胞研究的发展,微血管内皮细胞的培养技术越来越受到人们的重视。

本文探讨一种酶溶液消化大鼠脑皮质的脑微血管内皮细胞培养方法。

1　材料与方法
111　材料:RPMI 21640培养基、L 2谷氨酰胺、优质胎牛血清
购自美国G ibco 公司;胶原酶Ⅱ型、促内皮细胞生长因子
(ECGF )、D 2Hanks 液购自美国sigma 公司;第Ⅷ因子相关抗
原抗体(福州新生物技术开发公司);右旋糖酐(武汉生命技术有限公司);青霉素、链霉素、肝素(华北制药)。

112　仪器:CO 2孵箱(德国Heraeus 公司);超净工作台(苏
净集团安泰公司);相差显微镜(日本OL YMPS )
113　动物:清洁级Wistar 大鼠2只、雄性,购自广西医科大
学实验动物中心。

114　方法
11411　培养液的配制:取一袋RPMI 21640粉剂溶于950ml
三蒸水中,加210gNa HCO 3、016g L 2谷氨酰胺后充分搅拌使完全溶解,用三蒸水定容至1000ml ,用1mol/L NaO H 调
p H 至618～710,滤过除菌(p H710～712)、分装后于4℃保
存备用。

使用时加入20%胎牛血清、ECGF 、肝素25U/ml 、
青霉素100IU/ml 、链霉素100mg/L 及L 2谷氨酰胺2mmol/
L 。

11412　原代内皮细胞的分离及培养:①将大鼠处死,去头
皮。

取出头颅并浸入75%的乙醇中消毒约1min ,在无菌状态下迅速取出大鼠大脑。

需小心剔除大血管和软脑膜;②将脑皮质剪下放入D 2Hanks 液中,漂洗数次后,将其剪碎。

再移入含0105%胰蛋白酶的小瓶内,在37℃水浴中消化10～
20min ;③用有血清培养液中止消化。

置于玻璃研磨器内研
磨,制成粗悬液。

经孔径为110μm 的尼龙筛网过滤,将滤液以4000r/min 离心10min ;④弃离心后的上清液。

给沉淀加入15%右旋糖酐溶液,重新悬浮沉淀后以4000r/min 离心20min 。

收集微血管片段;⑤用011%胶原酶消化10～20
min 后加血清终止酶活性,用Hanks 液洗涤并离心去上清液
后,给微血管片段加入RPMI 21640培养液;⑥接种到培养瓶中,置37℃、5%CO 2培养箱中(湿度100%)培养;⑦24h 后换液,将未贴壁的微血管段移入其它培养瓶继续贴壁生长。

之后每3d 换液一次,待内皮细胞生长密度达90%时,即可传代。

11413　传代内皮细胞的培养:0125%胰蛋白酶消化液均匀
分布于细胞表面,在相差显微镜下观察见细胞变圆,间隙增大,则用含血清培养液中止消化、轻轻吹打,2000r/min 离心,1传2或3,余培养过程同原代培养。

11414　内皮细胞的观察及鉴定:①相差显微镜下形态学观
察;②电镜下超微结构观察;③细胞生长曲线观察:将细胞
5×104/ml ,分别接种于7只50ml 培养瓶中常规培养,以后
每天取一瓶细胞用0125%胰蛋白酶消化收集细胞,用白细胞计数法[1]计算每瓶细胞每毫升活细胞数,一共观察7d ,并划
出生长曲线;④第Ⅷ因子相关抗原的免疫组化检测。

将细胞接种于盖玻片上,用丙酮固定20min ,PBS 冲洗5min ×3次,
011%TritonX 2100内浸20min 之后PBS 冲洗5min ×3次,3%H 2O 22甲醇室温下10min 阻断内源性过氧化物酶,滴加10%非免疫动物血清封闭10min ,加一抗F Ⅷ37℃湿盒孵育1h ,常规冲洗后加生物素标记二抗孵育10min ,加链霉菌抗
生物素一过氧化物酶溶液孵育10min ,DAB 显色,苏木素复染、酒精脱水干燥,中性树胶封固,同时设立非血管内皮细胞为阴性对照组。

2　结　果
211　细胞形态学观察:原代细胞24h 后,大部分细胞贴壁。

传代细胞015～2h 贴壁80%～90%,6～8d 长满瓶壁,呈“鹅卵石样”或“铺路石样”排列生长。

细胞呈多角形或扁平梭形,核卵圆形、可见核仁,见图1。

212　透射电镜下可见Weibel 2Palade (W 2P )小体(见图2)。

213　细胞生长曲线:3d 后细胞生长旺盛(见图3)。

214　第Ⅷ因子相关抗原阳性,胞浆中含棕黄色反应物质(见
图4)。

图1　细胞多角形或扁平梭形,呈“铺路石样”排列,
胞核卵圆形,可见核仁(×100)
图2　W 2P 小体(×15000)
・
15・滕晓茗,等1大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定
图3　
内皮细胞生长曲线
图4　S 2P 免疫组化染色法示胞浆中含棕黄色的
阳性反应(×400)
3　讨　论
血管内皮细胞是衬附于血管内壁的一层细胞,它不仅是构成血管细胞间屏障重要成分,而且在调节血管舒缩状态、释放血管活性物质、调节机体内环境的稳定,维护正常生理功能等方面发挥重要作用。

因此,血管内皮细胞的研究具有重要意义,来源于大鼠脑微血管内皮细胞因脑皮质薄、血管细小、收集到的血管内皮细胞极其有限而使培养难以成功,选择酶的适宜消化浓度和控制好消化时间是培养成功的关键
[2]
,脑微血管内皮细胞分离是将剪碎的脑皮质浸泡在消化
酶中,酶的消化一般呈由外向里,最后被消化下来的细胞才
是内皮细胞。

因此,彻底地消化组织是获得足够微血管内皮细胞的前提,但消化时间过长或酶浓度过高,会带来较多非血管内皮细胞的污染,应反复摸索实验条件。

我们在参考有关文献[3]基础上采用浓度011%胶原酶Ⅱ型37℃消化分离内皮细胞10～20min 。

在脑组织剪碎后,可先用低浓度的胰蛋白酶(0105%)消化,使微血管与神经组织更易分离。

然后,再用胶原酶消化获得微血管段,以去除周边细胞和基底膜,这样既减少胶原酶的用量,降低成本,又不影响微血管内皮细胞的数量。

悬液中混有血细胞及神经组织细胞碎片,因其不易贴壁而在换液时被洗掉,故可不作特别处理。

微血管内皮细胞鉴定:①根据器官和组织的来源;②在倒置显微镜下细胞呈多角形或扁平梭形,“铺路石样”排列,无重叠;③第Ⅷ因子相关抗原的免疫组化测定阳性,该检测是鉴定内皮细胞的最有效方法;④透射电镜下在胞浆中可见
W 2P 小体,但由于W 2P 小体在不同种属、部位、培养条件下
培养的血管内皮细胞中形态、结构均有所差异,且出现概率低,故目前认为前三点是鉴定血管内皮细胞的主要依据,W 2P 小体不作为鉴定内皮细胞必要指征。

我们体会:①采用优质胎牛血清,原代用20%,传代可用
10%;②微血管细小,收集到的内皮细胞有限,故原代应高密
度种植,利于细胞间相互影响,通过产生促生长活性物质,互相促进生长;③L 2谷氨酰胺是内皮细胞生长必需成分,其本
身易分解,应用时追加确保培养液终浓度2～4mmol/L ;④选择合适消化液浓度和控制好消化时间。

使之能充分消化组织,又减少细胞损伤和非血管内皮细胞污染,此分离细胞培养法可有效培养微血管内皮细胞。

参　考　文　献
1　张卓然主编1实用细胞培养技术.北京:人民卫生出版
社,1999.30.
2　薛庆善主编.体外培养的原理与技术.北京:科学出版社,
2001.428.
3　刘新晖,张锡庆,王晓东,等.兔肾微血管内皮细胞的体外
培养及鉴定方法.苏州大学学报(医学报),2003,23(6):
6582661.
医学中法定计量单位对长度单位的要求
医学中在微小的长度计量中以往常用的A o
、μ(指μ作为单位单独使用,代表微米)不属于法定单位,不宜再用,宜采用法定单位中长度基本单位m 的分数单位,如nm 、pm 等。

以往将词头重叠的用法,如m
μm 、μμm 等,不符合法定计量单位使用方法的规则,不宜再用,宜采用只有一个词头与单位构成的分数单位,如nm 、pm 等。

以往用X 线波长的X 单位(舍巴恩单位)不是法定单位,不宜再用,宜采用m 的分数单位。

・25・广西医科大学学报　2006Feb ;23(1)。