分子实验实验报告

注意事项：加样器要避免污染，取完一次后及时换管；离心机要注意保持平衡；
菌体要充分悬浮；上清液转移时用枪吸，有少量损失没有关系。 2.酶切 在 0.5ml 离心管中按照表 1 配置限制性核酸内切酶 EcoR I 对质粒 puc19 的消化 系统，并设置不加酶的对照实验，反应总体积为 10ul。
表 1 限制性核酸内切酶对质粒 puc19 的消化系统
分子实验实验报告
【实验原理】
质粒 DNA 以多拷贝形式存在，能在细胞内独立复制，不依赖于细胞分裂和 染色体的控制，被广泛利用作为携带外源 DNA 的载体。质粒 DNA 提取后可以 纯化以便进行分子克隆、蛋白质表达产物的提取，或者用于克隆的鉴定等。其中 涉及到的分子生物学的基本操作技术包括质粒的提取、转化、酶切和电泳。本次 实验就是学习该四项基本操作技术，大部分的分子生物学研究是围绕着核酸分子 展开的，掌握这几项技术对我们以后从事生物学特别是分子生物学研究的人是必 需的。
滴头，避免污染；限制性核算内切酶作用的效果如何必须用之后的电泳实验来进
行检测。
3.转化 ⑴配置 LB 固体培养基 i．称取 Tryptone1.2g、NaCl1.2g、Yeast Extract0.6g 和 Agar1.8g，量取 120ml 去 离子水，混合置于 250ml 蓝盖瓶中； ii．将蓝盖瓶 121℃高温灭菌 15 分钟； iii．取出混匀后倒出 20ml，制成 LB 一块； iv．冷却到 60℃左右时，像剩余的培养基中加入 100uL Ap 储液混匀，制成 5 块 LBAp 平板，六块平板全DH5α菌液，4000rpm 离心 2min； ii．弃上清，加入 600uL0.1MCaCl2,悬浮细胞，冰置 15~30min； iii．4000rpm 离心 2min； iv．弃上清，加入 300uL0.1MCaCl2,悬浮细胞，冰置。 ⑶转化
【实验结论】
1．从结果 1 可知 puc19 质粒提取成功，转化进 DH5α成功； 2．从结果 2（1）可知 5 号 puc19（无酶切）有三条带从靠近到远离加样孔分别
为 OCDNA、lDNA、CCCDNA，5 号与 6 号亮度相等是 DNA 的量相等，puc19 的分子量为 2686bp，marker 七条带从靠近到远离加样孔的分子量分别为 5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、800bp、500bp 和 300bp，故 6 号条带位 于 marker 第二第三条带之间是与理论相符的； 3．从结果 2（2）推测 5 号第二条带最亮可能是闭合环状 DNA 培养时间较长自 己发生断裂，条带的差异可能是因为 DNA 与染料比例不同，,6 号条带不平 整可能是因为靠近边缘使跑胶速度不是很均衡。
【实验结果】
1. 如图 1，a 平板（LB--100ul②）布满细菌，b 平板（LBAP--100ul②）没有菌 落，c 平板（LBAP--100ul①）有密集的菌落，d 平板（LBAP--20ul①+80ulLB）
有菌落，但没有 c 平板的密集。
2. （1）如图 2 所示，4 号 marker 有 7 条带，5 号 puc19（无酶切）有三条带， 其中第二条最亮，6 号 puc19（经过酶切）有一条带，亮度基本等于 5 号三条 带亮度总和，且跑出的距离位于 4 号第二第三条带之间； （2）5 号与 1 号相比条带位置相近，但 5 号第二条带最亮，1 号第三条带最 亮；6 号与 3 号相比条带位置与亮度都相近，但 6 号相对较不平整。
⑵样品处理 i.如表 2 将酶切产物或者分子量标准与荧光染料混匀后放置 5min； ii.按照表 2 加样，加样时，加样器头悬于加样孔上部，然后缓缓地将样品推进孔 内，让其集中沉于孔底部，每种样品换一个滴头。
表 2 加样孔加样
组分 酶切产物（加 酶）/ul 酶切产物（无 酶）/ul 分子量标准 /ul 荧光染料/ul
酶切：酶切使用的是限制性核酸内切酶,这是分子克隆成功的一个关键技术， 本实验中进行酶切是为电泳做准备，酶切后质粒开环，电泳的 marker 构型相似， 故可比较分子量的大小。
电泳：DNA 分子在碱性环境中带负电荷，再外加电场作用下向正极移动。 不同的 DNA 片段由于其电荷、分子质量及构型的不同，在电泳时的泳动速率就 不同，从而可以分出不同的区带，与已知分子量的 marker 进行比较可以估计研 究 DNA 片段的分子量进而估计是哪种 DNA 片段。本实验进行电泳的是提取的 质粒，包括酶切了的和没有酶切的，还有 marker 进行对照，本实验是已知质粒 DNA 的分子量，可与 marker 比较进行检验。
加样孔 1 0
10
0
2
加样孔 2 0
0
0
0
加样孔 3 10
0
0
2
加样孔 4 0
0
6
2
加样孔 5 0
10
0
2
加样孔 6 10
0
0
2
⑶电泳 加样后马上接通电源，开始电泳，恒压 120V，电泳 30min。 ⑷观察和拍照 小心地取出凝胶槽，避免凝胶滑落，在相应波长的紫外灯下进行观察，拍照，记 录实验结果。 注意事项：小三角瓶中加入琼脂糖和 TAE 稀释缓冲液后不要摇晃，避免贴壁， 使琼脂糖更好的溶解；加样时不要戳破琼脂糖凝胶，因荧光染料中含有甘油增加 密度对准加样孔加样就基本会进孔，不会污染其他样品。
的效果；实验要在无菌的环境下进行，用完后记得关酒精灯；涂板时要涂抹均匀，
注意无菌操作；涂完平板后一定要等水汽干掉之后再倒置；感受态细菌越新鲜， 转化效率越高，本实验自己制备 DH5α感受态有利于提高转化效率。 4.电泳 ⑴1％琼脂糖凝胶板的制备 i.称取 0.2g 琼脂糖置小三角瓶中，加入 20ml1×TAE 稀释缓冲液，微波炉加热至 琼脂糖完全融化，取出三角瓶轻轻摇晃； ii.待琼脂糖胶液冷至 60℃左右，小心地将胶液倒入制胶器中，放置约 20min 凝 固； iii.凝固后双手均匀用力地轻轻拔出梳子，将凝胶连同槽放入电泳槽平台，加样 孔靠近负极； iv.在烧杯中加入 10ml 50×TAE 和 490ml 去离子水制成 1×TAE 稀释缓冲液， 将其倒入电泳槽刚好没过胶和加样孔；
提取质粒：质粒 DNA 是细胞内独立存在的分子，为双链环状 DNA，无蛋白 质，主要存在于原核细胞和植物细胞。本次实验是小量提取质粒，快捷简便。
转化：即细胞通过摄取外源遗传物质(DNA 或 RNA)而发生遗传学改变的过程。 转化方法通常有两种，一种是用物理的方法，另一种是用低温和氯化钙低渗溶液 的理化处理方法。本实验中用的是后一种，转化后涂在含有抗生素的平板上，观 察培养结果可以判定转化是否成功，转化成功的关键是感受态细胞的制备，用于 转化的 DNA 的用量也是决定转化成功和转化效率高低的一个重要因素。
【实验步骤】
1.提取质粒 从 3ml 菌液提取质粒 puc19 ⑴取菌液 1.5ml，10000rpm 离心 1min，去上清，重复取菌液一次，10000rpm 离 心 1min，尽量去尽上清； ⑵加入 RB250ul，充分悬浮菌体； ⑶加入 LB250ul，温和的上下翻转 4~6 次，使菌体充分裂解，形成蓝色透明的溶 液； ⑷加入 NB350ul，轻轻混合 5~6 次，室温静置 2min； ⑸12000rpm 离心 5min,小心吸取上清加入离心柱中，12000rpm 离心 1 分钟，弃 流出液； ⑹加入 NB650ul，12000rpm 离心 1min，弃流出液； ⑺12000rpm 离心 1min，彻底去除残留的 NB； ⑻将离心柱置于一个干净的离心管中，在柱的中央加入 30~50ul 去离子水，室温 静置 1 min ⑼10000rpm 离心 1min,洗脱 DNA，洗脱出的 DNA 于-20℃保存。
i．将配备的培养基分别标号为 a、b、c、d、e、f，其中 a 不含抗生素，其他都 含有抗生素； ii．a 平板 b 平板分别加入 100ul②号管中菌液，c 平板加入 100ul①号管中菌液， d 平板加入 20ul①号管中菌液和 80ul LB，e 平板和 f 平板由合作者使用，涂抹均
匀； iii．将培养基在室温条件下放置一段时间越 20min 后，移入 37℃培养箱倒置培 养 16 小时后于 4℃保存。 注意事项：配制培养基时称取混合后不要摇晃；蓝盖瓶不要拧紧，保证高温灭菌
组分 puc19 10 倍 Buffer H EcoR I 高压灭菌双蒸水 总体积
体积（ul）(1) 8 1 1 0 10
体积（ul）(2) 8 1 0 1 10
待所有成分加完后，混匀，放入 37℃水浴箱中保温 1h，然后放于-20℃冻存，待 电泳检测酶切的结果。 注意事项：提取的 puc 质粒一部分进行酶切后，另一部分统一存放于-20℃用于 转化；操作时，所有待加组分的管子都插在冰上；加样时，每一组分使用一新的
i．①号管将 100ul 感受态细菌与 5ul 提取的 puc19 质粒混合，冰浴 30min，②号 管放置 100ul 感受态细菌不含 puc19 质粒，冰浴 30min，作为阴性对照； ii．42℃处理 1.5min，立即放入冰水浴，冷却 3~5min； iii．①②号管分别加入 LB100ul，混匀； iv．在 37℃环境下摇床 15min。 ⑷涂板