植物组织培养实验报告

植物组织培养实验报告
摘要：以大豆子叶为外植体，在MS培养基上附加不同浓度、不同种类的植物激素，以研究不同激素组合和不同浓度对大豆子叶愈伤诱导率的影响，并练习无菌操作。

实验结果显示第2组即MS+6-BA（2.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)和第3 组即MS+KT（0.5mg/L)+2,4-D(1.0mg/L) 培养基中愈伤组织诱导率较高，为较佳的愈伤组织诱导组合。

关键词：大豆；植物组织培养；无菌操作；愈伤组织
1.材料与方法
1.1实验材料：大豆子叶
1.2实验试剂与仪器
（1）试剂：75%酒精、MS干粉、蔗糖、琼脂、植物生长调节剂（NAA、2，4-D、KT、6-BA）、无菌水、升汞、NaOH溶液
（2）仪器：超菌净工作台、圆纸片、培养皿、封口膜、称量纸、千分之一天平、不锈钢杯子、移液枪、试管、高压灭菌锅、注射器、酒精灯、镊子、手术刀、搁置架、烧杯、电炉。

1.3实验方法
1.3.1培养基的配制与灭菌
1.3.1.1 配制培养基的准备阶段
（1）准备80个培养试管及封口膜，2个小培养皿、1个大培养皿，用洗衣粉、自来水洗净，再用蒸馏水把每个培养试管、润洗一下。

带晾干后将试管编号1-80；（2）在称量纸上用百分之一天平分别称取1.5g 琼脂4份，7.5g 蔗糖4份，在烧杯里用千分之一天平上称取1.185g MS干粉4份（烧杯不要清洗）；
（3）剪小圆纸片40张，均分在两个小培养皿中大小能从中自由取出为宜；剪大圆纸片10张，均分在两个大培养皿中。

然后分别用报纸包好。

（4）把接种工具手术刀、镊子、剪刀等用报纸包好。

1.3.1.2 配制培养基
（1）在装有MS干粉的烧杯中按下表加入植物生长调节剂
实验所用的所有激素浓度均为0.5mg/mL
编号培养基配置激素的加样量(ml)
6-BA NAA KT 2,4-D
1 MS+6-BA
（1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L)
0.5 0.25
2 MS+6-BA
（2.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)
1.0 0.5
3 MS+KT（0.5mg/L)+2,4-D(1.0mg/L) 0.25 0.5
4 MS+KT（1.0mg/L)+2,4-D(2.0mg/L) 0.
5 1.0
（2）用量筒量取250ml（稍多）蒸馏水，取一个不锈钢杯子加入150ml蒸馏水
和称量好的琼脂，在电炉子加热沸腾2min，再加入混合好的MS培养基1号和蔗糖，混合沸腾2min，用剩余的蒸馏水定容至250ml；
（3）当温度降到60℃左右时，将溶液pH 调至5.8，一般加4滴NaOH溶液即可；
（4）取编号1-20的培养试管，用大量注射器以每瓶12.5ml 左右培养基分装在培养试管中，用封口膜封口，4支一捆捆扎好。

（5）用相同的方法配置2-4号培养基，并分装、捆扎。

1.3.1.3高压湿热灭菌
（1）将包好的接种工具，包好的培养皿，以及分装好的试管一起放到高温灭菌锅中用二次排气法在121℃灭菌20min。

（2）高压灭菌锅操作
先关闭高压灭菌锅放气阀, 待锅内压强升到0.05MPa时, 打开放气阀排出空气, 当压力表指针为0MPa时关闭放气阀。

继续加热, 当压力表再次升到0.05MPa 时, 再一次排除灭菌锅内的空气, 使压力表指针再次降为0MPa，关闭放气阀。

继续加热,让锅内的压力上升到一个大气压（0.103MPa），此时锅内温度为121.6℃时，控制热源，维持压力。

20min后，灭菌结束，待高压锅内压力表指针恢复到零后，开启压力锅。

1.3.2接种
1.3.
2.1实验前准备工作
（1）取50粒左右大豆子叶，分成单瓣，在洗衣粉水中仔细清洗，再用流水冲洗，备用；
（2）接种前，用甲醛+高锰酸钾熏蒸接种室和培养室（或用臭氧发生器处理），将培养基及接种工具放入超净工作台台面，打开鼓风机，打开紫外灯；
（3）洗净双手，用75%酒精擦拭双手，并用75%的酒精擦拭超净工作台台面和有关工具，同时喷洒接种室。

1.3.
2.2外植体的灭菌
在超净工作台上进行后续工作。

将洗好的大豆子叶在75%的酒精中浸泡8s，把酒精倒出，迅速加入无菌水漂洗两次，再放入升汞中浸泡2min，并用镊子不断搅拌，倒掉氯化汞，用无菌水漂洗7次，漂洗时，后几次无菌水要在大豆子叶中稍许停留。

最后转移到大培养皿中备用。

大培养皿放入少许无菌水，浸湿大豆子叶。

1.3.
2.3外植体的切割
（1）在火焰旁打开包接种工具的报纸，将接种工具在95%酒精中浸泡，然后用酒精灯灼烧，手不能接触接种器械的前半部分，用火灼烧镊子或手术刀要冷却后方可用于外植体的接种，防止烫伤材料，两把镊子可轮换使用；
（2）待接种工具冷却后，用手术刀对大豆子叶进行切割，切割时，一次取4粒大豆子叶放入小培养皿中，同方向切割完毕后选装方向，将四个方向都切下后，再在中间补一刀，不要切穿。

1.3.
2.4 外植体的接种
在火焰旁打开试管封口膜，使试管口在火焰上过一下，然后把切好的子叶放入培养基上，操作管呈倾斜状态，防止菌从口掉入，将管口再次在火焰上过一下，扎上封口膜。

待所有培养试管接种完后，4个一组捆扎，放置在培养架上。

1.3.3观察
（1）在25℃，黑暗下培养一周并观察。

（2）一周后，设置为25℃，光照，继续培养一周，并观察。

2.实验结果
（1）一周后，观察培养试管中大豆子叶生情况，发现部分试管培养基呈绿色，说明该部分试管被污染；有些试管的外植体并未生长，有可能是被烫伤，也可能是生长较缓慢；少部分试管有愈伤组织出现。

大概统计了一下培养试管总污染个数未12个，污染率15%。

（2）两周后，进行分组观察，结果统计如下表：
3.分析与讨论
3.1结果分析
从实验结果来看，第2组即MS+6-BA（2.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)和第3 组即MS+KT（0.5mg/L)+2,4-D(1.0mg/L) 培养基中愈伤组织诱导率较高，为较佳的愈伤组织诱导组合。

其余两组的诱导率较低。

得出结论，当细胞分裂素6-BA和生长素NAA组合时，6-BA浓度高于NAA浓度对于愈伤组织的诱导率较好；当细胞分裂素KT和生长素2,4-D组合时，KT浓度低于2,4-D浓度对于愈伤组织的诱导率较好。

3.2讨论
3.2.1结果重现性讨论
理论上第1组和第2组中细胞分裂素浓度高于生长素浓度有愈伤和生芽双重作用。

第3组和第4组细胞分裂素浓度低于生长素浓度有愈伤和生根双重作用。

第1组为前任推荐的对照的培养基，但由于死亡率较高，所以对照性较差。

因此
本次实验所得结论有建立重现性的必要。

3.2.2死亡率较高的原因
（1）在操作中，部分外植体被烫伤造成其不生长表面有烫伤后形成的黑色物质。

（2）用氯化汞溶液浸泡后，清洗过程中可能有少许大豆子叶未清洗干净，造成其不生长。

（2）对于那些培养2周后都还没有反应的外植体，我们将其列在了死亡组，出现这种现象的原因可能为：基本培养基不适应，生长素用量不足或温度不适宜。

3.2.3污染原因
在本次试验中由于操作人员太多每次交换时都可能引入污染物带超净工作台中，增大了污染率。

且由于是初次接触，很多操作做的可能不是很标准，这也将对实验污染率结果产生影响。

3.2.4常见问题和解决措施
（1）培养物水浸状、变色、坏死：
可能原因：表面杀菌剂过量，消毒时间过长，外植体选用不当（部位和时期）；改进措施：调换其他杀菌剂会降低浓度，缩短消毒时间，使用其他部位材料，生长初期取材。

（2）培养物长期培养几乎无反应：
可能原因：基本培养基不适宜，生长素不当或用量不足，温度不适宜；
改进措施：更换基本培养基或调整培养基成分，尤其是调整盐离子浓度，增加生长素用量，使用2,4-D，调整培养温度。

（3）愈伤组织过旺，疏松，后期水浸状：
可能原因：激素过量，温度偏高，无机盐含量不当；
改进措施：减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是铵盐）含量，适当提高琼脂用量增加培养基硬度。

（4）愈伤组织太紧密。

平滑或突起、粗厚，生长缓慢：
可能原因：细胞分裂素用量过量，糖浓度过高，生长素过量；
改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素的比例，降低糖浓度。

思考题
1、为什么要配制母液，各种母液的扩大倍数如何确定。

因为配制母液有三点好处：一是减少称量极微量药品的误差，保证各物质成分的准确性；二是可减少每次配制称量药品的麻烦，便于配制时的快速移取；三是配制成母液后体积缩小，便于低温保藏。

配制母液时，母液的浓缩倍数，一方面要根据配方中各种化合物的用量和在水中的溶解度来确定。

浓缩倍数不能太高，否则可能使化合物过饱和而析出，而且浓缩倍数太高时溶解也较慢。

另一方面为方便操作，以整数倍为宜，倍数与用量成反比，也就是说凡在配制母液时称量化学试剂量少的，配制的倍数应该大些。

用量大的配制的倍数应该小些。

然后按一般化学混合的要求，错开阳离子（如钙
离子）与阴离子（如硫酸根离子），方法是按次序单独配置，以免混合后产生沉淀。

2、高压蒸汽灭菌前为什么要讲锅内的冷空气排尽，灭菌完毕后为什么不能过早过急地排气，要待压力缓慢将至锅内压力很低时最好降至0MPa时，才能打开放气阀把蒸汽放尽，打开锅盖取物？
灭菌开始时要完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气。

因为空气的膨胀压力大于水蒸气的膨胀压力，所以当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。

此时压力达到0.1MPa了，但温度达不到121℃，使灭菌不彻底。

灭菌结束后，只有待高压锅内压力表指针恢复到零后，才能开启压力锅。

因为过早过急地排气，会使培养瓶内压力下降的速度比锅内慢，从而造成瓶内压力大于瓶外压力，使瓶内液体冲出容器外,另外压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢,培养瓶变形。

3、以表格的形式列出配置MS培养基母液200mL（大量元素×50、微量元素×150、铁元素×40、有机元素×80）时,各种母液成分中各化学试剂应称取的量。

如果要配置200ml 矮牵牛分化培养基(生芽和生根)所取母液和激素的量(激素的浓度均0.5mg/ml)。

矮牵牛生芽培养基为MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+ 琼脂7.5g/L,矮牵牛生根培养基为1/2MS+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L(生根培养基中1/2 代表MS 培养基中的大量元素减半，其余成分不变)。

200mL矮牵牛分化培养基母液及激素所取量其中蔗糖含量都为30g/L，琼
脂含量都为7.5 g/L。

4、植物组织技术主要包括哪些环节？各环节的主要工作内容是什么？
（1）培养基配制及灭菌：包括培养基的选择、母液配制、培养基配制、培养基灭菌。

（2）外植体的选择及灭菌：供体植物材料选择、外植体的选择和灭菌。

外植体灭菌过程包括流水冲洗，洗衣粉处理，酒精浸泡，升汞浸泡，无菌水清洗等工作。

（3）外植体的接种及培养：接种前接种室、工作人员所用工作服、口罩等都需要消毒、操作工具需要灭菌，以保证接种在无菌条件下进行。

在培养过程中包括初代培养、继代培养、生根培养，并合理控制培养条件。

（4）试管苗的驯化与移栽：驯化的目的在于提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高光合作用的能力，促使试管苗健壮，最终提高试管苗的成活率。

移栽生根苗是组织培养育苗的一个重要环节，只有保证移栽的成活，才能使快速育苗的目的达到。

5、植物组织培养技术中无菌操作应注意哪些事项？
在无菌操作过程中，最重要的是要保持工作区的无菌、清洁。

因此，需注意如下事项：
（1）在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，并认真洗手和消毒。

（2）在操作时，严禁喧哗，严禁用手直接拿无菌物品，而必须用消毒的钳子、镊子等。

（3）接种时在近火焰处进行处打开封口膜使试管略向下倾斜以免空气中微生物落入试管中。

整个接种过程都在火焰旁边进行且动作要迅速。

（4）防止操作带来的污染，接种过程中尽可能达到悬空要求。

（5）手不能接触接种器械的前半部分（即直接切割、触碰植物材料的部分）。

（6）在取出圆片纸时，一定不能用手去拿或用手去拿培养皿，而是用一只钳子按住，另一只钳子折叠取出。

（7）装圆片纸的培养皿和装外植体的培养皿的盖子取下后应倒放在超净台上，再盖上之前应在酒精灯的火焰上消毒。

（8）经火焰消毒后的钳子应按顺序摆放，避免混淆两只钳子，造成外植体烫伤。

（9）外植体应贴放在培养基的表面，而不要插入培养基内部，防止供氧不足。

（10）接种时手不能离开工作台，如果实在要离开，再次操作前要对双手进行再次消毒。