第4章 基因工程常用技术 - 核酸提取技术
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第四章 分子基本操作技术
第一节 核酸提取技术
DNA提取技术
1、DNA分子由两条链组成,这 两条链按反向平行的方式盘旋 成双螺旋结构.
2、DNA分子中的磷酸和脱氧核 糖交替连接.排列在外侧,构成基 本骨架,碱基排列在内侧.
3、DNA分子两条链上的碱基通 过氢键连接成碱基对.
植物DNA提取
CTAB法
核酸纯度检测
• 核酸的纯度用A260/A280比值表示。
OD260 / OD280 ＝1.8 ——为DNA纯品
（<1.7，蛋白质污染；>2.0RNA污染）
OD260 / OD280 ＝1.9~2.1 ——为RNA纯品
（<1.8，蛋白质污染；>2.2RNA已降解）
核酸完整性检测
• 核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶电 泳测定（RNA常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳）， 溴化乙锭染色，紫外灯观察。
RNA的提取技术
异硫氰酸胍/苯酚法 ➢ 步骤:
• 材料准备：尽量新鲜。 • 裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。
使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。
• 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。 • 洗涤：70％乙醇。 • 沉淀：异丙醇、无水乙醇。
当 m在 mNo氯alo／NC化l/laL溶L钠C时时液l 的溶浓，，物度液DD的质N浓NA增的A度的加的量而低溶溶浓逐解于渐度解度0降为度.1低随4最；2 大在，0浓.14度m为ol/0L．时，14DNmAo溶l／解L度时， DN最A小的；当溶N解aC度l溶最液浓低度。继利续增用加这 一时原，理DN，A的可溶以解使度又D逐N渐A增在大盐。溶 液中溶解或析出。
实验仪器
离心机
各种型号的微量移液枪
研钵
不同型号的 eppendorf管
实验步骤：
1．取 2g 清洗凉干的植物幼嫩叶片于研钵中，加 入液氮， 迅速研磨。将2×CTAB抽提液与2ml巯基乙醇在提取前 混合后于65℃水浴中加热30分钟。
2．将 0.5mL 研磨液转入 1.5mL 离心管中，加入1ml CTAB提取液，置于65℃水浴中保温 30min，其间颠倒 混匀2－3次。破碎细胞
CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜， 使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变 性，使DNA与蛋白质分离。在高离子强度的溶液中 (>0.7mol/L NaCl)，,CTAB和核酸形成的复合物能稳定存在， 而其它成分溶解度降低而沉淀。通过有机溶剂抽提，去除 蛋白，酚类等杂质，加入RNase去除RNA，加入乙醇沉淀 即可使DNA分离出来。
DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳（例图）
质粒DNA的提取
质粒（Plasmid）
• 独立于细菌染色替 外，能独立自主Βιβλιοθήκη Baidu 制的闭合环状DNA 分子；
• 存在于细菌，放线 菌，真菌以及一些 动植物细胞中，在 细菌细胞中最多．
基本步骤
➢分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：
• 培养细菌使质粒扩增；
1. 植物叶子, 剪碎置预冷研钵中
加入提取缓冲液， 研磨成浆
2. 吸入1.5mLeppendorf 管中，摇动混匀
3. 60℃水浴保温30-60min
4. 10000rpm离心5min
5. 吸上清于新的离心管中，加入等体积氯仿，颠倒混匀
6. 再次10000rpm离心5min； 将上清小心吸入新的离心管中；
① 根 据 DNA 在 NaCl 溶
液中的溶解度曲线图，
思考在什么浓度下， ② 如D何N通A过的控溶制解N度aC最l 溶小液？的 浓 度D使NDAN在A N在a盐Cl溶溶液液中中溶的解 或析出溶？解度是如何变化的？
DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图
材料和试剂
实验材料 植物叶片(去叶脉) 试剂 2×CTAB抽提液（CTAB、Tris-HCL、EDTA、 NaCl） TE 缓冲液(pH=8.0) ，氯仿：异戊醇(24:1) 巯基乙醇，异丙醇，70%乙醇
• 凝胶上DNA存在处可观察到清晰的条带。完整性良 好的总RNA应该清晰地看到28s rRNA、18s rRNA、 5s rRNA的三条带，其中28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍，5s rRNA 较弱。
基因组DNA抽提结果电泳图
总RNA抽提结果电泳图
• 收集和裂解细菌；
• 分离质粒DNA
质粒 扩增
分离质 粒DNA 三步曲
收集
裂解
细菌
分离
质粒
基本原理
1、碱裂解法 ➢基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异； ➢高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；
➢当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA 复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的 网状结构，通过离心形成沉淀去除；
乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。
核酸检测技术
核酸浓度的测定——紫外吸收法 DNA和RNA在波长260nm处有很高的吸收峰值， 用标准样品测得在波长260nm处，A260＝1时， 样品中双链DNA浓度为50 μg/ml，单链DNA或 RNA浓度为40 μg/ml。 DNA(μg/ml) = A260×50×稀释倍数 RNA（μg/ml ） = A260×40×稀释倍数
7. 加入1倍体积异丙醇，-20 ℃ 放 置 10min ， 出 现 絮 状 DNA 沉 淀；
随后8000rpm离心5min ， 弃 掉 上 清 ； 75 ％ 酒 精 洗 沉 淀 一 次 晾 干 沉 淀 ； 加 5μL RNaseA (10μg/μL), 37℃ 10min, 除 去 RNA；
加50-100μL的TE Buffer ， 取1-5μL电泳检测；其余-20 ℃ 贮存备用。
3. 加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒混 匀20分钟，防止成团。8000r/min，离心 5min，取上清。 抽提去蛋白
4．将上清液移入新的1.5mL离心管内，加 等体积异丙醇 （预冷）。颠倒混匀，可见 DNA 絮状沉淀。沉淀核酸
5．8000r/min，离心 1min，倒掉上清液，将离心管倒置 干燥。 将沉淀回溶于无菌水或 TE 缓冲液待测。
第一节 核酸提取技术
DNA提取技术
1、DNA分子由两条链组成,这 两条链按反向平行的方式盘旋 成双螺旋结构.
2、DNA分子中的磷酸和脱氧核 糖交替连接.排列在外侧,构成基 本骨架,碱基排列在内侧.
3、DNA分子两条链上的碱基通 过氢键连接成碱基对.
植物DNA提取
CTAB法
核酸纯度检测
• 核酸的纯度用A260/A280比值表示。
OD260 / OD280 ＝1.8 ——为DNA纯品
（<1.7，蛋白质污染；>2.0RNA污染）
OD260 / OD280 ＝1.9~2.1 ——为RNA纯品
（<1.8，蛋白质污染；>2.2RNA已降解）
核酸完整性检测
• 核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶电 泳测定（RNA常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳）， 溴化乙锭染色，紫外灯观察。
RNA的提取技术
异硫氰酸胍/苯酚法 ➢ 步骤:
• 材料准备：尽量新鲜。 • 裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。
使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。
• 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。 • 洗涤：70％乙醇。 • 沉淀：异丙醇、无水乙醇。
当 m在 mNo氯alo／NC化l/laL溶L钠C时时液l 的溶浓，，物度液DD的质N浓NA增的A度的加的量而低溶溶浓逐解于渐度解度0降为度.1低随4最；2 大在，0浓.14度m为ol/0L．时，14DNmAo溶l／解L度时， DN最A小的；当溶N解aC度l溶最液浓低度。继利续增用加这 一时原，理DN，A的可溶以解使度又D逐N渐A增在大盐。溶 液中溶解或析出。
实验仪器
离心机
各种型号的微量移液枪
研钵
不同型号的 eppendorf管
实验步骤：
1．取 2g 清洗凉干的植物幼嫩叶片于研钵中，加 入液氮， 迅速研磨。将2×CTAB抽提液与2ml巯基乙醇在提取前 混合后于65℃水浴中加热30分钟。
2．将 0.5mL 研磨液转入 1.5mL 离心管中，加入1ml CTAB提取液，置于65℃水浴中保温 30min，其间颠倒 混匀2－3次。破碎细胞
CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜， 使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变 性，使DNA与蛋白质分离。在高离子强度的溶液中 (>0.7mol/L NaCl)，,CTAB和核酸形成的复合物能稳定存在， 而其它成分溶解度降低而沉淀。通过有机溶剂抽提，去除 蛋白，酚类等杂质，加入RNase去除RNA，加入乙醇沉淀 即可使DNA分离出来。
DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳（例图）
质粒DNA的提取
质粒（Plasmid）
• 独立于细菌染色替 外，能独立自主Βιβλιοθήκη Baidu 制的闭合环状DNA 分子；
• 存在于细菌，放线 菌，真菌以及一些 动植物细胞中，在 细菌细胞中最多．
基本步骤
➢分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：
• 培养细菌使质粒扩增；
1. 植物叶子, 剪碎置预冷研钵中
加入提取缓冲液， 研磨成浆
2. 吸入1.5mLeppendorf 管中，摇动混匀
3. 60℃水浴保温30-60min
4. 10000rpm离心5min
5. 吸上清于新的离心管中，加入等体积氯仿，颠倒混匀
6. 再次10000rpm离心5min； 将上清小心吸入新的离心管中；
① 根 据 DNA 在 NaCl 溶
液中的溶解度曲线图，
思考在什么浓度下， ② 如D何N通A过的控溶制解N度aC最l 溶小液？的 浓 度D使NDAN在A N在a盐Cl溶溶液液中中溶的解 或析出溶？解度是如何变化的？
DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图
材料和试剂
实验材料 植物叶片(去叶脉) 试剂 2×CTAB抽提液（CTAB、Tris-HCL、EDTA、 NaCl） TE 缓冲液(pH=8.0) ，氯仿：异戊醇(24:1) 巯基乙醇，异丙醇，70%乙醇
• 凝胶上DNA存在处可观察到清晰的条带。完整性良 好的总RNA应该清晰地看到28s rRNA、18s rRNA、 5s rRNA的三条带，其中28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍，5s rRNA 较弱。
基因组DNA抽提结果电泳图
总RNA抽提结果电泳图
• 收集和裂解细菌；
• 分离质粒DNA
质粒 扩增
分离质 粒DNA 三步曲
收集
裂解
细菌
分离
质粒
基本原理
1、碱裂解法 ➢基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异； ➢高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；
➢当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA 复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的 网状结构，通过离心形成沉淀去除；
乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。
核酸检测技术
核酸浓度的测定——紫外吸收法 DNA和RNA在波长260nm处有很高的吸收峰值， 用标准样品测得在波长260nm处，A260＝1时， 样品中双链DNA浓度为50 μg/ml，单链DNA或 RNA浓度为40 μg/ml。 DNA(μg/ml) = A260×50×稀释倍数 RNA（μg/ml ） = A260×40×稀释倍数
7. 加入1倍体积异丙醇，-20 ℃ 放 置 10min ， 出 现 絮 状 DNA 沉 淀；
随后8000rpm离心5min ， 弃 掉 上 清 ； 75 ％ 酒 精 洗 沉 淀 一 次 晾 干 沉 淀 ； 加 5μL RNaseA (10μg/μL), 37℃ 10min, 除 去 RNA；
加50-100μL的TE Buffer ， 取1-5μL电泳检测；其余-20 ℃ 贮存备用。
3. 加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒混 匀20分钟，防止成团。8000r/min，离心 5min，取上清。 抽提去蛋白
4．将上清液移入新的1.5mL离心管内，加 等体积异丙醇 （预冷）。颠倒混匀，可见 DNA 絮状沉淀。沉淀核酸
5．8000r/min，离心 1min，倒掉上清液，将离心管倒置 干燥。 将沉淀回溶于无菌水或 TE 缓冲液待测。