酶工程设计方案

木瓜蛋白酶的研究

木瓜蛋白酶（Papain），又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用。

1.研究背景

1.1酶的来源

木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。在中国，木瓜种植主要分布在广西的横县和邕宁县等地，属于广西特产水果，因此，木瓜蛋白酶生产厂家主要集中在广西南宁市。

1.2酶的结构

木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力，另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）溶菌酶，分子量25000，约占可溶性蛋白质的20%及纤维素酶等不同的酶。

1.3酶的性质

木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。

1.4酶的用途

木瓜蛋白酶在食品工业上主要用于啤酒抗寒、肉类软化、谷类预煮的准备、水解蛋白质和肉类香料的生产；在工业上主要用于明胶制造、蚕茧脱胶、皮革脱毛等；在医药卫生方面，主要用于治疗消化不良、各种炎症和水肿，防止腹膜粘连，处理血检及创伤脱痂以及作为驱肠虫剂等；此外，它还可以用于研究蛋白质结构。在啤酒抗寒和肉类软化方面的应用远比其他蛋白酶类广泛。

1.4.1啤酒澄清剂

引起啤酒冷藏混浊时主要原因是啤酒中的蛋白质极易与多元酚结合成大分子

的复合物。利用啤酒澄清剂中的木瓜蛋白酶对形成混浊的蛋白质有广泛的特异性，能把大分子的蛋白质降解成小分子的物质，提高了蛋白质与多元酚复合物的溶解度；另一方面，木瓜蛋白酶是一种具有生物活性的蛋白质，该蛋白质可与引起啤酒冷藏混浊的多元酚形成稳定状态平衡，防止了啤酒的冷藏混浊。

1.4.2肉类嫩化剂

利用木瓜蛋白酶能裂解肉类中的胶原蛋白和肌肉纤维，而使肉的结构松散。由于木瓜蛋白酶是半胱氨酰基蛋白酶，能降解胶原纤维和结缔组织蛋白质，它将肌动球蛋白和胶原蛋白降解成为小分子的多肽甚至氨基酸, 令肌肉肌丝和筋腰丝断裂, 使肉类变得嫩滑，并简化蛋白质结构使人体食用后易于消化吸收。

1.4.3 饼干松花剂

利用木瓜蛋白酶的酶促反应, 将面团的蛋白质降解为小分子的肤或氨基酶, 降低了面团的拉伸阻力, 使面团变得柔软、更有可塑性, 减少弹性, 易于成型。用量视饼干厂的加工方法和面团中蛋白质的含量不同而不同，研究表明每公斤面添加0.6-1.0万单位/ 克为佳。

1.4.4 科研应用

木瓜蛋白酶可用于细胞培养实验，在准备细胞培养液的第一步中被用于分离细胞。用酶处理小组织块10分钟后，就可以将连接细胞的细胞外基质打断；然后再用蛋白酶抑制剂来停止反应，防止木瓜蛋白酶进一步裂解细胞本身；最后用pasteurpipette将组织块打散为单细胞悬浮液；在免疫学中，木瓜蛋白酶可被用于将免疫球蛋白的F c片段（可结晶）和Fab片段（抗原结合）切割开。

1.5 酶的研究现状

木瓜蛋白酶的生产和研究有将近20年的时间。近年来我们在研究木瓜蛋白酶的基础上，用纤维素及琼脂作载体，成功地制备了纤维素固定化木瓜蛋白酶及琼脂固定化木瓜蛋白酶，并测定了其营养价值及对啤酒的防浊能力。1980—2006年木瓜酶专业总文献量195篇。以分析测定为主题的论文最多，共有55篇，其次是分解降解有42篇；药理研究中又以消炎止痛的文献为多；生产工艺中以研究木瓜酶的生产居多；食理研究主要应用于肉嫩化。木瓜酶文献以分析测定最多，反映出分析鉴定在木瓜酶研究中占据着重要地位。

2.研究内容

木瓜蛋白酶作为水解蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶家族，主要存在于番木瓜的乳汁中，其应用广泛，包括细胞分离、化妆品、洗涤剂、食品和医药等行业，由于受到环境和其他条件的影响，容易变性失活，降低催化效率，从而限制了其大规模的应用。

2.1木瓜蛋白酶的固定化及活性测定

固定化酶是近代生物技术的重要手段，利用不同载体制备固定化木瓜蛋白酶，可以大大节约用酶，并能反复利用。目前国外已开始在酿造、牛奶加工等多种领域中广泛应用。

2.1.1 固定化酶的研究

固定化酶的研究最早可以追溯到1916年Nelson和Griffin首先发现被骨碳粉末吸附的酵母蔗糖酶仍具有催化活性。接着在1953年Grubhofer和Schleith

开始进行了以应用为目的的固定化酶的研究工作，他们将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合在修饰过的聚苯乙烯树脂上，实现了酶的固定化。进入六十年代后，固定化酶的研究得到了迅速发展，科研工作者们开发出了许多新的酶固定化方法，并对固定化酶的理化性质进行了大量的研究我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是微生物所和上海生化所的酶学工作者同时开始了固定化酶的研究工作。此后，许多单位相继进行了固定化酶的应用研究。

2.1.2 固定化酶与游离酶活性测定

在锥形瓶中加入一定量的原始载体，再加入木瓜蛋白酶液及DAS溶液(或戊二醛溶液)，25℃下交联反应一段时间，过滤，用大量蒸馏水洗涤，再用Tris—HCI缓冲液洗涤，得到固定化酶，待测固定化酶活性。固定化酶活性测定：在锥形瓶中加入适量的固定化酶(m1)，3ml酶激活剂，37℃水浴中预热10min后，加入10ml酪蛋白溶液(已经于37℃水浴中预热，摇匀，在37℃水浴中精确反应10min，然后加入10ml三氯醋酸溶液，剧烈摇动后，在37 ℃水浴中放置0.5h，过滤或离心，同前测吸光值。对照空白：在加入底物之前加入三氯醋酸终止剂，其余步骤同上；游离酶活性测定：在锥形瓶中依次加入1ml酶液(VI)、3ml酶激活剂，37℃水浴中预热10min后，加入10ml酪蛋白溶液(已经于37℃水浴中预热)，摇匀，在37℃水浴中精确反应10min，然后加入10ml三氯醋酸溶液，剧烈摇动后，在37℃水浴中放置0.5h后，过滤或离心，测滤液或上清液在275nm处的吸光值。对照空白：在加入底物之前加入三氯醋酸终止剂，其余步骤同上。 2.1.3 固定化酶的特性

2.1.

3.1储存半衰期

游离酶在室温下储存1．5d后，其活力只有原始酶活力的一半不到，而凝胶型或大孔型PS微球所制备的柔性固定化酶在室温下储存8天后，仍保留有原固定化酶活力的80％以上，根据酶活力半衰期公式计算，可知其半衰期为26～329S：。由此可见，柔性固定化酶的储存稳定性远远高于游离酶。

2.1.

3.2 热稳定性

将柔性固定化酶及游离酶在70"C下育温1小时之后冷却至4'C，再在37"C 下测酶活力，结果发现PS—NH2载体制备的柔性固定化酶经育温后仍有原活力的90％，而游离酶在此温度下育温后，活力损失了60％以上，因此柔性固定化酶具有较好的热稳定性。

2.1.

3.3 有机试剂的影响

将0.1g柔性固定化酶加入至5m150％的有机试剂中，存放0．5h后再测定其活力，经有机试剂浸泡后，柔性固定化酶的活力仍保留有原始活力的50％以上。而游离酶同样经有机试剂浸泡后其活力保留不到20％，可见柔性固定化酶对有机试剂的稳定性好于游离酶。

2.2木瓜蛋白酶的超声波提取法

目前，木瓜蛋白酶的提取、提纯方法很多，大多需经过各种分级沉淀、盐析、结晶、洗涤、层析等过程，这些方法提取成本高，产量低，操作较繁琐；而且经割采乳汁后的番木瓜果实未能得到充分的利用，从而造成浪费．利用超声波提取番木瓜果浆中的木瓜蛋白酶，可以提高酶的提取率，从而提高原料利用率和产品产量。

2.2.1 酶液制备

选择新鲜的番木瓜，清洗去皮、籽、瓤后，切块破碎，称取果肉，加入一定