柑橘黄龙病快速诊断与检测技术研究进展
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基金项目：“农业部华中作物有害生物综合治理重点实验室/农作物重大病虫草害防控湖北省重点实验室”开放基金课题 (2017ZTSJJ3)；湖北省农业科技创新中心项目(2017-620-003-001)；湖北省农业科技创新中心项目(2016-620-000-001-070)。 作者简介：肖翠(1988-)，女，湖南武冈人，博士后，助理研究员，主要从事柑橘危险性病原检测以及柑橘溃疡病的抗病分子机理 研究。E -m ail：690213712@ 通讯作者：孙中海，男，教授。E -m ail：hbfruit@
பைடு நூலகம்
分子检测等。
像的无损黄龙病检测技术。大多数研究者们都是通
1 田间症状诊断
过采集正常健康叶、不同症状的黄龙病感染叶片以
柑橘黄龙病会引起柑橘叶片黄化、果实畸形且 及各种缺素症状的叶片的高光谱图像后，利用不同
着色不均等病症，其中斑驳型黄化和红鼻子果的黄 的软件通过优化数据处理方法来建模，从而区分这 龙病检出率最高，因此在田间可根据此症状进行初 些具有不同症状的叶片[11-14]。该检测方法虽然便捷，
[6]陈小青，潘志新，石美宁，等.广西桑椹菌核病发生的原因分 析及其防治措施[J].广西蚕业，2017(1)：52-53.
状诊断、指示植物鉴别、基于淀粉-碘反应的诊断、基 它在可见光近红外光谱范围内的光谱反射率也会随
于高光谱成像的无损检测、免疫学检测、基于核酸的 之变化，研究者们根据此原理开发了基于高光谱成
步诊断。然而柑橘黄龙病的症状复杂多变，随季节变 但易出现误判，只能作为初步诊断。
化而表现不同症状，且易与缺素等生理性病症混淆， 5 免疫学检测
增加了田间症状诊断的不确定性。此外柑橘黄龙病
由于柑橘黄龙病病原难以培养，因此难以根据
病原的侵染存在潜伏期，在潜伏期内，柑橘虽然已经 病原细胞制备相应抗体，致使柑橘黄龙病的免疫学 感病，但不易表现症状，此时则不能通过田间症状来 检测一直难以推广。但是近期Ding等[15-16]根据柑橘
柑橘黄龙病是由难培养的韧皮部杆菌(Candida- 包括均匀黄化、斑驳黄化、缺素黄化等，果实变小、畸 tus Liberibacter species´)引起的世界性检疫性病害， 形、着色不均，常现“红鼻子果”、种子败育，根系须根 广泛分布在亚洲、非洲、美洲的40多个国家和地 少，新根生长受到抑制，支根腐烂，最终导致感病柑 区[1]，我国广东、福建、广西、台湾、海南、云南、四川、 橘丧失结果能力或死亡，造成毁园，严重危害柑橘产 江西、浙江、湖南、贵州等柑橘产区已遭受柑橘黄 业，而且目前尚无有效防治药剂和抗病(耐病)品种。 龙病的危害[2]。引起该病的病原有3种类型，亚洲种 自21世纪以来，柑橘黄龙病向北扩散的态势仍在继 (ticus´)、非洲种(Ca.L.africanus´)和美洲 续[2]，北缘柑橘黄龙病非疫区发生黄龙病的危险性在 种(Ca.L.americanus´)[3]，其中亚洲种为我国广泛分 进一步加大，因此加强柑橘黄龙病的检验检疫工作 布的病原[4]。该病原主要危害芸香科植物中的柑橘 是保护非疫区柑橘的前提，也是预防柑橘黄龙病的 属、金柑属和枳属，引起柑橘叶片变厚、变小且黄化， 基础。目前用于柑橘黄龙病的检测方法包括田间症
诊断，因此田间症状诊断难以实现早期检测。
黄龙病病原亚洲种的主要外膜蛋白(Major Outer
2 指示植物鉴别
Membrane Protein，OmpA)制备了对其具有高特异性
现有柑橘栽培品种绝大多数对黄龙病较敏感， 的多克隆抗体，而且开发了直接组织免疫印迹法
其中椪柑极其感病，因此研究者们将其作为指示植 (Direct Tissue Blot Immunoassay，DTBIA)用于柑橘黄
[3]刘选银，刘奎.关于桑椹菌核病综合防控措施探讨[J].蚕学通 讯，2015，35(4)：14-16.
[4]蒯元璋，吴福安.桑椹菌核病病原及病害防治技术综述[J].蚕 业科学，2012，38(6)：1099-1104.
[5]唐翠明，罗国庆，吴福泉，等.桑椹菌核病的发生规律及其防 治方法[C].中国蚕学会全国桑保学术研讨会，2004：10-12.
柑橘黄龙病快速诊断 与检测技术研究进展
肖 翠1 廖晶晶1，2 何利刚1 仝 铸1 吴黎明1 王志静1 蒋迎春1 黄咏明1 孙中海1 (1.湖北省农业科学院果树茶叶研究所 武汉 430209；2.长江大学园艺园林学院 荆州 434100)
摘要：综述了田间症状诊断、指示植物鉴别、基于淀粉-碘反应的诊断、基于高光谱成像的无损检 测、免疫学检测、基于核酸的分子检测等柑橘黄龙病检测技术的优缺点，并指出巢式PCR、定量 PCR与LAMP技术等基于核酸的分子检测技术，因其检测灵敏度高，可以对无症样品进行检测， 在柑橘黄龙病的早期检测上具有良好的应用前景，同时提出开发一种无需DNA模板制备的柑橘 黄龙病LAMP检测技术，将为田间大规模的样品提供快速、准确、高效、低成本、高灵敏度的检测手 段，具有重大的应用价值。 关键词：柑橘；黄龙病；快速诊断；分子检测
措施，减轻菌核病的危害，促进桂北果桑产业健康有
利发展。 参考文献 [1]浦冠勤，毛建萍，朱引根，等.桑椹菌核病的发生与综合治理
[J].中国蚕业，2008，29(3)：50-51. [2]卓秋虹，黄小丹，许胜，等.广西桑椹菌核病发生为害特点及
综合防控措施[J].广西蚕业，2015，52(4)：40-44.
柑橘感染黄龙病后会引起韧皮部组织坏死和筛 于免疫印迹的免疫捕获PCR用于黄龙病亚洲种的检
管堵塞，从而导致淀粉代谢异常，叶片积累大量淀 测。利用植物组织印迹法(Tissue printing)可以便捷 粉[5-7]，因此研究者们开发了基于淀粉-碘反应的黄龙 地在田间大规模采样，而且所采样品可以通过硝酸
物用于鉴别柑橘黄龙病。然而从病源嫁接传毒到病 龙病亚洲种的检测。此方法通过将带病柑橘的嫩枝
症的发生，需要很长的周期，且准确性与灵敏度均存 或叶柄印迹到硝酸纤维膜上，再通过抗原抗体反应
在局限性，不能做到快速和早期检测。 3 淀粉-碘反应诊断
在膜上显色，通过观察印迹中韧皮部是否呈现紫色 来判断有无黄龙病的感染。随后Ding等[17]开发了基
பைடு நூலகம்
分子检测等。
像的无损黄龙病检测技术。大多数研究者们都是通
1 田间症状诊断
过采集正常健康叶、不同症状的黄龙病感染叶片以
柑橘黄龙病会引起柑橘叶片黄化、果实畸形且 及各种缺素症状的叶片的高光谱图像后，利用不同
着色不均等病症，其中斑驳型黄化和红鼻子果的黄 的软件通过优化数据处理方法来建模，从而区分这 龙病检出率最高，因此在田间可根据此症状进行初 些具有不同症状的叶片[11-14]。该检测方法虽然便捷，
[6]陈小青，潘志新，石美宁，等.广西桑椹菌核病发生的原因分 析及其防治措施[J].广西蚕业，2017(1)：52-53.
状诊断、指示植物鉴别、基于淀粉-碘反应的诊断、基 它在可见光近红外光谱范围内的光谱反射率也会随
于高光谱成像的无损检测、免疫学检测、基于核酸的 之变化，研究者们根据此原理开发了基于高光谱成
步诊断。然而柑橘黄龙病的症状复杂多变，随季节变 但易出现误判，只能作为初步诊断。
化而表现不同症状，且易与缺素等生理性病症混淆， 5 免疫学检测
增加了田间症状诊断的不确定性。此外柑橘黄龙病
由于柑橘黄龙病病原难以培养，因此难以根据
病原的侵染存在潜伏期，在潜伏期内，柑橘虽然已经 病原细胞制备相应抗体，致使柑橘黄龙病的免疫学 感病，但不易表现症状，此时则不能通过田间症状来 检测一直难以推广。但是近期Ding等[15-16]根据柑橘
柑橘黄龙病是由难培养的韧皮部杆菌(Candida- 包括均匀黄化、斑驳黄化、缺素黄化等，果实变小、畸 tus Liberibacter species´)引起的世界性检疫性病害， 形、着色不均，常现“红鼻子果”、种子败育，根系须根 广泛分布在亚洲、非洲、美洲的40多个国家和地 少，新根生长受到抑制，支根腐烂，最终导致感病柑 区[1]，我国广东、福建、广西、台湾、海南、云南、四川、 橘丧失结果能力或死亡，造成毁园，严重危害柑橘产 江西、浙江、湖南、贵州等柑橘产区已遭受柑橘黄 业，而且目前尚无有效防治药剂和抗病(耐病)品种。 龙病的危害[2]。引起该病的病原有3种类型，亚洲种 自21世纪以来，柑橘黄龙病向北扩散的态势仍在继 (ticus´)、非洲种(Ca.L.africanus´)和美洲 续[2]，北缘柑橘黄龙病非疫区发生黄龙病的危险性在 种(Ca.L.americanus´)[3]，其中亚洲种为我国广泛分 进一步加大，因此加强柑橘黄龙病的检验检疫工作 布的病原[4]。该病原主要危害芸香科植物中的柑橘 是保护非疫区柑橘的前提，也是预防柑橘黄龙病的 属、金柑属和枳属，引起柑橘叶片变厚、变小且黄化， 基础。目前用于柑橘黄龙病的检测方法包括田间症
诊断，因此田间症状诊断难以实现早期检测。
黄龙病病原亚洲种的主要外膜蛋白(Major Outer
2 指示植物鉴别
Membrane Protein，OmpA)制备了对其具有高特异性
现有柑橘栽培品种绝大多数对黄龙病较敏感， 的多克隆抗体，而且开发了直接组织免疫印迹法
其中椪柑极其感病，因此研究者们将其作为指示植 (Direct Tissue Blot Immunoassay，DTBIA)用于柑橘黄
[3]刘选银，刘奎.关于桑椹菌核病综合防控措施探讨[J].蚕学通 讯，2015，35(4)：14-16.
[4]蒯元璋，吴福安.桑椹菌核病病原及病害防治技术综述[J].蚕 业科学，2012，38(6)：1099-1104.
[5]唐翠明，罗国庆，吴福泉，等.桑椹菌核病的发生规律及其防 治方法[C].中国蚕学会全国桑保学术研讨会，2004：10-12.
柑橘黄龙病快速诊断 与检测技术研究进展
肖 翠1 廖晶晶1，2 何利刚1 仝 铸1 吴黎明1 王志静1 蒋迎春1 黄咏明1 孙中海1 (1.湖北省农业科学院果树茶叶研究所 武汉 430209；2.长江大学园艺园林学院 荆州 434100)
摘要：综述了田间症状诊断、指示植物鉴别、基于淀粉-碘反应的诊断、基于高光谱成像的无损检 测、免疫学检测、基于核酸的分子检测等柑橘黄龙病检测技术的优缺点，并指出巢式PCR、定量 PCR与LAMP技术等基于核酸的分子检测技术，因其检测灵敏度高，可以对无症样品进行检测， 在柑橘黄龙病的早期检测上具有良好的应用前景，同时提出开发一种无需DNA模板制备的柑橘 黄龙病LAMP检测技术，将为田间大规模的样品提供快速、准确、高效、低成本、高灵敏度的检测手 段，具有重大的应用价值。 关键词：柑橘；黄龙病；快速诊断；分子检测
措施，减轻菌核病的危害，促进桂北果桑产业健康有
利发展。 参考文献 [1]浦冠勤，毛建萍，朱引根，等.桑椹菌核病的发生与综合治理
[J].中国蚕业，2008，29(3)：50-51. [2]卓秋虹，黄小丹，许胜，等.广西桑椹菌核病发生为害特点及
综合防控措施[J].广西蚕业，2015，52(4)：40-44.
柑橘感染黄龙病后会引起韧皮部组织坏死和筛 于免疫印迹的免疫捕获PCR用于黄龙病亚洲种的检
管堵塞，从而导致淀粉代谢异常，叶片积累大量淀 测。利用植物组织印迹法(Tissue printing)可以便捷 粉[5-7]，因此研究者们开发了基于淀粉-碘反应的黄龙 地在田间大规模采样，而且所采样品可以通过硝酸
物用于鉴别柑橘黄龙病。然而从病源嫁接传毒到病 龙病亚洲种的检测。此方法通过将带病柑橘的嫩枝
症的发生，需要很长的周期，且准确性与灵敏度均存 或叶柄印迹到硝酸纤维膜上，再通过抗原抗体反应
在局限性，不能做到快速和早期检测。 3 淀粉-碘反应诊断
在膜上显色，通过观察印迹中韧皮部是否呈现紫色 来判断有无黄龙病的感染。随后Ding等[17]开发了基