免疫组化染色的常见问题及定量分析140313
免疫组化结果判断及常见问题的分析
非特异性染色
总结词
非特异性染色是由于抗体与非目标组织成分的交叉反应导致的。
详细描述
非特异性染色是免疫组化实验中常见的问题，通常是由于抗体与组织中非目标成分的交叉反应。为了减少非特异 性染色，可以尝试降低抗体浓度、增加洗涤步骤或使用阻断剂等方法。
背景染色
总结词
背景染色是由于组织中其他成分的非特异性染色或由于抗体与组织中其他成分的交叉反应导致的。
免疫组化结果判断及常见问题 的分析
目
CONTENCT
录
• 免疫组化基本概念 • 免疫组化结果解读 • 常见问题及解决方法 • 免疫组化在临床上的应用 • 免疫组化技术新进展
01
免疫组化基本概念
定义与原理
定义
免疫组化是一种利用抗原-抗体反应原理，通过标记的抗体在组织 或细胞中检测特定抗原的方法。
免疫组化可以与其他技术如原位杂交、原位PCR等联合应用，以同时检测抗原和 相关基因的表达，提供更全面的分子信息，有助于深入了解疾病的发生发展机制 。
联合应用多种技术可以相互补充，提高检测的敏感性和特异性，为临床诊断和治 疗提供更可靠的依据。
THANK YOU
感谢聆听
数字免疫组化技术
数字免疫组化技术是一种基于数字图像分析的免疫组化技术 ，通过高分辨率数字成像系统获取组织切片图像，利用计算 机软件进行图像分析和处理。
数字免疫组化技术能够实现自动化、高通量的组织切片分析 ，提高检测效率，减少人为误差，特别适合大规模临床筛查 和流行病学研究。
免疫组化与其他技术的联合应用
04
免疫组化在临床上的应用
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
免疫组化技术可以检测肿瘤组织中特定抗原 的表达，从而确定肿瘤的性质和来源。通过 对不同肿瘤标志物的检测，有助于医生对肿 瘤进行准确的诊断。
免疫组化实验常见问题及解决方案
解决办法
通透作用破坏了膜
去除缓冲液中的通透剂
固定的方法对抗原不合适
尝试不同的固定剂，关于固定剂的使用选择见补充材料
没有及时固定引起抗原扩散
取材后立即固定
可能原因
解决办法
缺乏抗原
做Western blot检测目标蛋白是否有表达或原位杂交检测mRNA是否有表达
抗体无效
避免反复冻融；用阳性片子进行检测
抗原修复无效
改进抗原修复方法
抗原-抗体结合不足
加大一抗浓度，增加孵育时间
抗体不能穿过细胞
加Triton x-100到封闭液中，通透组织
2，高背景
下图样本是小鼠皮下移植瘤组织，目标蛋白LYVE1，A图是我们想得到的结果，B图是做出来的实验结果，与A图相比，B图背景高。
可能原因
解决办法
脱蜡不足
适当延长二甲苯浸泡次数和时间
干片，组织过于干燥
避免干片
抗原修复过度
减少修复时间
内源性酶干扰
添加淬灭操作
Fc受体干扰
用二抗来源的血清取代BSA封闭
抗体浓度过高
适当增加稀释比例
染色时间过长
镜检观察显色，合膜组织，目标蛋白IL-10，A图是我们想得到的结果，B图是做出来的实验结果，在与A图相同位置的B图中没有检测到抗原，反而在组织边缘检测到组织表达。
下图样本是人小肠粘膜组织目标蛋白il10a图是我们想得到的结果b图是做出来的实验结果在与a图相同位置的b图中没有检测到抗原反而在组织边缘检测到组织表达
免疫组化实验常见问题及解决方案
1，缺乏染色
下图样本是正常人肝血管组织，目标蛋白是α-平滑机动蛋白，A图是我们想得到的结果，B图是做出来的实验结果，与A图相比，在红圈处并没有检测到抗原。
免疫组化染色的常见问题及定量分析
整理课件
19
二.胃蛋白酶(Pepsin)消化方法
1.配制：0.4％胃蛋白酶，用0.1mol/L的Hcl配制。 2.消化时间：37℃20 min。 3.用途：主要用于细胞间质抗原的显示，如纤粘素、
整理课件
68
激光显微切割的缺点
未封片的组织切片组织结构较模糊，会影 响显微切割的准确性。
整理课件
11
染色中各步骤注意事项及原理
前期处理 染色 后期处理
整理课件
12
前期
不可控制因素：取材、固定、脱水、透明、 浸蜡，包埋
可控制因素： 捞片：注意不要太靠近一侧，必要时用镊
子压住组织片控水
整理课件
13
染色过程中的影响因素
阻断非特异性过氧化物酶 抗原修复 封闭抗原非特异性表达 一抗 二抗 DAB显色
整理课件
60
PALM激光显微切割系统简介
PALM激光显微切割系统是由德国PALM 公司研发的一套高级精确的实验室设备。利 用337纳米的紫外激光对显微镜下的生物样 本 (组织、细胞簇、单细胞、染色体及染色 体片断等）进行切割和分离。在病理学、遗 传学和肿瘤学等多个科研领域得到非常广泛
的应用。
整理课件
整理课件
7
免疫组化的优点
特异性强 ：抗原与抗体的“一对一”的特 异结合，仅当组织细胞中存在交叉抗原时 会出现交叉反应 。
敏感性高 定位准确、形态与功能相结合
整理课件
8
免疫组化技术操作上的优点
方法简单，易掌握 在组织切片原位显示抗原的表达情况 试验条件要求不高，绝大多数实验室都可
免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及其对策
免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及其对策良好的免疫组化染色切片是正确推断染色结果的基础和前提。
由于免疫组化染色过程中存在许多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件特别简单的事。
需要病理技术员和病理医生亲密协作、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。
虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和"杂音'染色片（有阳性信号）。
一、无色片染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。
这是常规工作中比较常见的现象，消失这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有消失问题，组织或细胞的确不表达与抗体相关的抗原。
2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。
假阴性结果又可分为两种状况：（1）切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。
消失这种状况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。
获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。
由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不行缺少的作用。
（2）染色过程中的某一或某些环节出了问题。
比如，组织未进行抗原修复，有的组织必需经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个渐渐的过，但间或也遇到突然失效的状况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的缘由。
也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如遗忘加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。
为了避开这种简洁的错误，有一种简洁的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观看是否消失棕色。
假如消失了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。
假如这种DAB再滴到切片上没有消失任何阳性信号，问题肯定是出在三抗以前。
免疫组化染色常见问题及解释
一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。
在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。
因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。
另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。
离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。
标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。
虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。
因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。
二、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。
如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。
由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成年人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。
因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。
三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。
如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。
免疫组化技术常见问题及处理方法
染色弱或无信号问题可能是由于抗体浓度过低、孵育时间不 足、组织抗原量少等原因所致。为解决这一问题，可以增加 抗体浓度、延长孵育时间、增强组织抗原的暴露等措施，以 提高染色强度。
染色背景问题
总结词
染色背景是指染色结果中除了目标蛋白外的其他染色，通常表现为整个视野的弥漫性着 色。
详细描述
染色背景问题可能是由于抗体与组织中其他蛋白的交叉反应、组织内源性酶活性、组织 处理过程中产生的物质等所致。为解决这一问题，可以采取使用阻断剂、降低抗体浓度、
定期对仪器设备进行校准，确保 其性能稳定、准确可靠。同时， 对设备进行日常维护，及时排除 故障，保证实验的正常进行。
试剂储存和有效期问题
总结词
试剂的储存和有效期直接关系到实验 结果的可靠性。
详细描述
严格按照试剂说明书进行储存，避免 试剂受潮、光照、高温等不利因素的 影响。关注试剂的有效期，避免使用 过期试剂。
详细描述
固定和保存组织的目的是为了保持组织结构 和抗原性。不同的组织需要不同的固定液和 固定时间，以确保抗原的完整性和稳定性。 同时，组织的保存条件也需严格控制，以防
抗原丢失或降解。
04
仪器设备和试剂问题
仪器设备校准和维护问题
总结词
仪器设备校准和维护是确保免疫 组化实验准确性的关键环节。
详细描述
详细描述
为了促进免疫组化技术的数据共享和交流，需要建立 统一的数据库和平台，以便研究人员能够共享数据、 交流经验和技巧。此外，应鼓励研究人员在学术会议 和期刊上发表研究成果，促进技术的传播和应用。通 过加强数据共享和交流，可以推动免疫组化技术的进 步和创新，提高其在医学研究中的应用价值。
THANK YOU
感谢聆听
免疫组化实验步骤及常见问题分析
免疫组化实验步骤及常见问题分析免疫组化实验步骤及常见问题分析免疫组化实验流程1.样品制备2.组织固定：根据要求收集人或动物的组织用于IHC分析，冲洗并用固定剂（一般用甲醛）进行固定3.组织包埋：将经甲醛固定的组织嵌入石蜡，以长期保持其天然形状和组织结构4.切片安装：将组织样品在切片机上切片，并转移至载玻片上干燥保持其形态5.脱蜡水化：因切片上的石蜡会妨碍染色，所以需将切片上的石蜡溶出，并水化。
脱蜡或水化不全容易造成非特异性背景着色（一般的脱蜡水化步骤是：将切片依次浸入二甲苯Ⅰ10min-二甲苯Ⅱ10min-无水乙醇5min-95%无水乙醇5min-90%无水乙醇5min-80%无水乙醇5min-70%无水乙醇5min-50%无水乙醇5min-蒸馏水5min×3，进行脱蜡水化）。
6.抗原修复：由于组织在甲醛固定过程中，蛋白之间发生了交联及醛基的封闭从而掩盖抗原决定簇。
可以通过高压加热修复抗原，使细胞内抗原决定族暴露，从而提高抗原检测率。
7.非特定位点封闭：为了防止一抗的非特异性结合造成假阳性，可以选用BSA、羊血清等封闭非特异性结合位点。
封闭血清来源一般与二抗保持一致，室温封闭10-30min。
8.样品染色一抗、二抗孵育：抗体孵育时间、温度及浓度等因素对染色结果都存在很大影响。
在4℃下反应缓慢，背景较浅；37℃反应较快时间较短；而室温介于两者之间，选择室温有利于实验的进行。
二抗一般室温孵育30min。
底物显色：基于与酶缀合的二抗，抗原通过生色或荧光方式直接检测。
复染封片：组化染色后进行复染可以衬托出组织形态结构，常用的复染剂有苏木精、曙红、甲基绿、DAPI和Hoechst荧光染色。
观察结束后使用中性树胶进行封片，可以长久保存。
免疫组化实验常见问题分析1. IHC实验结果显色过深一抗浓度过高或孵育时间过长——降低一抗浓度或减少孵育时间孵育温度过高——选择4℃或室温孵育2. 实验结果存在非特异性显色石蜡切片脱蜡不够——延长脱蜡时间蛋白封闭不充分——增加蛋白封闭时间组织富含内源性生物素与过氧化物酶——使用相关试剂进行封闭3. 实验结果显色弱或无染色一抗浓度过低或孵育时间过短——增加一抗浓度或延长孵育时间组织中无目的抗原的表达：一抗种属来源与二抗不匹配免疫组化实验注意事项切片脱蜡和水化要充分，加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，同时防止干片。
免疫组化关键步骤常见问题和解决方案范文
免疫组化关键步骤常见问题和解决方案范文精品论文参考文献1.3脱蜡至水洗中应注意的问题脱蜡液应经常更换，必须保证脱蜡干净，彻底，水洗充分，水洗之后切片应放在蒸馏水中清洗1～2遍，脱蜡不干净，不彻底时，就会出现非特异性着色，影响染色效果，即阳性强度也会减低。
1.4抗原修复中应注意的问题目前常用的抗原修复液有两种：即0.01M柠檬酸缓冲液（PH6.0）和1mM的EDTA缓冲液（PH9.0或PH8.0）.对于一些胞浆阳性或胞膜阳性的抗体，选择柠檬酸缓冲液比较好，而对于一些胞核阳性的抗体，选择EDTA缓冲液比较好。
配置修复液时必须用蒸馏水，否则染色会失败，大部分抗体都会出现假阴性。
抗原修复方法目前比较常用的是高压锅喷气2～3分钟，中火（120℃～140℃）。
自然冷却，如果要节省时间，可用自来水冲洗高压锅外面，等到压力降下，再把高压锅锅盖打开，放在冷水中冷却，中途可换一次水，这样既节省用水，又可节约时间，等到高压锅中水温接近常温，就可直接用自来水冲洗切片[1]。
1.5滴加抗体前和滴加抗体时应注意的问题切片冲洗好后，应放在蒸馏水中，拿出画圈，画圈时应注意圆圈与组织必须保持一点距离，否则会产生边缘效应，即圆圈旁组织会产生非特异性染色。
画好圈后，用PBS冲洗切片，注意画完圈后尽量不要让切片干燥，画完圈后也不能立时冲洗，要等油干燥后再冲洗，否则油就冲掉了，就不能起到防止抗体外溢的效果。
用蒸馏水配置PBS时，需加一些吐温或去垢剂，有利于冲洗的更干净，也有利于滴加完抗体后抗体的弥散速度，抗体弥散速度快，操作简便，节约时间。
一抗孵育可选择37℃温箱1小时或4℃冰箱过夜，而二抗的孵育一般都是室温，添加二抗前和显色前，PBS都必须彻底冲洗干净，否则会产生非特异性着色。
1.6显色时应注意的问题在保证显色液配制浓度准确的情况下，显色时间应严格把握。
当制作大批切片时，可以批量滴加显色液，先用肉眼观察组织是否变黄，若变黄时，可在镜下控制，每种抗体的显色时间，背景着色能都不太一样，具体可在镜下控制，积累经验。
5.免疫组化染色中常见问题及处理
病理科常用肿瘤鉴别诊断标记物
免疫组化的临床应用
2、肿瘤的恶性程度与预后判断
近20年来，以P16（宫颈癌）、P504S（前列 腺癌）、Ki-67（肿瘤增殖、预后监测）、 PCNA（肿瘤增殖、预后监测）、P53（癌基 因、预后监测）等为代表的数十种恶性肿瘤 相关抗体相继被广泛应用于肿瘤性质的判断 和预后，从而使恶性肿瘤的辨识更加精确。
2.染色阳性强度和阳性检出率相结合：
阳性细胞数＜25%
－
25%-50%
+
50%-75%
++
＞75%
+++
四、其他常见问题
（三）假阳性、假阴性及背景着色的原因 1、假阳性的原因 ➢抗体与非特异性抗原结合 ➢抗体浓度过高 ➢非特异性吸附 ➢内源性酶的催化作用 ➢人为判断失误 ➢外源性或内源性色素的干扰
（六）孵育方法及时间
环境：特制的湿盒内，避免切片干燥致染 色失败
温度及时间：37℃，1h
延长孵育时间：4℃过夜
（七）显色
两种方法：
（1）3,3’-二氨基联苯胺（DAB） 配制方法及注意事项：
现用现配，配好后30min内使用，作用时间 5min以内；配好后需过滤
DAB TBS（0.05mol/L，pH7.6 ） 30%H2O2（显色前加入）
－
－
抗体稀释度的测定
（2）棋盘法：当一抗、二抗、三抗都未知 稀释度时
二抗稀释度 1:50
一抗稀释度
1:100
1:200
1:100 ++++(++) ++++(+) +++(－)
免疫组化实验遇到的问题分析及改进方法
免疫组化实验遇到的问题分析及改进方法1石蜡切片在染色过程中出现脱片现象1）烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度；2）用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做；3）有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织；4）用高温修复时，温度骤冷也可能引起。
2边缘效应1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。
解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。
2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。
解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。
用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。
3产生组织切片非特异性染色1）抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。
这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。
这是最重要的一条；2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；5）DAB孵育时间过长或浓度过高；6）PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；7）标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。
4免疫组化染色呈阴性结果1）抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误；2）抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高火4次*6min试试。
有人做过实验，这是最佳的时间和次数。
若不行，还可高压修复；3）组织切片本身这种抗原含量低；4）血清封闭时间过长；5）DAB孵育时间过短；6）细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应；7）开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。
免疫化学染色技术常见问题及解决方法
免疫化学染色技术常见问题及解决方法染色不足
2. 阳性对照有足够的特异性染色，背景干净；组织显示很少或没有特异性染色，但在几种组织成分中有不同的程度的背景染色。
背景染色
1. 背景染色见于所有对照组织和标本组织，或在一些组织成分，如结缔组织、脂肪和上皮组
2. 标本组织和阴性试剂对照玻片显示背景染色，阳性和阴性对照组织显示正确的特异性染色；
局灶性背景染色
1. 在对照、标本和玻片的局部区域出现染色不一致
2.标本中的脂肪或结缔组织、阴性对照组织和阳性对照试剂玻片中，背景染色出现在结缔组织和上皮组织中
3. 标本中的上皮组织、阴性对照组织、阳性对照组织和阴性对照试剂玻片中，特别在上皮呈中至强染色；背景染色出现在结缔组织和上皮组织中
7. 应用生物素—链菌素卵白素染色系统时，在所有对照和标本组织中均见背景染色
不正确的“特异性”染色
1.在标本组织、阳性对照、阴性组织对照和阳性试剂对照的白细胞胞膜出现阳性染色。
（完整word版）免疫组化常见问题
（完整word版）免疫组化常见问题免疫组化常见问题与回答集锦一、石蜡切片和冰冻切片的比较？1. 要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。
因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。
2. 冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。
缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。
当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。
3. 石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80oC 的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。
由于石蜡切片可以切到4 口左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。
二、一抗的选择要点和技巧是什么？1. 单克隆和多克隆抗体的选择。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。
单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色(可以通过封闭等避免)。
2. 应用范围的选择。
有的一抗只能用于WB ( Western blotting )或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。
3. 种属反应性的选择。
这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。
4. 种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。
免疫组织化学技术常见问题分析及改进措施
免疫组织化学技术常见问题分析及改进措施目的：分析免疫组织化学技术中常见问题，并提出相应改进措施。
方法：以2010年1月-2012年12月笔者所在科收治的80例患者病史资料为依据，根据切片方法不同分为A、B两组，比较两组切片质量及常见问题。
结果：本次研究的患者中A组有15例切片出现质量问题。
改进操作后的患者切片即B组均清晰地观察到阳性细胞。
结论：免疫组织化学技术环节多、问题多，应提出有针对性地改进措施，不断完善。
标签：免疫组织；化学技术；改进措施要进行免疫组织化学检测，必须首先有良好的免疫组化学切片。
这一制作过程相对复杂，有许多环节，故而容易出现问题，而每一个环节出错都将影响最终结果。
所以相关医务技术人员应具备扎实的技术功底，把好每一关，最终得出准确的检测结果。
笔者结合自身工作经验，对常见问题的改进做出分析，现报告如下。
1 资料与方法1.1 一般资料分析笔者所在科2010年1月-2012年12月对80例患者进行病理分析的诊断结果数据，患者中有15例需要鉴别低分化癌与肉瘤，20例需要鉴别转移癌的性质，13例需要分析肿瘤细胞来源以及其分化程度，10例要检测患者组织耐药基因，12例为检测肿瘤组织分化活性，10例是肿瘤患者治疗后的回访检测。
根据切片方法不同分为A、B两组。
经过对患者组织切片的临床观察，A组鉴别低分化癌与肉瘤的患者中有4例确诊为低分化癌，之后接受化疗，2例为肉瘤的患者则采取手术切除治疗；11例患者已经发生淋巴及血液转移；肿瘤细胞来源及分化程度分析的患者中有6例是由癌细胞转移发病，2例为原发癌，均为高分化癌；5例经过治疗后的患者MDR1耐药基因表达明显升高；检测肿瘤组织分化活性的6例患者中有4例为G1，分化活性较低，2例G2，即中分化；回访检测的患者中3例复发，2例目前无变异。
B组6例确诊为低分化癌，3例为肉瘤；9例患者已经发生淋巴及血液转移；3例是由癌细胞转移发病，2例为原发癌；5例治疗后的患者耐药基因表达升高；3例分化活性较低，3例中分化；回访检测中3例复发，2例无变异。
免疫组化技术常见问题及处理方法
contents
目录
• 实验操作问题 • 染色问题 • 仪器设备问题 • 图像分析问题 • 质量控制与标准化问题
01 实验操作问题
抗原修复问题
总结词
抗原修复是免疫组化实验中的关键步骤，处理不当可能导致抗原失活，影响染色结果。
详细描述
抗原修复过程中需注意使用适当的修复液和修复条件，如pH值、温度和时间，以保持 抗原的完整性和活性。修复液的选择和使用方法需根据抗原类型和抗体特异性进行选择
感谢您的观看
背景染色过高
可能是由于抗体非特异性结合或 清洗不彻底造成，可通过增加清 洗次数或使用低浓度的抗体解决。
组织切片染色不均
可能是由于切片厚度、组织处理 不当或抗体分布不均导致，需确 保切片质量并优化组织处理流程。
室间质评问题
不同实验室间染色结果差异大
可能是由于抗体来源、实验操作、仪器设备等不同造成，需建立统一的操作规程和质控标准。
04 图像分析问题
图像分析软件选择问题
总结词
选择合适的图像分析软件是进行免疫组化图像分析的 关键，不同的软件具有不同的特点和适用范围。
详细描述
在选择软件时，需要考虑软件的算法、功能、操作简 便性、准确性以及是否符合实验室需求等因素。常用 的免疫组化图像分析软件包括Image Pro Plus、 ImageJ、CellProfiler等。
总结词
背景染色问题通常是由于非特异性结合或内源性酶的干扰导致的。
详细描述
为减少背景染色，可以尝试增加洗涤次数，以减少非特异性结合；同时，使用内源性酶抑制剂可以有效抑制内源 性酶的干扰。此外，优化抗体稀释比例和使用低速离心技术也可以帮助减少背景染色问题。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
DNA分析
杂合性缺失（LOH） DHPLC 比较基因组杂交（CGH，
comparative genomic
hybridisation）
基因表达分析
RT-PCR real time quantitative PCR cDNA array 序列基因表达分析（serial anallysis of gene expression）
钟 DAB显色过快，少于一分钟时，注意一次显 色的片子不要超过5张。 注意DAB渣子的问题，配好的DAB显色液应 为清亮，微带烟色，如看到颗粒样物或呈棕 色，应予以过滤
抗原的“例外”表达
细胞的分化不同阶段其抗原性有相应变
更，可解释这些抗原的“例外”表达。
出现背景着色的其他几种原因
免疫组化染色的常见问题、 激光显微切割及冰冻切片
北京肿瘤医院 病理科 董彬
免疫组化原理和方法
定义： 组织化学 Histochemistry Dealing with identification of chemical components in cells and tissues.
概念：
利用已知的特异性抗体与抗原能特异性
抗原修复
甲醛固定过程中形成醛键而封闭了部分 抗原决定簇 甲醛在保存进程中会形成羧甲基，而封 闭抗原决定簇 在用固定剂固定时，会使蛋白与蛋白之 间发生交联，也可能会封闭抗原决定簇
抗原修复方法
化学方法 物理／化学方法
化学方法
一.胰蛋白酶(tyrpsin)消化方法： 1.配制： 取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml 溶解即可用。
染色中各步骤注意事项及原理
前期处理
染色
后期处理
前期
不可控制因素：取材、固定、脱水、透 明、浸蜡，包埋 可控制因素： 捞片：注意不要太靠近一侧，必要时用 镊子压住组织片控水
染色过程中的影响因素
阻断非特异性过氧化物酶 抗原修复 封闭抗原非特异性表达 一抗 二抗 DAB显色
结合这一特点，通过化学反应，使标记
于特异性抗体上的显示剂显色，从而在
抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构，
了解抗原表达情况的一门组化技术。
原理：
利用抗原抗体能够特异性结合这一原理，
从而在组织细胞水平进行抗原抗体反应。
一抗的类别
蛋白质 肽类 酶类 激素类 糖类 脂质类抗原
显示剂
单细胞分析
基因突变
病毒DNA序列的插入
免疫球蛋白基因序列重排 蛋白质分析 cDNA array 可用如全基因组扩增的模板，得到表达文 库
酶
金属离子
同位素
荧光分子
底物
DAB(3,3-二胺基联苯胺) AEC(3-氨基-9-乙基卡巴唑) 坚牢蓝 核固红
免疫组化的优点
特异性强 ：抗原与抗体的“一对一”的
特异结合，仅当组织细胞中存在交叉抗
原时会出现交叉反应 。
敏感性高
定位准确、形态与功能相结合
免疫组化技术操作上的优点
5、灵活
PALM的操作可以将整个片子上所有感兴趣 的区域标记出来, 然后点击切割按钮, 从切割 到收集一切工作可以自动完成。此外还可以用 不同颜色标记出不同种类的细胞 , 软件会自动 分次收集同类细胞。可以自动计算出每个区域 的面积。所有的区域都可以以文件的形式储存 在电脑中, 配合上位置记忆功能, 这样同一张 片子在任何时候都可以拿出来进行分析 , 而无 需进行繁琐的重复性劳动。可以随时将屏幕上 的画面存档。可以用快捷键或鼠标随时调节激 光的能量和聚焦位置。
PALM激光显微切割系统的优点:
1、精确 其切割精度可达1个微米, 完全可以胜任染色 体级别的切割操作,是同类产品中唯一可以切割染 色体的系统。 2、安全 由于采用了 337 纳米的安全紫外激光 , 不会对 生物样本造成损害和变异, 同时避免了红外光的热 效应。
3、高纯度 采用了 PALM 公司的 LPC ( 激光弹射收集）技 术 , 对目标先进行切割 , 然后发射一个激光脉冲 , 把目标向上弹射 , 进入收集装置。整个过程简单 , 没有任何机械接触, 无污染, 不需要特殊耗材。 4、人性化操作 一个好的工具在操作上应该是简单合理的。 PALM 通过一个智能化软件 PALM Robot 可以完成 所有的切割工作, 也就是说所有的工作都用鼠标完 成。一个熟练的操作者完成一个操作只需要几十 秒的时间。
假阴性的原因
(1)抗体己失活、浓度不当或抗体本身达不到应 有的敏感度，不论是自产抗体、国外赠送的抗 体还是商品化的抗体，都会有抗体不能显示相 应抗原的现象
(2)抗原丢失或减弱，当标本处理不当时更容易 出现，如固定不良、温度过高 (3)操作步骤不当，即纯技术上的失误，如反应 时间不够或过久、洗脱不够等。
假阳性的原因
抗体与多种抗原有交叉反应 抗体与组织中某些成分的非特异性结合 内源性酶的显色 肿瘤或病变中有其他组织残留，尤其是肿瘤中残余极 少的正常组织，而正常组织此时又有一定程度的增生 或萎缩时，易将其误认为肿瘤成分 抗原的弥散或被瘤细胞吞噬而使抗原在不该出现的部 位出现，如何杰金病Rs细胞中的免疫球蛋白 异位抗原的表达，
0.05%或0.1％, PH7．8的无水氯化钙水溶液中，
2.消化条件和时间：将切片放置在湿盒内，
37℃10一40min，一般为20 min即可。
二.胃蛋白酶(Pepsin)消化方法
1.配制：0.4％胃蛋白酶，用0.1mol/L的Hcl配制。
2.消化时间：37℃20 min。
3.用途：主要用于细胞间质抗原的显示，如纤粘
大于10%的肿瘤细胞呈现弱 至中度的完整的细胞膜染色
大于10%的肿瘤细胞呈现强 且完整的细胞膜染色
2+
3+
可疑
阳性
切片的观察
阅片忌先用高倍镜。一定要遵循先 低倍后高倍的原则
贴签
注明病理号，所用一抗名称，抗 体稀释度，染色日期
PALM激光显微切割系统简介
PALM激光显微切割系统是由德国PALM 公司研发的一套高级精确的实验室设备。利 用337纳米的紫外激光对显微镜下的生物样 本 (组织、细胞簇、单细胞、染色体及染色 体片断等）进行切割和分离。在病理学、遗 传学和肿瘤学等多个科研领域得到非常广泛 的应用。
内源性HRP的消除
分布: 脑， 脾，中性WBC， 巨噬细胞。 血红蛋白和肌红蛋白含有铁卟啉具有内源 性HRP活性
内源性HRP的消除:
3% H2O2, 5-10’ 0.3% H2O2甲醇溶液, 0.1% HCl 酒精溶液, 0.2% 醋酸甲醇溶液, 0.01% 过碘酸 5-10’, 10’
15-60’ 30’ 30’ 0.1% 硼酸钠
阴性染色的处理
抗原修复方法是否正确 一抗浓度是否过低，适当提高一抗浓度 一抗是否可靠 固定和温度。许多抗体不适合用于福马 林固定的组织，仅适合于冰冻切片
注意： 1. 整个操作过程中注意一定要避免干 片！！！ 2. 免疫组化的精髓是低浓度，长时间！！！
复染
每次复染前需用报纸清洁苏木素染液表面
抗体的保存和配制
抗体的保存
*分装, 低温, 避免反复冻融
*硅化, 防止蛋白吸附
*防止交叉污染和细菌污染
分装
按5μl或10 μl分装，并注明标记(批号、名称、 效价、量)，密封。故入-20℃一-40℃冰箱中保 存备用，一般可保存1—2年。
PBS稀释的抗体不能长时间保存，在4℃可放 1—3天，超过7天效价显著降低。
高压锅免疫组化抗原修复程序
切片放在 染色架上(不宜太密) 高压锅加入0.01M 枸橼酸钠缓冲液3L， 染色放在 枸橼酸钠缓冲液内， 加盖，煮沸，冒气后，加上 限压阀加压1-5’（通常选择2分钟）
晾凉取出
柠核酸盐缓冲液的配制
A液：称取21．01g柠檬酸溶于1000 ml 蒸馏水中。 B液：称取29．41g柠檬酸钠溶于1000 ml蒸馏水中。 工作液：取9mlA液和41 mlB液，加入 450 ml蒸馏水，调PH＝6.0士0.1。
的浮渣，如苏木素已使用时间较长可用滤 纸过滤。复染时间一般1-2分钟即可。
必须进行复染，否则会影响结果的观察。
分色的问题
分色液通常采用0.5-2%的盐酸酒精，分色
时间应根据切片脱色程度而定，但最长不
超过1分钟，如果一分钟分色仍无效果，
建议更换分色液。
复染后的免疫组化切片必须经过分色，否
则会影响阳性结果的判断。
避免反复冻融而使抗体效价降低
即用型抗体
一般4℃保存效价稳定在一年以上．
抗体的配制
根据说明书推荐浓度，进行倍比稀释
自制抗体根据酶标结果，进行倍比稀释。
最好采用抗体稀释液进行稀释，如无抗
体稀释液，可采用PBS进行稀释。
其他准备工作中的注意事项
盖玻片需过酸3-5分钟，流水冲洗1小时以上 盖玻片的储存：浸泡于95-100%的Alc中，随 用随擦，注意冲洗好的盖玻片呈无色或淡蓝色， 如发黄请重新冲洗干净。 用废白衣擦盖玻片效果较好 配制缓冲液 注意桌面和湿盒的情况，如不平可用纸 垫平
乳腺癌Her2染色结果判读
乳腺癌必须满足细胞膜染色形态、强度
及百分比阳性肿瘤细胞（超出10%）阈
值标准，才被视为Her2蛋白过表达阳性。
染色必须定位于细胞膜与圆周（完整染