DNA甲基化综述

分子生物学综述

题目：DNA甲基化的研究方法与技术姓名：

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摘要：DNA 甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。

关键字：表观遗传学；DNA甲基化；甲基化研究方法

1 导言

早在1942年,C.H.Waddington首次提出表观遗传学(epigenetics)的概念,并指出表观遗传与遗传是相对的,它主要研究基因型和表型的关系。几十年后,霍利迪(R. Holiday)针对表观遗传学提出了更新的系统性论断，也就是人们现在比较统一的认识[1]，即在不改变基因组序列的前提下，通过DNA和组蛋白的修饰来调控基因表达，这种修饰以DNA甲基化最为常见。其主要任务是绘制出人类基因组中甲基化可变位点图谱，即不同组织与疾病状态下，5-甲基胞嘧啶出现及其分布频率的图谱，以指导和系统地研究DNA甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因印记、等位基因失活及肿瘤发生中的重要作用[2]。DNA甲基化的研究，逐渐成为新的研究热点。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。让我一一介绍现有的大部分DNA甲基化研究方法，并对其相关特性进行简要分析与总结。

DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。DNA的甲基化是在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的

表达[3]。脊椎动物基因的甲基化状态有三种：持续的低甲基化状态,如管家基因；去甲基化状态,如发育阶段中的一些基因；高度甲基化状态,如女性的一条失活的X染色体[4]。

1.2 DNA 甲基化的生物学作用

1.2.1 DNA 甲基化与遗传印记、胚胎发育

DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育过程中起着极其重要的作用。研究表明胚胎的正常发育得益于基因组DNA适当的甲基化。例如：缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的（Li 等1992年和Okano等1999年）[3]。此外，等位基因的抑制(allelic repression)被印记控制区(imprinting control regions,ICRs)所调控,该区域在双亲中的一个等位基因是甲基化的[4]。印记基因的异常表达可以引发伴有突变和表型缺陷的多种人类疾病。如：脐疝-巨舌-巨大发育综合征(Beckwith-Wiedemann Syndrome, BWS)和Prader-Willi/Angelman综合征等[5]。

甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素,这种变化包括基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高,从而导致基因组的不稳定(如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达)[4]和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的机率提高,例如：胰岛素样生长因子-2（IGF-2）基因印记丢失导致多种肿瘤,如Wilm’s瘤[6]。

1．3 DNA 甲基化的研究方法

近15年来，人们越来越认识到DNA甲基化研究的重要性，开发出一列检测DNA的方法。根据研究目的这些方法分为：基因组整体水平的甲基化检测，特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。根据研究所用处理方法不同可以分为：基于PCR 的甲基化分析方法；基于限制性内切酶的甲基化分析方法；基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法和柱层法等。

2 甲基化研究方法学回顾

2.1 基因组整体水平甲基化分析

2.1.1 高效液相色谱柱（HPLC）及相关方法

HPLC是一种比较传统的方法，能够定量测定基因组整体水平DNA 甲基化水平。它由Kuo等1980年[7]首次报道。过程是将DNA样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算5m C/(5m C+5 C) 的积分面积就得到基因组整体的甲基化水平。这是一种检测DNA甲基化的标准方法。但它需要较精密的仪器。Fraga等2002 年[8]运用高效毛细管电泳法

(HPCE)处理DNA水解产物，以确定5m C 的水平。与HPLC相比，HPCE更加简便、快速、经济。HPLC及HPCE测定基因组整体DNA甲基化水平的敏感性均较高。Oefner 等1992年[9]提出变性高效液相色谱法（DHPLC）用于分析单核苷酸和DNA分子。邓大君等2001[10]将其改进与PCR 联用建立了一种检测甲基化程度的DHPLC分析方法。将重亚硫酸盐处理后的产物进行差异性扩增，由于原甲基化的在重亚硫酸盐处理时仍被保留为胞嘧啶，因此原甲基化的在PCR扩增时，其变性温度也相应上升，使PCR 产物在色谱柱中保留的时间明显延长，这样就可以测定出PCR 产物中甲基化的情况。这种方法的最明显优点是：可用于高通量混合样本检测，能够明确显示目的片段中所有CpG 位点甲基化的情况，但不能对甲基化的CpG 位点进行定位。

2.1.2 SssI 甲基转移酶法[11]

SssI 甲基转移酶能够催化DNA的CpG 位点发生甲基化。3H-S- 腺苷甲硫氨酸(3H-SAM)在SssI 甲基转移酶催化作用使基因组DNA的CpG 位点发生甲基化。通过测定剩余的放射性标记的SAM即可得到原基因组整体甲基化水平，即测到的放射性强度与所测DNA甲基化水平成反比。这种方法的缺点是所使用的SssI 甲基转移酶不稳定，致结果不够精确。

2.1.3 免疫化学法[12]

这种方法是基于单克隆抗体能够与5m C发生特异性反应。应用荧光素标记抗体使之与预先已固定在DEAE膜上的样品DNA特异性结合，对DEAE膜上的荧光素进行扫描得到5m C的水平，其荧光素强度与5m C水