分子生物学之应用与发展

分子生物学之应用与发展

授课教师：李元凤

一、重组DNA (Recombinant DNA)的步骤

1.选择载体(cloning vector)

2.以适当的限制脢(restriction endonuclease)切分载体

3.将欲选殖或增幅之外来DNA与载体接合(ligation)，形成杂合DNA (hybrid

DNA)

4.将杂合DNA送入宿主(host)细胞中，此谓转型(transformation)

5.筛选及鉴定正确之杂合DNA

载体的来源

1.细菌: 细菌体内含有会自行复制之小分子核酸个体

2.噬菌体(bacteriophage)

3.酵母菌(yeast): 酵母菌体内含有会自行复制之核酸个体

重组DNA的来源

1.化学合成

2.大分子DNA以限制脢切成小分子DNA

3.mRNA反转录(reverse transcription)合成cDNA

转型

1.利用细菌转型法将杂合DNA送回细菌体内

2.利用酵母菌转型法将杂合DNA送回酵母菌体内

二、分离与选殖单一基因

1.重组DNA技术可以增幅，或是鉴定未知基因之DNA序列及其功能。若要

选殖基因，则需先建立基因库(genomic library)，筛选各种基因。

2.筛选的方法有数种，最常用的方法之一为南方点墨杂交法(Southern

hybridization)

重组DNA技术的应用

1.重组蛋白质(recombinant protein)之生产

2.基因改造之物种(农作物或微生物)

3.基因治疗(gene therapy)

三、以聚合脢连锁反应(polymerase chain reaction, PCR)来增幅DNA

1.如果DNA序列已知的话，则可用PCR来大量增幅此DNA片段

2.PCR反应需要三种主要成分: 人工合成的DNA引子(primers)，耐热DNA聚

合脢(polymerase)及去氧核糖核甘酸(dATP, dTTP, dCTP, dGTP)

3.PCR以下列三个步骤做循环反应: 变性(denaturation)，黏合(annealing)及

DNA合成(polymerization)反应

四、PCR的应用

1.医学诊断(medical diagnostics): 传染性病源，遗传疾病，癌症

2.法医学(Forensics): DNA fingerprint

五、微点阵(Microarray)及生物晶片(Biochip)

1.将探针(通常是DNA或cDNA)以高密度点阵排列在一小片基质上，即所谓”

晶片”。

2.待测样本与此晶片上的探针做杂交。只需一次实验，DNA/cDNA晶片就能

够将成千上万的基因序列或表现型式记录下来。

六、以分子遗传学筛检海洋性贫血(Thalassemia)

海洋性贫血是一种先天遗传性的血液疾病，人体之正常红血球含有A，A2 及F三种血红素，这些血红素皆由四条血红蛋白链组成，分为α2β2(HbA),α2δ2(HbA2), α2γ2(HbF)。如基因突变则造成某种血红蛋白链合成不足，而其他蛋白链合成过剩，导致造血不足或易溶血之现象，即为贫血。血红蛋白链基因分析的检体可来自血液，羊水或胎盘之绒毛。DNA分析有下列两种方法:

1.南方点墨杂交法(Southern hybridization)

利用血红蛋白链的基因做探针(probe)与待测DNA杂交，经由电泳分离后，以其特殊之型式诊断是否有基因突变。

2.聚合脢连锁反应(polymerase chain reaction, PCR)

以PCR方法大量复制检体内血红蛋白链的基因，利用限制脢片段长度多型性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)或直接作DNA序列分析(sequencing analysis)，检查是否有基因突变。

七、以分子遗传学检定乳癌/卵巢癌之BRCA1 & BRCA2基因变异

大部分的遗传性卵巢癌是由基因BRCA1的变异所引起。近几年之族群研究显示，20%至30%带有BRCA1基因变异的女性，在四十岁之后将有得到卵巢癌的可能性。带有BRCA2基因变异的人则较可能发生早期性乳癌，目前显示近35%的遗传性卵巢癌患者也带有BRCA2基因的变异。BRCA1基因片段先经由聚合脢连锁反应增幅后，以下列三种方法分析其变异(mutation):

●单股DNA结构多型性(SSCP)分析: 不同的DNA序列，电泳分离后之位置

不同，此法可分析DNA是否有变异。

●DNA序列分析(sequencing analysis): 可鉴定DNA之变异位置及种类。

●DNA 晶片(DNA chip)分析: 可同时分析整个BRCA1基因。

参考资料:

1.Becker WM, Kleinsmith LJ, and Hardin J. World of the Cell. The Benjamin

/ Cumming Publishing Company. 2000

2.Brown TA. Genome. BIOS Scientific Publishers, 1999

生物老化与卡路里的关系

授课教师：李元凤

一、细胞老化: 以酵母菌为例

●酵母菌之老化是以母细胞分裂次数计

●限制培养基内之卡路里含量可延长酵母菌20-40%的寿命

●酵母菌寿命延长亦可经由己糖激脢(hexokinase)之失活(己糖激脢促进葡萄

糖之活化)而达成

二、以演化生物学的观点看老化: 果蝇为模式的研究

三、老化指标(Biomarkers of aging) :

●血压，血清葡萄糖，胰岛素，尿酸含量

●葡萄糖代谢及胰岛素调节之能力

●神经纤维委缩

●细胞分裂能力下降

●体质量(BMI)

●肥胖指数

●肺功能，手握力(grip strength)

四、减少50-70%卡路里摄取(caloric restriction)减缓生物细胞老化的速度及老

年疾病的发生

由老鼠实验结果证明，减少30-50%卡路里的摄取