无菌操作ppt课件

4、麦康凯平板
５、ＳＳ琼脂
６、碱性琼脂或ＴＣＢＳ琼脂
７、血液增菌培养基
８、营养肉汤
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细菌的保存方法与无菌操作
• 细菌的保存方法 1 、细菌保存于穿刺培养物中：一般细菌保
存于穿刺培养物可以维持两年。具体方法 如下：用灭菌接种针挑取分散良好的单菌 落，针缓慢穿过琼脂到达瓶底，连续几次， 盖上瓶盖拧紧，做好标记。室温下存放于 暗处。（最好一点可以将瓶盖放松，在适 当温度下培养过夜，再拧紧瓶盖并加封 Parafilm膜，室温或最好在4度避光保存）。
藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不 活跃或相对静止的状态，才能在一定的时 间内使其不发生变异而又保持生活能力。 • 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代 谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏 方法虽多，但都是根据这三个因素而设计 的。 • 保藏方法大致可分为以下几种：
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1．传代培养保藏法 2．液体石蜡覆盖保藏法 3．载体保藏法 4．寄主保藏法 5．冷冻保藏法 6．冷冻干燥保藏法
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3 、室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌 液溅洒时的及时消毒处理。同时还应备有 供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆， 肥皂及自来水源等。
4 、 室内操作台必须每天用消毒剂檫洗，地 面至少一周用消毒剂檫洗一次。
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5 、 对接收的标本，无菌器具，用过的物 品等应明显分开并放在指定位置。同时要 对用过的物品及时进行灭菌处理。
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（一）培养基的组成成分
1、营养物质 尽管不同的细菌对营养的要求 不同，但细菌需要的营养物质应含有氮源、 碳源、无机盐类和生长因子等，常用的营 养物质如下：
（1）蛋白胨
（2）肉浸液
（3）牛肉膏
（4）糖类、醇类
（5）血液
（6）无机盐类
（7）鸡蛋和动物血清 （8）生长因子
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2、凝固物质 制备固体培养基时，需要在液体中加入
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三、器材
细菌、酵母菌，放线菌和霉菌； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌 水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河 沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒 精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿 管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与 100 目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干 燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管， 冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。
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（2）在琼脂平板上生长的细菌培养物：从琼 脂平板表面刮下细菌放入装有2mlLB的无菌 试管内，再加入等量的含有30％灭菌甘油 的LB培养基，振荡使甘油完全分布均匀后， 分装于无菌保存管内，密封，再按前述方 法冰冻保存。这一方法的优点在于可用于 保存在质粒载体上建立的cDNA文库。
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• 菌种保存方法 • 微生物具有容易变异的特性，因此，在保
6.无菌实验室应配备空调设备，保证不因室 温而影响工作。
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(3)基本设备和器具
细菌实验内必须具备的设备和器具有： 用于无菌培养的温箱，二氧化碳培养箱， 厌氧培养设备；显微镜，高压蒸汽灭菌器， 干烤箱，培养基，接种环，接种针等。
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二、培养基 培养基是由人工方法配制而成的，专供
微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。 适宜的培养基不仅可用于细菌的分离化培 养、传代、菌种保存，还可用于研究细菌 的生理、生化特性，是对病原菌分离鉴定 的重要环节和必不可少的手段。
凝固物质。最常用的凝固物质为琼脂，特 殊情况下也可用明胶、卵白蛋白、血清等。
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3、抑制剂和指示剂 在制备培养基时常加入 抑制剂和指示剂，这些并不是细菌生长繁 殖所必需的物质，而是由于选择、鉴定及 判断结果的需要。 （1）抑制剂：抑制剂必须具有选择抑制 作用，在制备营养基时加入一定种类的抑 制剂，目的在于抑制非检出菌的生长，以 利于检出菌的生长。 （2）指示剂：在培养基中加入一定种类 的指示剂，是为了便于观察细菌是否利用 和分解培养基中的糖、醇类。
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2 、细菌保存于含有甘油的培养物中： （1）在液体培养基中生长的细菌培养物：
取0.85ml细菌培养物，加入0.15ml高压灭 菌甘油，振荡培养物使甘油分布均匀，然 后转移到标记好的保存管内，密封，在乙 醇－干冰或液氮中冻结后再转至－70度长 期保存。在复苏时，用灭菌接种针刮取冻 结的培养物表面，然后立即把黏附于接种 针上的细菌划于含适当抗生素的LB琼脂平 板表面，于37度过夜。
3.在无菌室中一般仅限于分装无菌的培 养基及传染性强的细菌的接种，不进行有 菌标本的分离及其他操作。
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4.无菌室内应仅限操作人员进入，而且进入 无菌室应穿隔离衣和专用鞋，操作是戴口 罩，随时保证室内的无菌状态。
5.条件有限的实验室，可用超净工作台代替 无菌实验室进行相应的无菌操作。超净工 作台应选择垂直气流通风方式。
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（二）培养基种类
1、基础培养基 2、营养培养基 3、鉴别培养基 4、选择培养基 5、特殊培养基
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（三）分离培养基的选择
临床标本送往细菌实验室后，应立即接种到适 当的分离培养基上。依据卫生部临床检验中心 推荐，细菌实验室应备有如下分离培养基：
1、血平板
2、巧克力血平板
3、中国蓝平板或伊红美蓝平板
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• 细菌的无菌操作包括： 1.细菌的分离培养与接种 2.细菌的鉴定
• 做到这些首先来看一下需要的条件： 1.细菌实验室 2.培养基
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• 细菌的分离培养与接种 一、基本条件
(1) 细菌实验室 1 、 细菌室必须安装严密的门窗，以防
室内环境受到外界的污染，且室内禁用风 扇，避免细菌的播散。
2 、 细菌室必须安装供空气消毒的紫外灯， 置于操作台面上一米处，每天工作开始前 照射20分钟，对其消毒效国要定期检查， 及时更换失效的灯管。
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• 用于防止微生物进入人体组织或其它无菌范围的 操作技术称为无菌操作。如外科手术需防止细菌 进入伤口。
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在各种生物实验中，为了防止微生物的生长
和繁殖影响实验的进行，也要在无菌的环境下进
行。
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• 无菌操作的要求是:
1 、操作前将界面上的细菌和病毒等微生 物杀灭。 2 、操作过程中是界面与外界隔离，避免 微生物的侵入
6 、 实验室根据当地的室温特点安装空调 机，以适合细菌室工作。同时室内应设置 必要的消防设备。
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(2)无菌实验室 无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操
作的小室，其内部装饰，消毒条件要求更 严格。
1.无菌室应完全封闭，人员出入应有两 道门，其间应有缓冲区。
2.用前以紫外线消毒30分钟，定期用甲 醛熏蒸，彻底消毒。