成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养
原代心肌细胞培养技巧【转】
原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中.我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下：1新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳.2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g・L1,我们使用的为0.8 g・L1.胶原酶最好现用现配.3消化程度的把握新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意1)转速一般控制在60~80 r・min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化.4接种的细胞密度心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个.5细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染.6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU 很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞.7换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外，去血清后可用ITS和0.1 g ・L1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响.8抗污染措施除应注意无菌操作等常规技术方法外，还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道.比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会.(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染.(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率.9培养液pH值适宜的pH范围在7.2~7.4之间，配制及使用培养液时应注意：(1) pH值会在过滤后上升0.1~0.3.(2)培养液中加入血清后pH值会有降低，降低程度与血清品质和含量有关.(3)应及时换液.(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃.这是因为培养液中的CO2会溢出，使培养液pH 上升.每次配好的培养液尽量在2 wk内用完，否则应部分置于－20℃保存，使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3，再次过滤后方可使用.。
成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养(一)解读
成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养(一)【摘要】目的探索成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养方法。
方法取成年Wistar大鼠的后肢肌肉,利用组织块法培养成肌细胞。
并对培养细胞进行形态学研究和细胞鉴定。
结果采用组织块培养成肌细胞的密度可达118/ml, 成肌细胞的分化鉴定显示94%以上的细胞呈骨骼肌特异的肌细胞。
结论利用组织块法成功培养成年大鼠原代骨骼肌成肌细胞,该方法实用性强,所得成肌细胞纯度高,为深入研究心力衰竭骨骼肌成肌细胞自体移植奠定了基础。
【关键词】骨骼肌成肌细胞原代培养大鼠成年【Abstract】 Objective： To explorean experimental method for primary culture of adult rat skeletalmuscle sarcoblast Methods: Muscle of posterior limb from wistar rat were cultured by tissue culture method. The cells were counted and observed by light microscopy combined with identification. Results:The number of skeletalmuscle sarcoblast118per millilitre. skeletalmuscle sarcoblast cell differentiation accredit showed that over 94% cells were stained positive for myogenin.Conclusions: Tissue culture method conveniently permits the purification and Proliferation of myoblast. These esults provide the basis for future studies to assess the ability of the cells to repair heart failure.【Key words】skeletalmuscle sarcoblast primaryculture rat adult心肌细胞是终末化组织，不能再生。
大鼠骨骼肌细胞培养实验指导
大鼠骨骼肌细胞培养骨骼肌是一种横纹肌，通常是通过肌腱固定到骨骼上，其伸缩可以带动骨骼的移动，促进机体运动。
肌细胞呈纤维状，不分支，有明显横纹，核很多，且都位于细胞膜下方。
肌细胞内有许多沿细胞长轴平行排列的细丝状肌原纤维，每一肌原纤维都有相间排列的粗肌丝及细肌丝。
肌纤维收缩并不是肌纤维中肌丝本身的缩短或卷曲，而是细肌丝在粗肌丝之间滑行的结果，肌丝滑行使肌节长度缩短，肌原纤维缩短表现为肌纤维收缩。
体外培养大鼠骨骼肌细胞，为临床肌肉损伤的治疗提供理论依据.一、实验前准备实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。
按照含0.2%的XI胶原酶、0.2%的中性蛋白酶、0.1%的胶原酶进行配制消化液，用0.22微米的PES微孔滤膜进行过滤除菌，置于50毫升离心管中，可直接用于组织消化。
瓶口消毒后室温待用。
取出无菌培养皿，分别作好标记，吸取适量PBS置于相应标记的培养皿中。
无菌条件下，准备好各种大小的眼科剪刀、止血钳、眼科镊子和手术刀。
将断颈处死后浸泡于体积分数为 75%乙醇的SD大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。
二、骨骼肌提取眼科剪刀剪开大鼠后肢皮肤，暴露腿部肌肉，用手术刀小心割取后肢大腿肌肉，同样方法分离另一后肢大腿肌肉。
小心剪取表面无附着膜和脂肪组织的肌肉，置于装有PBS的无菌培养皿中。
吸取适量消化液于相应标记的培养皿中。
将剪取的骨骼肌在无菌PBS浸泡清洗，去除脂肪组织后放置于含消化液的培养皿中，采用眼科剪刀剪碎骨骼肌组织，成1平方毫米不规则碎片。
轻轻摇匀，室温静置消化30分钟收集组织悬液于50毫升离心管中，用消化液反复冲洗培养皿，直至将全部组织块收集到离心管内。
轻轻吹打混匀组织块悬浮液。
配平离心：每分钟1000转，室温离心十分钟。
三、骨骼肌悬液制备及培养离心后小心去除上清，不要吸到底部的组织块沉淀，用含20%胎牛血清的DMEM培养基重悬，轻轻吹打混匀，制成悬液，均匀转移至六孔板中，轻轻摇匀，标记时间后放于37 ℃、体积分数为 5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。
成年大鼠骨骼肌卫星细胞原代培养及鉴定
成年大鼠骨骼肌卫星细胞原代培养及鉴定
王邦茂;陈鑫;张文治;苏心
【期刊名称】《天津医科大学学报》
【年(卷),期】2002(008)004
【摘要】目的:探讨骨骼肌卫星细胞体外培养、鉴定的方法.方法:采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离大鼠骨骼肌卫星细胞,经差速贴壁法纯化后,在培养液中进行培养,观察不同血清浓度下,卫星细胞生长融合的情况.倒置显微镜观察细胞形态,利用结蛋白免疫细胞化学染色方法鉴定肌卫星细胞.结果:细胞经过两步消化和差速贴壁后,纯度在90%以上,在生长培基中,细胞分裂增生;在融合培基中,细胞发生融合,形成肌管.结论:成年大鼠肌卫星细胞在不同的培养条件下可增生或分化.结蛋白免疫细胞化学染色可以早期鉴定骨骼肌卫星细胞.
【总页数】3页(P463-465)
【作者】王邦茂;陈鑫;张文治;苏心
【作者单位】天津医科大学总医院消化科,天津,300052;天津医科大学总医院消化科,天津,300052;天津环湖医院细胞室;天津环湖医院细胞室
【正文语种】中文
【中图分类】Q813.1+1
【相关文献】
1.胎鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化与鉴定 [J], 余慕雪;戴杰民;郭楚怡;卢珍通;杨佩军;庄思齐
2.小鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养和鉴定 [J], 汪茜;王明新;蒲传强
3.壁虎骨骼肌卫星细胞的原代培养与鉴定 [J], 徐青;徐敏;张加吉;李冬辉;刘炎
4.成年大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、鉴定及体外增殖 [J], 李映川;丁强;方祖军
5.新生大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养和鉴定 [J], 邵素霞;张雷;马洪骏
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大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性[1]
![大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/da9f5e78168884868762d68d.png)
上海交通大学学报(医学版)Vol .28No .7Jul .2008Journal of Shanghai J iaotong University (Medical Science )基金项目:上海市科委基金(044119605)(Shanghai Science and Technol ogy Comm ittee Foundati on,044119605)。
作者简介:徐 可(1975-),男,上海人,主治医师,博士;电子信箱:huashanxuke @medmail 。
通讯作者:方祖军,电子信箱:huashanfangzujun @ 。
文章编号: 0258-5898(2008)07-0775-04・论 著・大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性徐 可, 方祖军, 李映川, 郑 捷, 丁 强(复旦大学 华山医院泌尿外科,上海 200040)摘 要:目的建立大鼠骨骼肌卫星细胞分离和纯化方法,并观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖和成肌特性。
方法采用改良两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得高纯度的骨骼肌卫星细胞。
免疫组化染色鉴定体外培养的骨骼肌卫星细胞;MTT 法检测体外培养骨骼肌卫星细胞的生长情况;倒置显微镜观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的分化特性。
结果获取的骨骼肌卫星细胞纯度高,细胞中肌源性标志中间丝蛋白des m in 呈强阳性表达。
体外培养时,骨骼肌卫星细胞有1～2d 的潜伏期,5～6d 进入平台期。
细胞汇合至60%～70%或降低培养基血清浓度时,开始相互融合形成肌管细胞。
结论酶两步消化法和差速贴壁技术是一种简便易行、获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞的方法。
骨骼肌卫星细胞体外培养时无需特殊诱导即可相互融合,形成具有骨骼肌收缩特性的肌管细胞。
关键词:骨骼肌卫星细胞; 培养; 增殖; 分化中图分类号:Q 813.11 文献标志码:ACharacter isti cs of proli fera ti on and m yotube cell forma ti on of ra t skelet a l m uscle s a tellite cells cultured in vitroXU Ke,FANG Zu 2jun,L I Ying 2chuan,ZHENG Jie,D I N G Q iang(D epart m ent of U rology,Huashan Hospital,Fudan U niversity,Shanghai 200040,China )Abstract: O bjective To establish a method of is olation and purificati on of rat skeletal muscle satellite cells,and observe the characteristics of p r oliferati on and my otube cell for mati on of skeletal muscle satellite cells cultured in vitro . M ethods Purified skeletal muscle satellite cells were obtained by i mp r oved t wo 2step enzy matic digesti on method and p re 2p lating technique .I m munohistochem ical staining was emp l oyed t o identify the skeletal muscle satellite cells cultured in vitro .The gr owth of skeletal muscle satellite cells cultured in vitro was exam ined by MTT assay .The differentiati on of skeletal muscle satellite cells was observed by inverted m icr oscopy . Resu lts The skeletal muscle satellite cells with higher purity were obtained and confir med by the high exp ressi on of des m in .W hen cultured in vitro ,the latent phase of skeletal muscle satellite cells was the first t o the second day,and the p latfor m phase was the fifth t o the sixth day .My otube cells gradually for med when cell confluence was more than 60%t o 70%or differential medium with l ower fetal bovine serum was used .Conclusion The co mbinati on of i mp r oved t wo 2step enzy matic digesti on method and p re 2p lating technique serve as an easyand p ractical way to obtain skeletal muscle satellite cells with higher purity .Skeletal muscle satellite cells can for m myotube cells with contraction characteristics without any s pecial induction .Key words: skeletal muscle satellite cell; culture; p r oliferation; differentiation 骨骼肌卫星细胞是存在于骨骼肌肌膜和基底膜之间的一些单个核细胞,被认为是一种具有一定自我更新能力[1]及已发生某种程度定向分化的成体组织内的专能干细胞[2],因此在组织工程和基因治疗领域有着良好的应用前景。
原代细胞分离培养鉴定2(SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞)
原代细胞分离培养鉴定（SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞）目录 3 原代分离——SD 大鼠心肌细胞的分离4 原代分离——SD 大鼠心肌成纤维细胞的分离SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维的分离目的与意义（心肌细胞）心肌细胞体外培养可以为心肌细胞生理、药理及心血管相关研究提供有效、稳定的实验模型，在医学领域有着广泛的应用前景。
体外培养的心肌细胞可保存其形态结构和功能上的某些特点，同时去除了体内外各种限制因素的影响 , 具有精确和重复性好等优点, 可广泛用于心肌结构、病理生理、电生理、药理及毒理、受体及作用机制、心室肌细胞损伤模型及药物保护等的研究。
其次，大鼠动物模型广泛用于心血管系统疾病的基础研究。
目的与意义（心肌成纤维细胞）心脏由心肌细胞和非心肌细胞组成。
非心肌细胞占细胞总数的 70%，其中 90%以上的非心肌细胞由心肌成纤维细胞组成。
近年来，人们逐渐了解到非心肌细胞不仅对心肌细胞具有结构上的支持、保护作用，而且还具有自分泌和旁分泌功能，影响心肌细胞的结构和生理功能，与风湿性心脏病、心肌炎、心肌肥厚、慢性心肌缺血、心肌梗死、炎症等病理状态均密切相关，因此 ,对心肌成纤维细胞的生理学研究成为现代心血管领域研究的一个重点。
心脏 大鼠的心脏位于胸腔内，两侧隔心包与左、右肺紧邻，背侧有气管、支气管和食管。
腹侧借较宽的胸心包韧带和胸骨相连，腹前方与胸腺相贴，后面靠近膈。
C腹侧面B A心肌细胞根据组织学特点、电生理特性分为两类：工作细胞：普通心肌细胞：如心房肌细胞、心室肌细胞，无自律性，主要执行收缩功能；自律细胞：特殊分化的心肌细胞，组成心脏特殊传导系统，如窦房结细胞，收缩功能基本丧失；DESD Rat心脏HE染色F7心肌成纤维细胞 1、 心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts ，CFS)遍布于心肌组织，包绕心肌细胞并连接心肌细 胞间质。
CFS 参与细胞外基质的合成和沉积，与心脏发育、结构、细胞信号系统、物质代 谢等密切相关；它还可与心肌细胞、其它CFS 甚至内皮细胞之间相互接触，影响电机械功 能、细胞因子分泌和血管生成。
成人骨骼肌细胞原代培养
成人骨骼肌细胞原代培养
吕捷;赵春礼;李玉成;张进禄;徐群渊
【期刊名称】《神经解剖学杂志》
【年(卷),期】2001(17)1
【摘要】本研究以获取基因治疗自体移植的载体为目的 ,观察了生长因子对成人骨骼肌卫星细胞增殖的影响。
用手术中取得的成人骨骼肌进行体外组织块培养及酶消化培养 ,用成纤维细胞生长因子及表皮生长因子进行处理 ,作动态观察。
结果证明 ,消化分离出的肌卫星细胞数量极少 ,培养不能成活 ;组织块培养肌卫星细胞的增殖与生长因子的作用有关 ,成纤维细胞生长因子及表皮生长因子处理组的增殖细胞数显著高于对照组。
提示 ,生长因子可促进成年人骨骼肌卫星细胞增殖 ,但与其年龄及部位有一定关系。
【总页数】3页(P75-76)
【关键词】成纤维细胞生长因子;表皮生长因子;卫星细胞;骨骼肌;成人;细胞培养【作者】吕捷;赵春礼;李玉成;张进禄;徐群渊
【作者单位】首都医科大学北京神经科学研究所;北京积水潭医院手外科
【正文语种】中文
【中图分类】R329.2;Q954.6－33
【相关文献】
1.大鼠骨骼肌细胞的原代培养及鉴定 [J], 侯士方;孟馨;相泓冰;王涤非
2.原代培养骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型的建立 [J], 穆颖;季爱玲;刘寒强;许朝晖;王
枫
3.pCDNA3-AADC真核表达载体的构建及其在原代培养骨骼肌细胞中的表达 [J], 刘军;肖颂华;陶恩祥;梁秀龄;邢诒刚
4.成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养 [J], 徐丰
5.原代培养的成人心肌细胞及非肌细胞中心体的免疫荧光染色观察 [J], 易铁敏;陈享
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一种新的成年大鼠成肌细胞体外批量扩增培养方法
一种新的成年大鼠成肌细胞体外批量扩增培养方法刘淑红;吴海涛;陈晓萍;范明【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2009(020)001【摘要】目的:建立快速高效的成年大鼠成肌细胞分离、体外批量扩增培养的实验方法.方法:通过混合酶一步消化法从少量成年骨骼肌样品中分离成肌细胞;采用差速贴壁筛选法纯化分离并批量扩增成肌细胞.结果:混合酶一步消化法需要的时间为2.1±0.52 h,较之于传统方法所需要的6.8±0.67 h,分离细胞所需时阃显著缩短(P＜0.01);采用差速贴壁筛选法纯化分离的成肌细胞myf5/desmin阳性率＞97%,同传统分离扩增方法相比,体外批量扩增培养的这些成肌细胞具有典型的成肌细胞生长特性,在生长液中具有更好的增殖潜能,而在分化液中分化为肌营的特性无显著性差异(P＞0.05).结论:通过采用新建立的成年成肌细胞分离培养和批量扩增的方法,能够快速高效地获取高纯度的成肌细胞.【总页数】3页(P75-77)【作者】刘淑红;吴海涛;陈晓萍;范明【作者单位】军事医学科学院,基础医学研究所,北京,100850;军事医学科学院,基础医学研究所,北京,100850;中国航天员科研训练中心,北京,100193;军事医学科学院,基础医学研究所,北京,100850【正文语种】中文【中图分类】Q813.11【相关文献】1.一种有效分离及在体外扩增成年小鼠精原干细胞的方法 [J], 冉竞超;曹文广;孙红艳;王令;辛颖;张智英2.成年犬骨骼肌成肌细胞培养方法改良及生长特性研究 [J], 窦克非;杨跃进;阮英茆;王清峙;陈曦;陈纪林;高润霖;陈在嘉3.一种适合膜片钳记录的成年大鼠背根神经节细胞培养方法 [J], 刘晓红;曾俊伟;赵延东;阮怀珍4.成年大鼠骨骼肌成肌细胞的培养和鉴定 [J], 杨奕5.一种新的等温体外DNA扩增方法——链替代扩增 [J], 林峰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
正常大鼠原代心肌细胞培养
正常大鼠原代心肌细胞培养一、实验试剂1、培养基：PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement2、冻存液：PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO3、洗涤液：1×PBS（pH 7.4）+ 1% P/S4、染色液：0.4% Trypan Blue5、消化液：PriCells Isolation of Primary Cell Kit6、检测试剂：一抗小鼠抗大鼠α-横纹肌肌动蛋白，二抗FITC标记山羊抗小鼠IgG，乙醇丙酮混合液（1∶1）二、实验器械1、培养皿2、培养瓶3、直剪和眼科剪4、眼科镊5、200目网筛6、玻璃滴管7、烧杯8、15ml离心管三、实验流程取材↓取心肌组织放入D-Hanks中洗涤3次↓剪碎至1mm3 +消化液（PriCells）↓37℃水浴8min，吸弃上层悬液（非心肌细胞）↓余下组织加消化液（PriCells）37℃磁力搅拌10min，60r/min↓上层悬液加消化终止液（PriCells）↓余下组织再加消化液（PriCells）继续消化3-5次↓收集所有混悬液过200目网筛↓收集滤液1000RPM/10min↓去上清，收集沉淀，2ml培养基重悬↓染色计数四、实验操作1、培养瓶预包被。
试验前一天预包培养瓶，置于超静台吹干或45℃烘箱烘干（切记保持无菌），4℃冰箱放置，备用。
2、取材：出生1—3天幼鼠。
3、材料预处理：将获取的心脏放入含有1% P/S的1×PBS（pH 7.4）中，剪去心房，反复洗涤，至心室内无血渍，洗涤液澄清为止。
4、消化：将心室肌用眼科剪剪成1mm3大小组织块，加入消化液10ml，37℃水浴8min后，吸取上层混悬液遗弃；余下组织加入消化液10ml，37℃水浴并用磁力搅拌器搅拌10min；吸取上层混悬液，终止反应；剩余沉淀物再加消化液消化3-5次，直至组织块完全消化。
大鼠心肌细胞原代培养
实验二大鼠CM的体外分离、培养及鉴定1、材料与方法1.1 材料1.1.1实验动物新生3天清洁级Wistar大鼠乳鼠（中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk2005-0001）。
1.1.2主要仪器与试剂 5％CO2恒温培养箱（model TC2323 CO2incubator）；倒置相差显微镜（XD-101 98010）；PH计（mettler toledo320-s）；立式自动电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40BI），上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD型单人双面净化工作台；微量移液枪（法国Gilson）；血球记数板（上海市沪江医疗器材经营部）；HH-6数显恒温水浴锅；离心机（LDZ5-2）；75cm2培养瓶、50ml离心管（美国corning公司）；无菌手术器械；磁力搅拌器；电子天平板（BS1101S 德国）；一次性滤器（22μm, GILSON）；DMEM/F12培养基 (美国GIBCO)；特级胎牛血清（FBS， Hyclone）；青、链霉素（Hyclone）；D-Hank’s液（NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、NaOH、NaHCO3，苯酚红,南京化学试剂厂）；心肌肌钙蛋白T(Santa cruz) ;FITC连接的兔抗山羊IgG(Santa cruz);Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(Sigma)；Triton-X-100(AMRESCO);BrdU(solarbio)。
1.2方法于无菌操作下开胸取出心脏，仔细去除心脏相连大血管和心房组织（留心尖部），于4℃的D-Hank’S液中漂洗3～4次，以去除残存血液，眼科剪将心尖部组织剪成1 mm3碎块后，加入4 ml的0.0625%胰蛋白酶液，于37℃恒温水浴箱中消化3 min，然后弃上清。
于剩余沉淀中加入混合消化液5 ml（0.0625％胰蛋白酶+0.1％Ⅱ型胶原酶），置37℃水浴消化8～10 min，其间振荡2～3次，静置后将上清液移入离心管中，加含10％胎牛血清预冷的DMEM/F12培养液终止消化。
成年大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、鉴定及体外增殖
维 目： １ 咆 前 ！救 荠 述 转 Ｌ 完 成 二 贴 肇细 胞 多 为 血卦 她 ， ¨
预冷 的 Ｐ Ｓ抗生 素 缓冲 液漂 洗 ３次 。将 肌 肉组 织分 Ｂ 离 成若 干 细 小 的肌 束 ，剪 成 １ｍｍａ 右 的肌 肉碎 左
维Ｌ ｂ ｒ ｏ ＇ ｎｍａ ａｄ ｏ ａａ ｖ ｄｃｎ ＃ ａ ｏ ｔ￣ Ａ ｉ ｌ ｎ ｍｐｒｔ ｅＭｅ ｉ ｅ ａ Ｃ ｉ ｉ
肌 卫 星细胞 纯度 在 ９％ 以 上 。细胞 体 外培 养 时在 第 ３ Ｏ 天进 入对 数 生 长期 ，５ ６ｄ － 进入 增 殖平 台期 。
细胞体外培养时无须特殊诱导可以 自 出现成肌定向分化， 发 相互融合形成具有 自发收缩特性的肌 管细胞 。结论 体外培养获取 的骨骼肌卫星细胞数量可以满足组织工程研 究的需要 。 【 关键词 】 骼肌 卫 星 细胞 ： 殖 ： 化 ； 定 骨 增 分 鉴 【 中图分类号】 ３ ２ ＋ 【 Ｒ ２ ． ４ 文献标识码】 【 ７ Ａ 文章编号】 ０４８４ （０ ７０ —０ ００ １０ —４ ８２ ０ ）１ ２—５ ０
Ｐ ＢＳ抗 生 素 缓 冲液 （ ／ 霉 素 ，２ ０Ｕ／ ） 青 链 ０ ｍ１，
Ｉ 型胶 原 酶（ ｉｍａ ，胰 蛋 白酶 （ ｉ ａ ，胎 牛 血清 Ｓｇ ） Ｓｇ ） ｍ
有 一 定的 自我 更新 能力【。在 个 体 的生 命发 育过 程 ２ 】 中 ，骨 骼肌 卫 星细 胞 随着 年 龄 的 增 长 逐渐 减 少 ［。 ３ 】 因此 ，如 何 利用 少 量 的肌 肉组 织 分 离 、培 养 得 到 数 量足够 的骨骼 肌 卫星细 胞 是相 关领 域 细 胞移植 治 疗 的关键 。 研 究 旨在 通 过建 立骨 骼 肌卫 星细 胞 的 本 体外 培 养 、增殖 体 系 ，为 细 胞 移 植 治 疗 泌 尿 外 科 疾病 做 好 技 术 上 的准 备 。
大鼠原代细胞培养步骤
大鼠原代细胞培养步骤
大鼠原代细胞培养是指从活体组织中分离出的未经连续传代的细胞进行培养和繁殖。
以下是大鼠原代细胞培养的一般步骤：
1. 材料准备：准备培养皿、培养基、PBS（磷酸盐缓冲液）、消化酶、抗生素等。
2. 组织采集：使用无菌操作将大鼠体内所需组织（如肝脏、脾脏、肺组织等）取出。
3. 组织处理：将采集到的组织置于PBS中，用显微刀或剪刀切碎组织，使其细胞释放出来。
4. 细胞分散：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）对组织进行消化，使细胞分散开来。
5. 筛选和洗涤：倒入含有培养基的离心管中，并通过滤网筛除组织碎片、未被消化的残余物等。
6. 细胞计数：使用细胞计数板或细胞计数仪对细胞进行计数，以确定合适的细胞密度。
7. 细胞培养：将细胞悬浮液均匀地分配到预先消毒的培养皿中，并加入适量的培养基。
8. 培养条件：将培养皿放置在恒温培养箱中，设置适当的温度、湿度和CO2浓度，提供细胞生长所需的营养物质。
9. 观察和维护：定期观察细胞的形态、增殖情况和细胞污染情况，并进行必要的维护工作，如培养基更换、细胞传代等。
10. 实验应用：根据具体实验目的，将培养好的大鼠原代细胞用
于各种细胞学、分子生物学和药理学实验中。
需要注意的是，大鼠原代细胞具有有限的传代次数，因此在实验中需要及时进行细胞传代，以保证细胞的正常生长和功能。
同时，严格遵守无菌操作规范，确保细胞培养的纯度和质量。
成年大鼠骨骼肌成肌细胞的培养和鉴定
如０ ｆ
， ｌ １００ ，胁 ） ， ５０ １ｃ ６
Ａ ｓ ａ ｔ ｏｂｅｔ ｅ Ｔ ｓ ｂｉ ｎ ｅｐ Ｉ ｅ ｔ ｅ ０ ０ ｒ ａｙ ｃ ｌ ｒ ｏ ｄ ｌ ｒ ｋｌｔ ｂ ｔ ｃ ： ｊｃｊ ｏ ｅｔ ｌ ｈ ａ ｘｅ ｍ ｎａ ｍ ｔ ｄ ｆｒｐｉ ｒ ｕｔ ｅ ｆａｕｔ ａ ｓｅ ａ ｒ Ｖ ａ ｓ ｉ ｌ ｈ ｍ ｕ ｔ ｅｌ
杨 奕
（ 尔滨 医科 大 学 第 二 临床 医学 院 老 年 病 科 ， 龙 江 哈 尔 滨 １０ ０ ） 哈 黑 ５０ １
【 摘要］ 目的 探索成年大鼠骨骼 肌成肌细胞的高浓度培养方法。方 法 以成年同种 系 ｗｉａ 大鼠为研究对 象 ， ｓｒ ｔ
采用两步消化法获取大 鼠骨骼肌卫星细胞 ， 进行体外培养 ， 对获得的细胞进行形态学研究 ， 以免疫组织化 学方法进 行鉴定 。结果 细胞增殖旺盛 ， 分化 良好 ， 可融合成肌 管。免疫细胞 化学染 色显示 ， 骨骼肌卫 星细胞 呈弱 阳性 ， 肌 管呈强 阳性 。结论 两步消化法体外培养的骨骼 肌卫 星细胞具 有 良好 的增 殖与 分化能力 ，用此种 方法可 培养 出 高纯度 的骨骼肌成肌细胞 ， 操作简单 、 污染少 。 ［ 关键 词］ 骨骼肌 ； 成肌细胞 ； 培养 ［ 中图分类号］ ３ Ｒ２ ［ 文献标识 码］ Ａ ［ 文章编号 ］０ ｏ一１０ （０ ９ Ｏ ０ ３ ０ １ｏ ９５ ２ｏ ）２— １７— ３
ｍｙ ｂ ａ ｔ ｎｄ ｏ ｘ ｌｒ ｔ ｅ ｉ ｌｇｃ ｌ ｈ Ｉ ｃｅ ｉｔｃ ０ ｔｅ ｕ ｔ Ｉ ｄ ｅ ｌ．Ｍ ｅ ｈＯ ｓ ０ ｌｓｓ ａ ｔ ｅ ｐ ０ ｅ ｈ ｂ ００ ｉａ ｃ ａｌ ｔｒｓｉｓ ｆ ｈ ｃ ｌｕ － ｃ ｌｓ ａ ｅ ｔ ｄ Ｒａ ｓ ｅｅａ ｔ ｋ ｌｔ ｌ ｍｕｓ ｌ ａｅ ｌ ｅ ｃ ｌｓ ｗｅ ｅ ０ ｔｉ ｅ ｔ ｈ ｗｏ ｓｅ ｉｅ ｔｏ ｓｎ ｙ ｅ Ｉ ｃ ｌ ｇ ｎ ｓ ｎ 巧 ｐ ｉ ｎ ｃｅ ｓ ｔ ｌｉ ｅｌ ｒ ｂ ａｎ ｄ ｗｉｈ ｔ ｅ ｔ －ｔｐ ｄ ｇ ｓｉ ｎ ｕ ｉ ｇ ｔｐ ０ ｌ ｅ ａ ｅ ａ ｄ ｔ ｓｎ ａ ｄ ｔ ａ ｐ ｓ ａ ｅ ０ｌｗｉ ｒｍａ ｙ ｃ ｌｕ ｅ ａ ｓ ｇ ｄ ｆｌ０ ｎｇ ｐ ｉ ｒ ｕ ｔ ｒ ｒ ．Ｔｈ ｅ ｌｓ ０ ｅ ｅｌ ｗｅ ｅ ０ ｎ ｅ ａ ｄ ｂｓ ｒ ｅ ｉｈ ｍｉｒ ｓ ０ ｙ ｒ ｃ ｕ ｔｄ ｎ ０ ｅ ｖ ｄ ｂｙ ｌｇ ｔ ｃ ０ ｃ ｐ
大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定
Abstract
BACKGROUND: Tissue engineering requires a lot of seed cells. Osteoblasts have become an important seed cells in bone tissue engineering. However, there are the difficulties to derive osteoblasts and the different purity of osteoblasts was obtained. OBJECTIVE: To establish the methods of isolated culture and purification of neonatal rat calvarial osteoblasts, and to observe the biological characteristics of the osteoblasts from the skull. METHODS: Osteoblasts of Sprague-Dawley neonatal rats were primarily cultured and proliferated by the second enzyme digestion. Osteoblasts were purified by differential attachment method. Osteoblast proliferation and osteogenic activity were identified by morphology, alkaline phosphatase detection, Alizarin red staining and calcium nodules Von kossa staining, ultrastructure and cell proliferation curve. RESULTS AND CONCLUSION: Primarily cultured calvarial osteoblasts could proliferate by the secondary source of enzyme digestion. The amplification cells showed representative morphological and biological characteristics of osteoblasts. Alkaline phosphatase, Alizarin red staining and calcium nodules Von kossa staining presented positive results. Ultrastructural features appeared as high-differentiated active osteoblasts. Cell proliferation curves showed active cells. Results indicated that calvarial osteoblast of Sprague-Dawley rat has good proliferation and osteogenic activity and can be continuously passaged, with high purity, cell biological characteristics of stability. Calvarial osteoblast is suitable for experiment in vitro.
原代细胞分离培养鉴定4(SD 大鼠骨骼肌卫星细胞、海马神经元细胞)
骨骼肌
由骨胳肌细胞构成的一种肌组
b
织，是横纹肌的一种。大多数
骨胳肌都附着于骨上，是体内
数量最多的组织，在人体中占
体重的40%。
a
骨骼肌卫星细胞
肌卫星细胞指的是骨骼肌中除骨骼肌纤维（肌细胞）外的一种扁平、有突起的细 胞。是位于肌肉纤维膜和基底膜之间的一种单核细胞，是动物出生后的骨骼肌的生长 和再生的主要细胞来源。
IF：细胞核内 MAP2阳性表达（红色荧光）
MAP2在中枢神经系统神经元细胞体和树突特异 性表达，而在AS（星形胶质细胞）及少突胶质细 胞中不表达，是目前公认的神经元特异性标志物。
13
14
早期卫星细胞（分化据-SMA（Red） 均在胞浆中表14达，有强有弱。
8、SD大鼠海马神经元细胞的分离
目的与意义
神经元细胞原代培养是体外研究神经系统疾病的重要手段之一，也是对神经 系统损伤进行细胞分子水平研究的基础。因此，建立良好的神经元细胞体外培养 模型，对研究神经系统疾病，特别是在神经元发育、损伤和修复中的作用尤为重 要。海马是大脑边缘系统的重要组成部分，参与个体学习、记忆及情绪反应等多 种生理功能，与新生儿缺血性脑损伤及多种神经、精神疾病的发生密切相关。
快收缩肌的3-4倍）；
3、采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶二步消化法，卫星细胞位于肌束的浆膜和基底膜之间这种特殊位置使其能抵抗一般
消化酶的作用，Ⅰ型胶原酶只能消化肌束之间的连接，起到分离肌束的作用，而不能分离肌束上的卫星细胞，只有胰蛋白 酶才有此能力；
4、消化时间不宜过长，应控制在30min内，可以提高细胞存活率与贴壁率。采用胰蛋白酶分步消化 法，多次消化，及时收集消化下来的细胞，既可以保证肌组织的充分消化，又可以避免蛋白酶对 已消化下来的细胞的进一步损伤，以提高卫星细胞的活性；
骨骼肌卫星细胞的原代、传代培养和鉴定
骨骼肌卫星细胞的原代、传代培养和鉴定作者：宋策来源：《新教育时代》2015年第08期一、骨骼肌卫星细胞简介骨骼肌卫星细胞最初被人们认为是骨骼肌的定向祖细胞，对骨骼肌的生长和伤后再生起重要作用。
1961年，Mauro在对青蛙的胫前肌做研究时，利用电子显微镜，从肌膜和基底膜之间发现了骨骼肌卫星细胞。
一般情况下，这些细胞处于静止状态，当骨骼肌受损、坏死或负荷过重等应激出现时，卫星细胞就能被激活，开始迁移至受损部位，然后增殖分化形成肌管，从而达到修复肌肉的目的。
二、骨骼肌卫星细胞的原代培养取SD大鼠一只，使用10%浓度水合氯醛进行腹腔注射麻醉，其计量约为0.4ml/100g。
静置大鼠数分钟直至其结膜反射消失，用镊子将其浸泡在75%酒精中消毒2-3分钟后，仰卧位固定，使用采血针吸除血液，提取腓肠肌和比目鱼肌，置入事先消毒并预冷的生理盐水中，然后迅速转移至超净工作台，取冰袋置于操作容器下方。
使用双抗PBS骨骼肌清洗液对获得的肌肉清洗3-4次，快速清除血管、肌筋膜以及脂肪等组织后，将肌肉均匀剪碎至1mm3 大小左右。
再次加入骨骼肌清洗液清洗，静置后弃漂浮物。
将适量的II型胶原酶消化液（0.1%）加入被剪碎的肌肉中，使用37℃磁力搅拌机让肌肉均匀消化约60分钟，转移至离心管，以1000rpm离心10分钟，吸除上清液。
根据沉淀体积加入适量的胰酶细胞消化液，磁力搅拌消化约20分钟，加入细胞种植液终止消化，将此时的肌肉悬液转移至离心管，以1000rpm离心10分钟，吸除上清液，在肌肉沉淀中加入10ml细胞种植液，均匀吹打成细胞悬液。
将细胞悬液依次加入200目、400目的细胞筛中过滤纯化。
均匀吹打滤液并接种于6孔细胞培养板中，置于培养箱（5%CO2，37℃，100%空气湿度）中培养2小时，细胞进行第一次差速贴壁后，将细胞液转移至新的6孔板中继续在培养箱（5%CO2，37℃，100%空气湿度）里培养2小时。
然后将细胞悬液转移至提前用0.001%多聚赖氨酸工作液包被过的6孔板中。
大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养和鉴定
显 示 ，α-actin 蛋 白 和 Desmin 蛋 白 在 两 种 细 胞 胞 浆 中 均 有 分 布 。 结 论 用 组 织 块 培 养 法 获 取 的 骨 骼 肌 卫 星 细 胞 具 有 良
好的增殖与分化能力，用此种方法可培养出高纯度的骨骼肌卫星细胞。
关 键 词 ：骨 骼 肌 卫 星 细 胞 ；组 织 块 培 养 技 术 ；Desmin 蛋 白
学 研 究 及 采 用 免 疫 荧 光 和 免 疫 组 织 化 学 法 测 定 两 种 细 胞 α-actin 蛋 白 和 Desmin 蛋 白 的 表 达 及 分 布 ，从 而 对 骨 骼 肌 卫
星细胞进行鉴定。 结果 通过组织块培养法获取的细胞增殖旺盛，分化良好。 免疫细胞荧光和免疫组织化学实验结果
骨骼肌卫星细胞是机体骨骼肌组织中未分化的 细胞，位于骨骼肌细胞基底膜与肌纤维浆膜之间，是 源于胚胎中胚层的干细胞［1］。 在 正 常 状 态 下 处 于 静 止期， 受外界刺激时或在应激状态下可以分裂、增 生，并可融合成多核细胞及形成新的肌纤维。研究表 明，骨骼肌受创伤后及肌纤维再生和修复过程中卫 星 细 胞 发 挥 了 重 要 的 生 物 学 作 用 ［2］。
中识码： A
文 章 编 号 ：1672-3619 （2011）04-0395-03
Cultivation and identification of rat skeletal muscle satellite cells
CHEN Si-fan1，2，LI Wen-xue1，CHEN Jian-ling1，2，YANG Guang-yu1，LIU Hua-zhang1，ZHU Wei1 （1．Guangzhou Center for Disease Control and Prevention， Guangdong，Guangzhou 510080； 2．School of Public Health，Sun Yat-sen University， Guangdong，Guangzhou 510080，China）
成年大鼠骨骼肌干细胞的纯化与培养
成年大鼠骨骼肌干细胞的纯化与培养姚启盛;叶章群;陈从波;王小康;王卫民;陈立新【期刊名称】《临床泌尿外科杂志》【年(卷),期】2006(21)1【摘要】目的:建立一种骨骼肌干细胞的纯化及培养方法。
方法:取成年雌性SD大鼠前肢肱三头肌,用胶原酶和dispase进行消化,200目的筛网滤过。
采用差速贴壁法纯化骨骼肌干细胞,用含20%胎牛血清的HamsF10培养基进行培养。
以α-骨骼肌肌动蛋白免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。
结果:成功地分离培养了成年大白鼠的骨骼肌干细胞。
结论:采用差速贴壁的方法可以成功分离、纯化骨骼肌干细胞,为未来以自体骨骼肌干细胞注射治疗压力性尿失禁打下了基础。
【总页数】3页(P67-69)【关键词】大鼠;骨骼肌干细胞;纯化;培养【作者】姚启盛;叶章群;陈从波;王小康;王卫民;陈立新【作者单位】华中科技大学同济医院泌尿外科;郧阳医学院附属太和医院泌尿外科;郧阳医学院附属太和医院分子生物研究中心【正文语种】中文【中图分类】R322.7【相关文献】1.成年大鼠骨骼肌干细胞的制备与新型培养方法 [J], 黄郁凯;李晓红;潘宇;林秋雄;朱杰宁;江雪燕;叶力通;余细勇2.成年犬骨骼肌成肌细胞的培养纯化、鉴定及生长特性的研究 [J], 汪进益;范慧敏;刘中民;马亮;丁一;李杨3.成年大鼠骨骼肌肌源性干细胞向神经细胞的分化 [J], 李进;洪光祥;康皓;陈振兵;陈燕花;李涛4.成年大鼠骨骼肌干细胞纯化、培养及移植的初步实验研究 [J], 陈从波;黄铁柱;姚启盛5.Dispase在成年鼠骨骼肌干细胞纯化中的价值 [J], 姚启盛;叶章群;陈丛波;王小康;王卫民;陈立新因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
成年大鼠骨骼肌干细胞纯化、培养及移植的初步实验研究
成年大鼠骨骼肌干细胞纯化、培养及移植的初步实验研究陈从波;黄铁柱;姚启盛【期刊名称】《生物医学工程与临床》【年(卷),期】2007(11)3【摘要】目的探讨成年大鼠骨骼肌干细胞纯化与培养方法及肌干细胞移植在肌疾病治疗中的价值。
方法采用混合酶消化及反复差速贴壁法分离、纯化培养SD大鼠骨骼肌干细胞,然后用携带lac-Z基因的腺病毒载体转染肌干细胞,待转染成功后将携带lac-Z基因的骨骼肌干细胞注射于自体和同种异体的膀胱颈及后尿道周围,分别于注射后5、15d,处死大鼠取出膀胱颈及后尿道,行组织学检查及X-gal染色。
结果成功地分离、培养了成年大白鼠的骨骼肌干细胞。
注射部位无明显炎症改变,经X-gal染色显示自体细胞移植5d及15d均可见大量的蓝染细胞,提示移植细胞在体内成活,异体移植各时间点未见蓝染细胞。
结论采用混合酶消化及差速贴壁的方法可以成功纯化骨骼肌干细胞;自体骨骼肌干细胞移植在体内可以存活,有可能成为治疗肌疾病的有效方法,而异体移植不能存活。
【总页数】4页(P164-166)【关键词】骨骼肌干细胞;移植治疗;肌疾病;lac—Z基因【作者】陈从波;黄铁柱;姚启盛【作者单位】武汉大学医学院;郧阳医学院解剖教研室;郧阳医学院附属十堰市太和医院泌尿外科【正文语种】中文【中图分类】R329.28【相关文献】1.成年大鼠骨骼肌干细胞的制备与新型培养方法 [J], 黄郁凯;李晓红;潘宇;林秋雄;朱杰宁;江雪燕;叶力通;余细勇2.新生和成年大鼠雪旺细胞培养、纯化的实验研究 [J], 潘良春;尹宗生;王伟;胡勇;高荣保;王明丽3.人胎盘源间充质样干细胞移植治疗大鼠脑出血的初步实验研究 [J], 薛群;华军;卢俊;董万利;吴玉明;倪健强;朱一蓓;方琪;王明元;陈永井;方振羊;张学光4.大鼠骨髓基质干细胞体外分离、纯化、培养的实验研究 [J], 何玉祥;孙岩;刘振川;刘洋;周华;王茂华;袁海;金星;吴学君;5.成年大鼠骨骼肌干细胞的纯化与培养 [J], 姚启盛;叶章群;陈从波;王小康;王卫民;陈立新因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养
发表时间：2010-05-14T14:28:07.827Z 来源：《中外健康文摘》2009年第36期供稿作者：徐丰
[导读] 心肌细胞是终末化组织，不能再生。
心梗后坏死的心肌必然被纤维组织代替。
徐丰 (黑龙江省第五医院 161000）
【中图分类号】R 714 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085(2009)36-0161-02
【摘要】目的探索成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养方法。
方法取成年Wistar大鼠的后肢肌肉,利用组织块法培养成肌细胞。
并对培养细胞进行形态学研究和细胞鉴定。
结果采用组织块培养成肌细胞的密度可达118/ml, 成肌细胞的分化鉴定显示94%以上的细胞呈骨骼肌特异的肌细胞。
结论利用组织块法成功培养成年大鼠原代骨骼肌成肌细胞,该方法实用性强,所得成肌细胞纯度高,为深入研究心力衰竭骨骼肌成肌细胞自体移植奠定了基础。
【关键词】骨骼肌成肌细胞原代培养大鼠成年
【Abstract】 Objective： To explorean experimental method for primary culture of adult rat skeletalmuscle sarcoblast Methods: Muscle of posterior limb from wistar rat were cultured by tissue culture method. The cells were counted and observed by light microscopy combined with identification. Results:The number of skeletalmuscle sarcoblast 118per millilitre. skeletalmuscle sarcoblast cell differentiation accredit showed that over 94% cells were stained positive for myogenin.Conclusions: Tissue culture method conveniently permits the purification and Proliferation of myoblast. These esults provide the basis for future studies to assess the ability of the cells to repair heart failure.
【Key words】skeletalmuscle sarcoblast primaryculture rat adult
心肌细胞是终末化组织，不能再生。
心梗后坏死的心肌必然被纤维组织代替。
当前内外科的治疗均不能修复及逆转已经坏死的心肌，坏死的部分经过心脏重构，最终发展为缺血性心力衰竭，其5年生存率不到50％，缺血性心衰的病理生理有多种因素参与，但丧失心肌细胞是主要原因。
如何攻克缺血性心力衰竭已成为本世纪的最大课题。
目前治疗终末期心力衰竭的唯一有效方法是心脏移植，而心脏移植受到器官来源、经费、免疫排斥反应方面的限制，能够接受心脏移植手术的病人目前每年只能达到近百例，目前细胞移植已经成为治疗缺血性心衰最有前景的方法之一。
心肌细胞移植是向心肌梗死疤痕区注入某些肌源性未成熟或未分化的细胞成分，这些细胞在心肌的微环境下能够成熟，向心肌细胞转化，改善心功能。
骨骼肌成肌细胞是首先应用于临床试验、并在临床试验中研究最多的移植细胞。
越来越多的证据表明，相比较间质干细胞而言，骨骼肌成肌细胞可能是更为理想的干细胞移植对象，其原因有以下几点：①骨骼肌成肌细胞对缺血、缺氧的环境更为耐受；②骨骼肌成肌细胞可以确定的转化成横纹肌特性的肌细胞；③骨骼肌成肌细胞容易提取、分立、培养和增殖[1,2]。
1 材料与方法
选用成年Wistar大鼠购于哈医大实验中心，低糖DMEM培养基、ham，sF-10培养液、低糖DMEM培养基、小牛血清gaba公司产品骨骼肌成肌细胞获取、分离、培养及标记选用成年Wistar大鼠,麻醉下切取胫前肌1g,研磨肌肉组织,酶解15分钟(胶原酶IA，1.5mg/ml,37'C)，继之放PBS—EDTA(0.25％)中37℃下20分钟，置入100一um细胞过滤器中，过滤后离心,细胞置于F-10培养液中,1％青链霉素(10000单位/ml)，放入细胞培养箱中培养(37℃,5％co2)。
3d换液一次,待细胞长满瓶底即可传代。
2 结果
成肌细胞的培养采用组织块培养法贴块2d后即可见有细胞从肌小粒边缘爬出,细胞呈梭形,胞浆透明。
1周后细胞可长满瓶底的60%～70%,其数目可达105,此时细胞可呈多角形,充分伸展,部分细胞密集区可见细胞呈向心性生长,相互间排列整齐,类似骨骼肌的纵切面。
成肌细胞的分化鉴定换用诱导分化液后细胞可在3d内分化,融合交织形成肌纤维,可观察到收缩现象;并且部分细胞分化形成细长的肌管,高倍镜下可见多个核及核分裂象。
这些现象为成肌细胞所特有,可以作为简便的鉴定方法。
3 讨论
目前最大的动物和临床研究资料是使用骨骼肌成肌细胞，它存在于成人骨骼肌中，在创伤后可增生，重构肌肉。
近10年来有诸多关于在鼠与绵羊将骨骼肌成肌细胞成功移植到心肌的研究报告。
它们显示可将自体骨骼肌成肌细胞注射到受损心肌内，形成横纹肌。
2000年6月15日成肌细胞移植首先应用于临床[3]。
1期临床试验的成功证实了此方法的可行性[4]。
然而在试验中唯一不利的事件是移植后心律失常的发生。
然而在试验中唯一不利的事件是移植后心律失常的发生，在早期（术后3周内）发生在4例患者中，除一例患者耐受。
发生原因可能由于骨骼肌成肌细胞不能形成心肌细胞间的间隙连结，它们不能与心肌本身的细胞等速进行电传导，从而易导致恶性心律失常。
但FormigliL等的研究表明，骨骼肌成肌细胞缺血心肌移植后骨骼肌成肌细胞可以和心肌细胞之间形成通道连接，松弛素可以增强这种细胞间连接[5]。
我们采用组织块法成功培养了成年大鼠的成肌细胞,组织块培养法实用、可行,耗材少、成本低,可获得含量超过90%以上的成肌细胞。
采用此方法培养成肌细胞,短期内获得大量成肌细胞成为可能,也为我们进一步开展成肌细胞心肌内自体移植创造了条件。
我们的研究结果意图在于贴近临床,为心力衰竭患者采用自体成肌细胞治疗提供实验依据,也为心脏疾病的基因治疗奠定基础。
参考文献
[1] Conconi MT，De Coppi P，Bellini S。
Homologous mustle ace]1Ular matriK seeded withautologous myoblasts aS a tissue—engineering approach to abdominal wall—defectrepair．Biomaterials．2005 May：26(15)：2567—74．
[2] Rigatelli G，Rossini K，Vindigni V．New perspectives in the treatment Of damagedmyocardium using autologous skeleta.
[3] Menasche P,Hagege AA,Scorsin M,et al.Myoblast transplantation for heat ncet.2001,357:279-280.
[4] Menasche P,Hagege AA,Vilquin JT,et,al.Autologous skeletal myoblast transplantation ror severe post-infarction left ventricular dysfunction.J Am Coll Cardiol,2003,41;1078-83
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