细胞衰老理论

1总结归纳法
总结归纳法就是将一些较多而杂的知识点总结归纳成简短的几个字词或几句话。

例如，“三
羧酸循环”这节内容非常重要，往往是该课程各种类型考试的重点，如果要将该循环中所参与的反应物质、酶以及各步反应式都死记硬背下来，那是件非常枯燥的事情。

但是，将其总结归纳成四句话即“一次底物水平磷酸化，二次脱羧，三次不可逆反应及其关键酶，四次脱氢”后，几乎涵盖了该节所有重要知识点而且不易忘记。

又如，在记忆“酶-底物结合的诱导契合假说”的概念时，可用5个“相互”归纳即“酶和底物经过相互接近、相互诱导、相互变形、相互适应进而相互结合”。

还有，如针对“金属辅助因子的作用”这一知识点，可用12个字总结归纳：成中心、架桥梁、稳构象、减斥力。

这样记忆起来简单明了，一气呵成。

六伴穷光蛋：硫、半、光、蛋→半胱、光、蛋（甲硫）氨酸→含硫氨基酸
酸谷天出门：酸、谷、天→谷氨酸、天门冬氨酸→酸性氨基酸
死猪肝色脸：丝、组、甘、色→丝、组、甘、色氨酸→一碳单位来源的氨基酸
只携一两钱：支、缬、异亮、亮→缬、异亮、亮氨酸→支链氨基酸
一本落色书：异、苯、酪、色、苏→异亮、苯丙、酪、色、苏氨酸→生糖兼生酮
拣来精读之：碱、赖、精、组→赖氨酸、精氨酸、组氨酸→碱性氨基酸
芳香老本色：芳香、酪、苯、色→酪、苯丙、色氨酸→芳香族氨基酸
不抢甘肃来：脯、羟、甘、苏、赖→脯、羟脯、甘、苏、赖氨酸→不参与转氨基的氨基酸
细胞衰老(cellular aging，cell senescence)
衰老（aging，senescence，senility）又称老化，通常指生物发育成熟后，在正常情况下随着年龄的增加，机能减退，内环境稳定性下降，结构中心组分退行性变化，趋向死亡的不可逆的现象。

衰老和死亡是生命的基本现象，衰老过程发生在生物界的整体水平、种群水平、个体水平、细胞水平以及分子水平等不同的层次。

生命要不断的更新，种族要不断的繁衍。

而这种过程就是在生与死的矛盾中进行的。

至少从细胞水平来看，死亡是不可避免的。

第一节细胞衰老
一、人体细胞的动态分类
人体的自然寿命约120岁，而组成人体组织的细胞寿命有显著差异，根据细胞的增殖能力，分化程度，生存时间，可将人体的组织细胞分为4类：①更新组织：执行某种功能的特化细胞，经过一定时间后衰老死亡，由新细胞分化成熟补充，如上皮细胞、血细胞，构成更新组织的细胞可分为３类：a干细胞，能进行增殖又能进入分化过程。

b过渡细胞，来自干细胞，是能伴随细胞分裂趋向成熟的中间细胞，c成熟细胞，不再分裂，经过一段时间后衰老和死亡。

②稳定组织细胞，是分化程度较高的组织细胞，功能专一，正常情况下没有明显的衰老现象，细胞分裂少见，但在某些细胞受到破坏丧失时，其余细胞也能进行分裂，以补充失去的细胞，如肝、肾细胞。

③恒久组织细胞，属高度分化的细胞，个体一生中没有细胞更替，破坏或丧失后不能由这类细胞分裂来补充。

如神经细胞，骨骼细胞和心肌细胞。

④可耗尽组织细胞，如人类的卵巢实质细胞，在一生中逐渐消耗，而不能得到补充，最后消
耗殆尽。

二、细胞衰老的特征
（一）形态变化
衰老细胞的形态变化主要表现在细胞皱缩，膜通透性、脆性增加，核膜内折，细胞器数量特别是线粒体数量减少，胞内出现脂褐素等异常物质沉积，最终出现细胞凋亡或坏死。

总体来说老化细胞的各种结构呈退行性变化（表15-1）。

（二）分子水平的变化
衰老细胞会出现脂类、蛋白质和DNA等细胞成分损伤，细胞代谢能力降低，主要表现在以下方面：
DNA：复制与转录受到抑制，但也有个别基因会异常激活，端粒DNA丢失，线粒体DNA特异性缺失，DNA氧化、断裂、缺失和交联，甲基化程度降低。

RNA：mRNA和tRNA含量降低。

蛋白质：含成下降，细胞内蛋白质发生糖基化、氨甲酰化、脱氨基等修饰反应，导致蛋白质稳定性、抗原性，可消化性下降，自由基使蛋白质肽断裂，交联而变性。

氨基酸由左旋变为右旋。

酶分子：活性中心被氧化，金属离子Ca2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+等丢失，酶分子的二级结构，溶解度，等电点发生改变，总的效应是酶失活。

脂类：不饱和脂肪酸被氧化，引起膜脂之间或与脂蛋白之间交联，膜的流动性降低。

三、细胞衰老的机理
关于衰老的机理具有许多不同的学说，概括起来主要有差错学派（Error theories）和遗传学派（Genetic /Programmed theories）两大类，前者强调衰老是由于细胞中的各种错误积累引起的，后者强调衰老是遗传决定的自然演进过程。

其实，现在看来两者是相互统一的。

（一）差错学派
细胞衰老是各种细胞成分在受到内外环境的损伤作用后，因缺乏完善的修复，使“差错”积累，导致细胞衰老。

根据对导致“差错”的主要因子和主导因子的认识不同，可分为不同的学说，这些学说各有实验证据。

1．代谢废物积累（waste product accumulation）
细胞代谢产物积累至一定量后会危害细胞，引起衰老，哺乳动物脂褐质的沉积是一个典型的例子，脂褐质是一些长寿命的蛋白质和DNA、脂类共价缩合形成的巨交联物，次级溶酶体是形成脂褐质的场所，由于脂褐质结构致密，不能被彻底水解，又不能排出细胞，结果在细胞内沉积增多，阻碍细胞的物质交流和信号传递，最后导致细胞衰老，如老年性痴呆（AD）就是由β-淀粉样蛋白沉积引起的，因此β-AP可做为AD的鉴定指标。

2．大分子交联（cross linking）
过量的大分子交联是衰老的一个主要因素，如DNA交联和胶原胶联均可损害其功能，引起衰老。

在临床方面胶原交联和动脉硬化、微血管病变有密切关系。

3．自由基学说（free radical theories）
自由基是一类瞬时形成的含不成对电子的原子或功能基团，普遍存在于生物系统。

主要包括：氧自由基（如羟自由基·OH）、氢自由基（·H）、碳自由基、脂自由基等，其中·OH 的化学性质最活泼。

人体内自由基的产生有两方面：一是环境中的高温、辐射、光解、化学物质等引起的外源性自由基；二是体内各种代谢反应产生的内源性自由基。

内源性自由基是人体自由基的主要来源，其产生的主要途径有：①由线粒体呼吸链电子泄漏产生；②由经过氧化物酶体的多功能氧化酶（MFO）等催化底物羟化产生。

此外，机体血红蛋白、肌红蛋白中还可通过非酶促反应产生自由基。

自由基含有未配对电子，具有高度反应活性，可引发链式自由基反应，引起DNA、蛋白质和脂类，尤其是多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty Acids，PUFA）等大分子物质变性和交联，损伤DNA、生物膜、重要的结构蛋白和功能蛋白，从而引起衰老各种现象的发生。

实验表明DNA中OH8dG随着年龄的增加而增加。

OH8dG完全失去碱基配对特异性，不仅OH8dG被错读，与之相邻的胞嘧啶也被错误复制。

正常细胞内存在清除自由基的防御系统，包括酶系统和非酶系统，前者如：超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX），非酶系统有维生素E、醌类物质等电子受体。

Orr WC和Sohal RS（1994），将铜锌超氧化物岐化酶（copper-zinc superoxide dismutase）基因导入果蝇，使转基因株具有3个拷贝的SOD基因，其寿命比野生型延长1/3。

这个实验为衰老的自由基学说提供了有力的证据。

4．线粒体DNA突变（mitochondrial DNA mutation）
在线粒体氧化磷酸化生成ATP的过程中，大约有1-4%氧转化为氧自由基，也叫活性氧（reactive oxygen species，ROS)，因此线粒体是自由基浓度最高的细胞器。

mtDNA裸露
于基质，缺乏结合蛋白的保护，最易受自由基伤害，而催化mtDNA复制的DNA聚合酶γ不具有校正功能，复制错误频率高，同时缺乏有效的修复酶，故mtDNA最容易发生突变。

mtDNA突变使呼吸链功能受损，进一步引起自由基堆积，如此反复循环。

衰老个体细胞中mtDNA缺失表现明显，并随着年龄的增加而增加，许多研究认为mtDNA缺失与衰老及伴随的老年衰退性疾病有密切关系。

人类的脑、心、骨骼肌的氧负荷（oxidative stress）最大，因而是最容易衰老的组织。

研究表明，限制热量（caloric restriction）摄入能明显延长小鼠的寿命。

5．体细胞突变与DNA修复（somatic mutation and DNA repair）
外源的理化因子，内源的自由基本均可损伤DNA，导致体细胞突变。

如辐射可以导致年轻的哺乳动物出现衰老的症状，这与个体正常衰老非常相似。

正常机体内存在DNA的修复机制，可使损伤的DNA得到修复，但是随着年龄的增加，这种修复能力下降，导致DNA 的错误累积，最终细胞衰老死亡。

DNA的修复并不均一，转录活跃基因被优先修复，而在同一基因中转录区被优先修复，而彻底的修复仅发生在细胞分裂的DNA复制时期，这就是干细胞能永保青春的原因。

6．重复基因失活
真核生物基因组DNA重复序列不仅增加基因信息量，而且也是使基因信息免遭机遇性分子损害的一种方式。

主要基因的选择性重复是基因组的保护性机制，也可能是决定细胞衰老速度的一个因素，重复基因的一个拷贝受损或选择关闭后，其它拷贝被激活，直到最后一份拷贝用完，细胞因缺少某种重要产物而衰亡。

实验证明小鼠肝细胞重复基因的转录灵敏度随年龄而逐渐降低，哺乳动物rRNA基因数随年龄而减少。

（二）遗传学派
认为衰老是遗传决定的自然演进过程，一切细胞均有内在的预定程序决定其寿命，而细胞寿命又决定种属寿命的差异，外部因素只能使细胞寿命在限定范围内变动1．程序性衰老（programmed senescence）
程序性衰老理论认为，生物的生长、发育、衰老和死亡都由基因程序控制的，衰老实际上是某些基因依次开启或关闭的结果。

例如在小鼠肝中，胚胎早期表达的胞质丙氨酸转氨酶（cytosolic alanine aminotransferase，cAAT）为A型，随后停止表达，但是在衰老时则表达B型cAAT，其它类似的衰老标志物（senescence markers）也有报道，如肝脏中的衰老标志蛋白2（senescence marker protein 2）也是在老年期表达。

此外程序性学派还认为衰老还与神经内分泌系统退行性变化以及免疫系统的程序性衰老有关。

2．复制性衰老（replicative senescence）
L.Hayflick （1961）报道，人的成纤维细胞在体外培养时增殖次数是有限的。

后来许多实验证明，正常的动物细胞无论是在体内生长还是在体外培养，其分裂次数总存在一个“极
极值”。

此值被称为“Hayflick”极限，亦称最大分裂次数。

如人胚成纤维细胞在体外培养时只能增殖60-70代。

细胞增殖次数与端粒DNA长度有关。

Harley等1991发现体细胞染色体的端粒DNA 会随细胞分裂次数增加而不断缩短。

细胞DNA每复制一次端粒就缩短一段，当缩短到一定程度至Hayflick点时，可能会启动DNA损伤检测点（DNA damage checkpoint），激活p53，引起p21表达（参见第十三章第四节），导致不可逆地退出细胞周期，走向衰亡。

资料表明人的成纤维细胞端粒每年缩短14-18bp，可见染色体的端粒有细胞分裂计数器的功能，能记忆细胞分裂的次数。

端粒的长度
还与端粒酶
（telomerase）的活性有关，端粒酶是一种反转录酶，能以自身的RNA为模板合成端粒DNA，在精原细胞、干细胞和肿瘤细胞（如Hela细胞）中有较高的端粒酶活性，而正常体细胞中端粒酶的活性很低，呈抑制状态。

3．长寿基因（longevity genes）
统计学资料表明，子女的寿命与双亲的寿命有关，各种动物都有相当恒定的平均寿命和最高寿命，成人早衰症（Werner's syndrome，图15-1）病人平均39岁时出现衰老，47岁左右生命结束，患婴幼儿早衰症（Hutchinson-Gilford syndrome，图15-2）的小孩在1岁时出现明显的衰老，12-18岁即过早夭折。

由此来看物种的寿命主要取决于遗传物质，DNA 链上可能存在一些“长寿基因”或“衰老基因”来决定个体的寿限。

图15-1 一个37岁的成人早衰症患者引自 on 研究表明当细胞衰老时，一些衰老相关基因（SAG）表达特别活跃，其表达水平大大
高于年轻细胞，已在人1号染色体、4号染色体及X染色体上发现SAG。

用线虫的研究表明，基因确可影响衰老及寿限，Caenorhabditis elegans的平均寿命仅3.5天，该虫age-1 单基因突变，可提高平均寿命65%，提高最大寿命110%，age-1突变型有较强的抗氧化酶活性，对H2O2、农药、紫外线和高温的耐受性均高于野生型。

对早老综合症的研究发现体内解旋酶存在突变，该酶基因位于8号染色体短臂，称为WRN基因。

对AD的研究发现，至少与4个基因的突变有关，其中淀粉样蛋白前体基因（APP）的突变，导致基因产物β淀粉蛋白易于在脑组织中沉积，引起AD。

双胞胎，指胎生动物一次怀胎生下两个个体的情况。

双胞胎一般可分为同卵双胞胎和异卵双胞胎两类。

同卵双胞胎指两个胎儿由一个受精卵发育而成，异卵双胞胎是由不同的受精卵发育而成的。

全世界双胞胎平均出生率为1∶89。

通常情况下，妇女每月排卵1次，有时因某种原因同时排出两个卵子并同时受精，就产生了两个不同的受精卵。

这两个受精卵各有自己的一套胎盘，相互间没有什么联系，叫做异卵双胎，产妇将生出两个婴儿。

他们比较相似，而且往往是异性的。

这种异卵双胎比较多见，并且与遗传基因、孕妇的年龄以及孕妇的生产次数有关。

同卵双胎的形成则与上不同，是一个精子与一个卵子结合产生的一个受精卵。

这个受精卵一分为二，形成两个胚胎。

由于他们出自同一个受精卵，接受完全一样的染色体和基因物质，因此他们性别相同，且就像一个模子里出来的，有时甚至连自己的父母都难以分辨。

这种相似不仅外形相似，而且血型、智力、甚至某些生理特征，对疾病的易感性等都很一致。

我们常说的连体婴儿，实际上就是这种单卵双胎，只是由于当初受精卵分裂时的不完全造成了某些部位相连。

双胎妊娠有家族遗传倾向，随母系遗传。

有研究表明，如果孕妇本人是双胎之一，她生双胎的机率为1/58；若孕妇的父亲或母亲是双胎，她生双胎的机率也很高。

另有研究报道，双胎的母亲有4％为双胎，而双胎的父亲仅有1.7％是双胎。

基因枪的使用操作方法
1。

材料准备
在9cm2培养皿上铺一薄层培养基，把材料(一般用未成熟胚、成熟胚、小愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等)平铺于培养皿中心，直径在3cm范围内。

2．金粉的处理
取60mg金粉或钨粉置于离心管中，加入lml无水乙醇，充分振荡3min，以9615g离心1rain，去上清，再加入lml无菌水充分混匀后，以9615g离心，重复上述步骤3次。

最后，将金粉悬浮于lml无菌蒸馏水中，置4‘C或室温下储存。

3．DNA的处理
取50tA金粉悬浮液，依次加入5rd的质粒DNA(1．0／lg～1)溶液、50／／l 0．1mol／L亚精胺(所用的溶液经无菌消毒)，振荡3rain后，在室温下放置10min，以9615g离心10s，弃去上清液；加入250~1无水乙醇，振荡后以9615g离心10s，弃上清液。

沉淀重新悬浮于60／1l无水乙醇中，可供5枪(每枪10~1)
使用。

4．基因枪的操作
基因枪的所有操作均在无菌条件下进行，具体步骤如下：
1)先用70％乙醇对基因枪表面及样品室进行消毒。

同时，用70％乙醇将阻挡网和可裂圆片，微弹载体及其固定器、固定工具浸泡15min后，放在超净台上晾干。

可裂膜片、固定盖、微弹载体发射装置可用70％乙醇进行表面灭菌，吹干。

2)将微粒载片嵌入固定环中，取DNA及金粉的混合物加于微粒载片中心，干燥lmin左右。

3)安装可裂膜于其托座上，顺时针拧到气体加速器上。

4)将空间环、阻挡网、阻挡网托座、微粒载片及固定环(带有微粒的面朝下)安装好，旋紧盖子，插入抢中。

5)把样品放在轰击室中，关好门。

6)打开氦气瓶的总阀，顺时针转氦气调节阀，使氦压表指针的示数高于可裂膜压力200Psi(＝1．379MPa)。

7)打开基因枪及变压器开关。

8)按动真空键，待真空度至26—28in Hg(＝88．05～94．82kPa)时，迅速按下Hold键，接着按住发射键，并保持不动，直到激发为止。

9)按通气键待真空表归零后，取出样品。

10)关机。

把氦气瓶的总开关旋紧，打一次空枪，把氦压表指针归零后，再逆时针旋转氦压表调节阀；关闭基因枪的总开关及变压器开关。