常用电泳技术

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10-50
20
<40
20
5-40
蛋白质分子量范围与SDS-.聚丙烯酰胺凝胶浓度的关系
蛋白质分子量的测定
电泳迁移率与相对分子质量 的对数呈线性关系：
lgMr = -bmR + K
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应用
可测定蛋白质的分子量，对蛋白质组分进行 分离、分析、纯化、定性、定量以及少量的制备。 相对于光散射、色谱、超离心、渗透法等。SDSPAGE是测定蛋白质亚基分子量的一种简单、经济、 快捷、高分辨的好方法。
C=5% 凝胶浓度T/% 分子量范围/kD
SDS—凝5P胶A浓GE度，决由定于孔电2径5泳-大2分0小0离，只而取凝决胶于孔S径DS影蛋5响白电质泳亚效基果胶。束6特0的-别1大7是0小对，于 因此凝1胶0 浓度的选择尤10为-7重0 要。应根据样品1中0蛋白质的分2子0量-1范00围选
择合适1的5 凝胶浓度。 <50
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10-200
20
5-150
蛋白质分子量范围与聚丙烯. 酰胺凝胶浓度的关系
具体操作步骤
任何一种凝胶电泳都要经历四个过程。
1
3
制胶
2
电泳
4
检测及 处理
凝胶贮液 分离胶 浓缩胶
加样
制备样品
蛋白质标样
加样
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考马斯亮蓝染色 银染色
荧光染料
扫描、记录结果
应用
可测定蛋白质的分子量，对蛋白质组分进行 分离、分析、纯化、定性、定量以及少量的制备。 对于常规PAGE，由于电泳后蛋白质还保持其生物 活性，因此尤其适用于分离各种欲保持天然活性 的蛋白质，如酶、抗原、抗体、激素等。
密切相关，而凝胶的孔径大小决定于凝胶浓度，因 此凝胶浓度的选择很重要。
一般可根据样品中蛋白质的分子量范围选择 合适的凝胶浓度。
C=2.6% 凝胶浓度T/% 分子量范围/kD
C=5% 凝胶浓度T/% 分子量范围/kD
5
30-200
10
15-100
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10-50
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2-15
5
60-700
10
22-280
电泳技术
姓 名： 高源 专 业: 生物化工 学 号： 201420709
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Contents
1
简介及发展过程
2
电泳的原理
3 影响电泳分离的主要因素
4
常用的电泳介绍
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2
1.简介及发展过程
电泳技术：
电泳可以定义为带电的胶体粒子或大分子 在外加直流电场中向带相反电荷的电极做 定向移动的现象。
带正电荷的粒子向负极移动，带负电荷的粒子向正极移 动。
电泳分离则是利用荷电溶质在电场中泳动 速度的差别来进行分离的一种方法。
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3
最早发现于1808年。俄国物理学家Pehce于1809年在湿 黏土中插上带玻璃管的正负极两个电极，加压后发现正极 玻璃管中原有的水层变浑浊，即带负电荷的黏土颗粒向正 极移动，这就是电泳现象。
在1937年由瑞典科学家A.tiselius利用U形玻管进行血清 蛋白电泳，以界面折光率差别分离蛋白。
缓冲系统中离子强度的选择 离子强度低，蛋白质迁移速度快，但电泳带较宽；离子强度高，
蛋白质迁移速度慢，电泳带窄细，但由于高导电性而产生大量热， 易导致蛋白质变性及烧胶。另外，还要使缓冲系统有一定的pH缓冲 能力。一般离子强度应为0.01-0.1mol/L,常用的是0.05mol/L
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2.凝胶浓度 凝胶的分子筛效应与电泳分辨率、电泳速度
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影响分离结果的因素
1.缓冲系统的选择
对于SDS—PAGE，由于SDS对蛋白质的助溶作用以及负电荷的 包裹作用，蛋白质的分离仅依据于亚基的分子大小，因此缓冲液的选 择极为简单。只要有利于分离并保持蛋白质的稳定以及不与SDS发生 相互作用即可。
C=2.6%
2凝.凝胶胶浓度浓T/度% 分子量范围/kD
结论：不同蛋白质的m不同，蛋白质就能够分离开来，蛋白质电 泳正是根据此原理对不同物质进行分离的。
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3.影响电泳分离的主要因素
1
2
3
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内在因素： 蛋白质分子 本身的性质
电场强度E
溶液的性质
其他
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1.蛋白质的性质
蛋白质分子的氨基酸组成决定其在某个PH条件下的电性和电 量，进而决定了它的电泳速度；蛋白质分子的形状和大小也影响 它的电泳速度。
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1.电荷效应 pI不同，在恒定缓冲系统中不同蛋白质间同性净
电荷的差异。 2.分子筛效应
蛋白质分子的大小和形状的差异；蛋白质通过一 定的分离胶时，受阻滞程度不同而表现出不同的迁移 率。 3.样品的浓缩效应
在不连续的凝胶电泳中，样品首先经过大孔径的 浓缩胶被浓缩，再经过小孔径的分离胶进行分离。 浓缩胶与分离胶之间不仅存在凝胶孔径的不连续性， 还存在缓冲液系统的不连续性。
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凝胶电泳的分类
按被分离的蛋白质电性
阳极电泳：为通常使用的电泳方式，pH8.0-9.0，多数 蛋白质带负电，向正极迁移。 阴极电泳：仅用于分离碱性蛋白质，pH4.0左右，蛋 白质带正电，向阴极迁移
按电泳系统的连续性
连续电泳：系统中缓冲液pH和凝胶浓度保持不变。无 浓缩效应。 不连续电泳：体系中缓冲液离子组成、pH以及凝胶浓 度的不连续性，有浓缩效应，分辨率高。
d
m
v E
t U
l
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当球形分子在电场中以恒定速率移动时，所受的动力和阻力 平衡，即：
EQ6r（Stoke定律）
Q----被分离分子所带净电荷； ----介质黏度；
r----分子半径。
于是有：
m Q 6 r
即：蛋白质的迁移率与带电颗粒的分子大小、介质的黏度、颗粒 所带的电荷有关。
一般来说，所带净电荷越多，颗粒越小，越接近球形，则在电场 中迁移速率越快，反之越慢。
（2）电泳的支持介质 要求介质均匀，对样品吸附力小。吸附会延缓电泳分离。
（3）温度 电泳过程中会产热，造成样品的扩散及烧胶。因此需控制电压
或电流，或安装冷却系统。
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电泳分类
电泳
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常用的几种电泳介绍
01 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 02 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 03 等电聚焦（IEF） 04 双向电泳（2D）
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等电聚焦原理
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应用
可测定蛋白质的等电点，对蛋白质组分进行分 离、分析、纯化、定性、定量以及制备。
当体系：pH<pI，蛋白质分子会结合 H 而带正电，向阴极移动；
N 3 - C H - C H O N R 3 - C O H - C H H - O N R 2 - C O H - C H - O R
pH<pI
pH=pI
pH>pI
特定蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成，是一个物理化学常 数。对于不同的蛋白质，其等电点范围很宽，在一定的PH下，不同 蛋白质分子所带电荷的电性和电量不同，由此可进行蛋白质的分离和 分析。
它可用于多肽相对分子质量的分析，其特点是 SDS会使蛋白质分离并与之结合形成蛋白-SDS胶束， 所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的电荷，因此 消除了电荷差异对结果的影响。
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蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒， 无形状差别，棒的长度与蛋白质亚基分子量有关，所以 在SDS-PAGE中蛋白质分子仅存在分子大小的差异，于 是可利用分子量差异将各种蛋白质分开，因此SDSPAGE常用于测定蛋白质亚基的分子量和纯度鉴定。
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对于两种蛋白质来讲，物质A和B：当使用同一介质分离两种物质时： 物质A在电场中移动的距离:
dA =mA ·Et
某物质B在电场中移动的距离：
两物质移动距离差为：
dB =mB ·Et
∆d=(dA- dB)=(mA-mB) Et
若mA = mB 若mA ≠ mB
则∆d=0 两种物质不能分离 则∆d≠0 两种物质能分离
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3.等电聚焦
等电聚焦（IEF）是根据蛋白质分子等电点的不 同，在一个连续的、稳定的线性pH梯度中电泳，从 而对蛋白质进行分离和分析的技术。由于它具有聚 焦效应（浓缩效应），是目前分辨率最高的技术。
根据建立pH梯度不同：
载体两性电解质：将载体两性电解质溶解在电泳介质溶液 中制胶，形成聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳，然后将凝胶引 入电场中等电聚焦。载体两性电解质在凝胶中迁移形成pH梯 度，而样品则聚焦在其等电点处。分辨率为0.01pH单位，上 样量不可过高。 固相pH电解质：将弱酸、弱碱两性基团直接引入丙烯酰胺 中，在凝胶聚合时就形成pH梯度，因此pH梯度固定。分辨 率达0.001pH单位，上样量可更大。
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影响分离结果的因素
1.缓冲系统的选择
缓冲系统中pH的选择 由于蛋白质分离时需保持溶解状态，且蛋白质的分离要依据其
电荷密度，因此pH的选择很重要，一方面要使蛋白质的电荷密度差 别大有利于分离，另一方面要使蛋白质荷电多且带同性电荷以加速 分离。近半数蛋白质的等电点在pH=4.0-6.5，因此常使用pH=8.09.5缓冲体系的阳极电泳。对于碱性蛋白质可采用pH=3.0的KOH-醋 酸缓冲系统。
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2.迁移率
在一定的PH条件下，蛋白质分子会解离而带电，带电的性质和电荷 密度取决于蛋白质分子的性质和溶液的PH。不同的带点颗粒在同一电场 的运动速度不同，可以用迁移率来表示。
迁移率（m，mobility）即带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度：
m----迁移率，cm2 s•V ; v----迁移速度，cm/s; E----电场强度,V/cm; d---- 迁移距离,cm； t----电泳时间，s； U----电压，V； l----凝胶长度，cm。
（3）溶液的黏度 电泳迁移率与溶液的黏度成反比，所以黏度不能过大或过小。
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4.其他因素
（1）电渗现象 在电场中液体（通常指水）对固体支持物的相对移动。 电渗是由于电泳支持介质上含有带电基团，从而吸附流动相向
正极或负极移动。电泳时，带电颗粒的迁移速度是颗粒本身的迁移 速度与由于电渗携带颗粒的移动速度之矢量和。为消除电渗现象， 可选择无电渗的电泳介质。
分子量各不同，在同一电场作用下，各组 分的泳动方向和速度也各有差异; 在一定时间内，他们移动距离不同，从而可 达到分离鉴定的目的。
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1.蛋白质的电荷来源
从电泳的角度来看，蛋白质分子最主要的特性就是它的带电行为： 等电点（pI）：在某一条件的PH下，蛋白质所带的正负电荷数相等。 即净电荷为零。
当体系：pH>pI，蛋白质分子会解离出 H 而带负电，向阳极移动；
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1.聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacrylamide gel electrophoresis， 简称PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳 方法。 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(acrylamide)和交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide)在催化 剂作用下合成的。
1948年 Wieland等发明以滤纸作ຫໍສະໝຸດ Baidu支持物，使电泳技术 大为简化。
电泳作为一种生化分离手段已广泛应用于生物大分子的 分离、纯化、分析、制备以及用于测定它们的分子量、等 电点等。已成为生命科学、医学、制药学、食品、生物工 程、环境工程等领域常用的实验手段。
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2.电泳的原理
带有电荷生物分子在电场作用下发生移动; 由于混合物各组分所带电荷性质，数量以及
2.电场强度
电场强度(Electric field intensity)是指每厘米的电位降。 电场强度对电泳速度起着正比作用，越大则带电颗粒迁移越 快，电泳时间越短（高压电泳）；反之迁移慢，电泳时间长（常 压电泳）。
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3.溶液的性质
（1）溶液的PH 决定带点颗粒的电性和电量，对于氨基酸或蛋白质等两性电解
聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白质分离与分析中最 常用的电泳方法，包括常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）。
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PAGE 电泳原理
在凝胶中存在凝胶层、缓冲液、pH值及电场强度的 不连续性。
大孔径，样品在其中浓缩，在与分离胶的界面上形成薄层， 只具有电荷效应。
小孔径，具有电荷效应和分子筛效应，达到分离的目的。
质来说，溶液的pH值离其等电点越远，其净电荷量就越大，迁移 速度加快。因此需选择合适的pH，使欲分离的各种蛋白质所带电 荷的电性相同但是电量有较大的差异，以利于分离。
（2）溶液的离子强度 离子强度越低，欲分离组分的迁移速度越快；但离子强度太低
则缓冲能力太小。合适的离子强度范围在0.02-0.2mol/L之间。
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2.SDS-PAGE
原理
在电泳体系中加入了十二烷基硫酸钠（SDS）和 强还原剂。其中SDS作为阴离子去垢剂会破坏蛋白 质的氢键和疏水相互作用，导致蛋白质构象改变， 而巯基乙醇等可以打开蛋白质分子内的二硫键，使 其分解为亚基，因此电泳过程中蛋白质的生物活性 丧失或减弱，但电泳后可恢复或部分恢复活性。