三维细胞培养简介闫辉
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三维细胞培养技术的简介
闫辉 2019.10.9
目录
? 1 三维细胞培养技术的概念 ? 2 三维细胞培养技术产生的背景 ? 3三维细胞培养技术的亮点 ? 4 三维细胞培养模型的建立 ? 5 三维细胞培养技术的应用 ? 6 三维细胞培养技术的发展前景
1 三维细胞培养技术的概念
? 三维细胞培养技术( three-dimensional cell culture,TDCC) 是指将具有三维结构不 同的载体与各种不同种类的细胞在体外共 同培养, 使细胞能够在载体的三维立体空间 结构中迁移、生长, 构成三维的细胞载体复 合物。三维细胞培养是将细胞培植在一定 的细胞外基质中, 细胞外基质 （ extracellular matrixc ，ＥＣＭ)（1）蛋 白充当生长支架, 使得细胞能够分化产生一 定的三维组织特异性结构, 所创建的细胞生 长环境, 则最大程度地模拟体内环境。
? 4.1.2 实验室大量使用的基质胶是Matrigel 胶，是 从小鼠肿瘤组织中提取的抽提物，在室温下， Matrigel 可自动聚集产生类似于哺乳动物细胞基 底膜的生物活性基质材料。Matrigel 基底膜基质 形成的三维培养基质，可促进上皮细胞、肝细胞、 Sertoli 细胞、黑色素瘤细胞、血管内皮细胞、甲 状腺细胞及毛囊细胞等的贴壁与分化。同时， Matrigel 还能影响乳腺上皮细胞的蛋白表达，支 持外周神经的新生和牛输卵管上皮细胞的分化。 高浓度的Matrigel 适用于研究体内血管生成和肿 瘤细胞迁移及肿瘤模型的建立等。
? 4.2.2 胶上培养模式的建立方法 ? 在24 孔培养板中每孔加入 75 μl 冰上过夜解
冻的Matrigel ，置于37℃孵箱中 孵 育15min 以上使Matrigel 聚集。同时胰酶消化常规培 养的正常鼻咽细胞及其高转移潜能亚株 5-8F, 计数后离心收集细胞. 然后把细胞悬浮于含 2%Matrigel 的Keratinocyte-SFM 培养液中， 细胞浓度为2*104/ml 用 加样枪吹打成单个细 胞后, 每孔加入400 μl 细胞悬液于已经凝固 的Matrigel 上，置于含5%CO2的37℃孵箱中 培养，每3-4 天换新鲜培养液[2] 。
? 4.2.3 三明治培养模型的建立方法
? 三明治模式前期工作和凝胶上模式相同, 不同之处在于凝胶上的细胞经培养融合 至(70、80)%左右时, 吸去培养液, 用无菌 PBS冲洗两次后添加第二层胶(200μl/ 孔), 在37℃下培养30min 使其凝固后, 再在胶 原凝固面上添加培养液[3] 。
4.2 三维细胞培养模型的种类
? 三维立体培养的方法有多种，常用的有 胶内培养模式(细胞与胶原胶混合)、胶 上培养模式(细胞生长于胶原胶表面)和 三明治培养模式(细胞生长于两层胶原中 间)。
4.2 常见三维细胞培养模型的建立方法
? 4.2.1 胶内培养模式的建立方法
? Matrigel 母液浓度10.6 mg/mL （3）, 放置于4℃溶解(4) 。 消化细胞, 重悬至完全培养基中计数 , 细胞悬液浓度 为1×106/mL 。使用时置于冰上 , 用预冷的细胞重悬 液与Matrigel 等体积混匀,24 孔板中每孔加入 100μl 。 37℃放置30 min 使其成胶, 添加完全培养液。置于 37℃5%CO2细胞培养箱中孵育 , 第二日换液 , 此后每隔 一日换液一次 [1]。
内细胞生长情况更为相似；因此，三维细胞培养既
能保留体内细胞微环境的物质结构基础，又能体现
细胞培养的直观性及条件可控制性， 把体外无细胞
及单层细胞培养体系与组织器官及整体研究联系起
来。
4 三维细胞培养模型的建立
? 4.1 三维基质胶（2）的种类以及常用 基质胶的介绍
? 4.2 三维模型的种类 ? 4.3 常见三维细胞培养模型的建立方
发展, 三维细胞培养技术就应运而生了。
? 3 三维细胞培养技术的亮点
?
① 三维培养体系为细胞提供类似体内生长环境
的支架或基质，细胞通过紧密连接和 / 或缝隙连接பைடு நூலகம் 连接方式建立细胞间及细胞与胞外基质间的联系，
形成一定的三维结构；
② 三维培养细胞在基因表达、基质分泌及细胞
功能活动等方面与单层培养均有明显差异，而与体
? 另外, 我们在动物身上所观察到的结果,
往往是最终呈现的表现, 而非研究者最为 关心的中间过程。显然, 如何填补单层细 胞培养和动物实验的鸿沟, 一直是生命科 学家思索的问题。尤其是在发育生物学
领域, 迫切需要建立一套细胞培养技术, 既能生长传代, 还能最大程度地维持体内 性状, 并分化产生新的组织结构, 以便全 面研究发育过程。随着组织工程的新兴
三种模型的简单解释
4.3 不同模型的比较
? 对于胶上培养模式，细胞可以黏附于细胞外基质表面并向再 造基质胶中生长，但是只有贴近 Matrigel 胶的细胞才能得到 固体细胞外基质的支撑，其他不能贴近再造基质胶的细胞仍 然处于 2D 培养条件下，在培养过程中不能形成完全的立体 克隆；对于胶内培养模式，细胞直接重悬于完全融化的 Matrigel 胶条件下，细胞生长于完全固态的细胞外基质中， 可以很好地模拟体内肿瘤细胞生长微环境，在培养过程中形 成了巨大的、无极性的球状细胞克隆。所以大多数的实验建 立三维模型采用胶内培养模式，但相对来说胶上培养模式简 单一些，对于操作的要求低一些。三种模型共同的缺点是无 法对细胞直接利用显微镜进行连续的观察，需要对某一特定 时间的胶原块进行固定制作电镜标本。
法
? 4.1.1 目前已经知道的基质胶主要有海藻酸钙 凝胶、琼脂糖凝胶，这两种凝胶主要适用于 悬浮细胞的培养，还有一种是血纤维蛋白， 将动物细胞和血纤维蛋白原混合，然后加入 凝血酶。凝血酶将血纤维蛋白原转化为不溶 性的血纤维蛋白，将动物细胞固定在其中。 血纤维蛋白可以促进细胞贴壁，因此无论是 悬浮细胞还是贴壁细胞都适合。
2 三维细胞培养技术产生的背景
? 细胞的体外培养, 关注的不仅仅是它们的 分裂生长, 而更为重要的是它们经过传代 后能否维持体内的性状。在很多情况下, 单层细胞培养技术所取到的研究结果和 体内的情况不符合, 因为细胞在体外改变 的环境下增生, 逐渐丧失了原有的性状。 动物实验完全在体内进行, 但由于体内的 多种因素制约以及体内和外界环境相互 影响而变得复杂化, 难以研究单一过程。
闫辉 2019.10.9
目录
? 1 三维细胞培养技术的概念 ? 2 三维细胞培养技术产生的背景 ? 3三维细胞培养技术的亮点 ? 4 三维细胞培养模型的建立 ? 5 三维细胞培养技术的应用 ? 6 三维细胞培养技术的发展前景
1 三维细胞培养技术的概念
? 三维细胞培养技术( three-dimensional cell culture,TDCC) 是指将具有三维结构不 同的载体与各种不同种类的细胞在体外共 同培养, 使细胞能够在载体的三维立体空间 结构中迁移、生长, 构成三维的细胞载体复 合物。三维细胞培养是将细胞培植在一定 的细胞外基质中, 细胞外基质 （ extracellular matrixc ，ＥＣＭ)（1）蛋 白充当生长支架, 使得细胞能够分化产生一 定的三维组织特异性结构, 所创建的细胞生 长环境, 则最大程度地模拟体内环境。
? 4.1.2 实验室大量使用的基质胶是Matrigel 胶，是 从小鼠肿瘤组织中提取的抽提物，在室温下， Matrigel 可自动聚集产生类似于哺乳动物细胞基 底膜的生物活性基质材料。Matrigel 基底膜基质 形成的三维培养基质，可促进上皮细胞、肝细胞、 Sertoli 细胞、黑色素瘤细胞、血管内皮细胞、甲 状腺细胞及毛囊细胞等的贴壁与分化。同时， Matrigel 还能影响乳腺上皮细胞的蛋白表达，支 持外周神经的新生和牛输卵管上皮细胞的分化。 高浓度的Matrigel 适用于研究体内血管生成和肿 瘤细胞迁移及肿瘤模型的建立等。
? 4.2.2 胶上培养模式的建立方法 ? 在24 孔培养板中每孔加入 75 μl 冰上过夜解
冻的Matrigel ，置于37℃孵箱中 孵 育15min 以上使Matrigel 聚集。同时胰酶消化常规培 养的正常鼻咽细胞及其高转移潜能亚株 5-8F, 计数后离心收集细胞. 然后把细胞悬浮于含 2%Matrigel 的Keratinocyte-SFM 培养液中， 细胞浓度为2*104/ml 用 加样枪吹打成单个细 胞后, 每孔加入400 μl 细胞悬液于已经凝固 的Matrigel 上，置于含5%CO2的37℃孵箱中 培养，每3-4 天换新鲜培养液[2] 。
? 4.2.3 三明治培养模型的建立方法
? 三明治模式前期工作和凝胶上模式相同, 不同之处在于凝胶上的细胞经培养融合 至(70、80)%左右时, 吸去培养液, 用无菌 PBS冲洗两次后添加第二层胶(200μl/ 孔), 在37℃下培养30min 使其凝固后, 再在胶 原凝固面上添加培养液[3] 。
4.2 三维细胞培养模型的种类
? 三维立体培养的方法有多种，常用的有 胶内培养模式(细胞与胶原胶混合)、胶 上培养模式(细胞生长于胶原胶表面)和 三明治培养模式(细胞生长于两层胶原中 间)。
4.2 常见三维细胞培养模型的建立方法
? 4.2.1 胶内培养模式的建立方法
? Matrigel 母液浓度10.6 mg/mL （3）, 放置于4℃溶解(4) 。 消化细胞, 重悬至完全培养基中计数 , 细胞悬液浓度 为1×106/mL 。使用时置于冰上 , 用预冷的细胞重悬 液与Matrigel 等体积混匀,24 孔板中每孔加入 100μl 。 37℃放置30 min 使其成胶, 添加完全培养液。置于 37℃5%CO2细胞培养箱中孵育 , 第二日换液 , 此后每隔 一日换液一次 [1]。
内细胞生长情况更为相似；因此，三维细胞培养既
能保留体内细胞微环境的物质结构基础，又能体现
细胞培养的直观性及条件可控制性， 把体外无细胞
及单层细胞培养体系与组织器官及整体研究联系起
来。
4 三维细胞培养模型的建立
? 4.1 三维基质胶（2）的种类以及常用 基质胶的介绍
? 4.2 三维模型的种类 ? 4.3 常见三维细胞培养模型的建立方
发展, 三维细胞培养技术就应运而生了。
? 3 三维细胞培养技术的亮点
?
① 三维培养体系为细胞提供类似体内生长环境
的支架或基质，细胞通过紧密连接和 / 或缝隙连接பைடு நூலகம் 连接方式建立细胞间及细胞与胞外基质间的联系，
形成一定的三维结构；
② 三维培养细胞在基因表达、基质分泌及细胞
功能活动等方面与单层培养均有明显差异，而与体
? 另外, 我们在动物身上所观察到的结果,
往往是最终呈现的表现, 而非研究者最为 关心的中间过程。显然, 如何填补单层细 胞培养和动物实验的鸿沟, 一直是生命科 学家思索的问题。尤其是在发育生物学
领域, 迫切需要建立一套细胞培养技术, 既能生长传代, 还能最大程度地维持体内 性状, 并分化产生新的组织结构, 以便全 面研究发育过程。随着组织工程的新兴
三种模型的简单解释
4.3 不同模型的比较
? 对于胶上培养模式，细胞可以黏附于细胞外基质表面并向再 造基质胶中生长，但是只有贴近 Matrigel 胶的细胞才能得到 固体细胞外基质的支撑，其他不能贴近再造基质胶的细胞仍 然处于 2D 培养条件下，在培养过程中不能形成完全的立体 克隆；对于胶内培养模式，细胞直接重悬于完全融化的 Matrigel 胶条件下，细胞生长于完全固态的细胞外基质中， 可以很好地模拟体内肿瘤细胞生长微环境，在培养过程中形 成了巨大的、无极性的球状细胞克隆。所以大多数的实验建 立三维模型采用胶内培养模式，但相对来说胶上培养模式简 单一些，对于操作的要求低一些。三种模型共同的缺点是无 法对细胞直接利用显微镜进行连续的观察，需要对某一特定 时间的胶原块进行固定制作电镜标本。
法
? 4.1.1 目前已经知道的基质胶主要有海藻酸钙 凝胶、琼脂糖凝胶，这两种凝胶主要适用于 悬浮细胞的培养，还有一种是血纤维蛋白， 将动物细胞和血纤维蛋白原混合，然后加入 凝血酶。凝血酶将血纤维蛋白原转化为不溶 性的血纤维蛋白，将动物细胞固定在其中。 血纤维蛋白可以促进细胞贴壁，因此无论是 悬浮细胞还是贴壁细胞都适合。
2 三维细胞培养技术产生的背景
? 细胞的体外培养, 关注的不仅仅是它们的 分裂生长, 而更为重要的是它们经过传代 后能否维持体内的性状。在很多情况下, 单层细胞培养技术所取到的研究结果和 体内的情况不符合, 因为细胞在体外改变 的环境下增生, 逐渐丧失了原有的性状。 动物实验完全在体内进行, 但由于体内的 多种因素制约以及体内和外界环境相互 影响而变得复杂化, 难以研究单一过程。