引物合成常见问题分析.
引物合成常见问题分析
1．需要合成多少OD的oligo？
一般来说，20BP 2 OD引物可以做400-500次50ul标准PCR反应，以及2000—2500 次的测序反应。因此，2 OD 的DNA 量足以进行一般的实验工作。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了，无论是PAGE 纯化，还是 HPLC 纯化，增大每次的纯化量会大大降低制品的纯度。所以，为了保证制品质量，我们一般把每次的纯化量控制在 2 OD 左右。
如何测定引物的OD值：
DNA的量与260nm处的吸光度值(OD值)成正比，因此使用紫外分光光度计定量是最科学的，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。
例如：您拿到一管引物DNA干粉，用1ml水溶解成母液。取该母液50μL稀释成1ml，在1ml标准比色杯中测定其吸光度为0.25，说明该
50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。
2.如何检测Oligo DNA的纯度？
实验室检测时比较方便的作法是进行PAGE凝胶电泳。一般用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳即可，小于12bp的短链使用20% 的凝胶，大于60bp的引物使用12% 的凝胶。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下观察，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用银染方式染色。
3.使用3%的Agarose凝胶电泳合成的 Oligo DNA 制品，为什么有很多条带？
由于Oligo DNA 是单链 DNA ，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose 电泳时，容易出现多条泳带（更不能用 Agarose 电泳来进行
定量了）。Oligo DNA 的电泳一定要使用变性 PAGE 电泳，Agarose电泳对于小单链的DNA引物的区分度不够。而且，用荧光TLC板在紫外灯下观察，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用银染方式染色。
4.琼脂糖电泳后进行EB染色发现条带很弱，是Oligo DNA的量不够么？
EB是通过嵌合到核酸的双螺旋结构中而使其显色的，而合成DNA是单链的，只有通过形成局部发夹结构或其它双螺旋结构的时候才能被染色。不同的引物由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会有差异。比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测，或用上面说的PAGE凝胶电泳用荧光TLC板在紫外灯下观察，也可以用银染的方法。
5. 进行PAGE 电泳时，长度完全一样的 Oligo DNA 为什么泳带不在同一位置 ?
◆A 、G 、C 、T 的组份不同，电泳速度不同；
◆ DNA 的立体结构不同，电泳速度不同；
这种情况在 Oligo DNA 越短时越容易发生，长链 Oligo DNA 之间差别较小。
6.合成的引物PCR后无目的条带是什么原因
PCR 反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑。
◆ 引物和模板是否匹配 ；
◆ 引物本身是否有立体结构，或者二条引物之间是否形成高级结构；
◆ PCR 反应用试剂是否正常；
◆ PCR 仪是否工作正常 ；
◆ PCR 反应条件是否合适 ；
◆引物设计是否有问题；
如果一切正常，还无法解决问题时，可能是引物合成的问题，我们可以免费重新合成引物，再次合成还不成功就有可能不是引物的问题啦（合成两次都不成功的要收一次费用）。
7.测定了Oligo DNA的OD值后发现A260/A280<1.8，制品质量(纯度)合格吗?
有的老师问：引物应该全是DNA,但是OD260/OD280的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？其实引物化学合成，是没有机会蛋白质污染的。Oligo DNA和一般提取的双链DNA不同，A260/A280的比值不能准确衡量Oligo DNA制品的质量，该比值依赖于序列中的各种碱基的组份，比值过低一般是由于引物中C/T 的含量较高所致。下面是一个
20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。
8.Oligo DNA定量不准是怎么回事儿？
我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告，出现这种情况的可能性有：（1）生产人员定量错误。这种可能性有，但是不大，因为我们的生产人员都是经过严格的培训，程序化规范操作和换算。公司内部的考核机制也使得分装人员没有必要故意少给用户OD数。（2）引物抽干或收样过程中，引物干粉可能意外丢失。这种情况很少见。（3）系统误差，我们认为10%左右为允许误差。使用过程中，引物工作浓度范围很宽，定量上的少许偏差不影响实验。（4）用户没有能够正确理解引物OD数的含义，没有能够正确使用分光光度计，特别是使用微量测定；或者用
户没有将OD读数，正确地转换成母液中的OD数。这种情况比较常见。（5）用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。
9.Oligo DNA溶解后发现有少许沉淀，会影响实验结果吗?
Oligo DNA制品PAGE纯化后要使用C18柱进行吸附，偶而会有微量的树脂溢出而进入制品。树脂不影响任何反应结果，请稍许离心后取上清使用即可。
10.三博公司的 Oligo DNA 制品包装中为什么不提供电泳照片?
做过 Oligo DNA PAGE 电泳的人员都知道，用EtBr 等染色剂染色时，同一 OD 量的不同序列的 DNA 制品电泳时的泳带亮度（清晰度）是不一样的。原因在于 EtBr 等染色剂的染色是渗透至 DNA 的双链之间的，而合成的 Oligo DNA 是单链， Oligo DNA 自身形成的立体结构越复杂，EtBr 的染色就越容易， DNA 带也就越亮。相反，有一些Oligo DNA 由于不形成立体结构，根本就不为 EtBr 所染色。因此，我们认为有些公司对所有产品都提供黑地亮带，而且差不多一样亮的电泳照片是不符合事实的。三博公司的每一条引物在出货之前都要进行严格的电泳检测，拿出1/10 OD的引物来鉴定，在荧光玻璃下面看到白地黑色条带，带形一致没有杂带，有杂带的引物是绝不会发货的，而在荧光玻璃上面照像比较困难，且不美观，所以不好给顾客提供像片。但请您放心三博的质量是您值得信赖的。
11.PCR产物经克隆后测序发现引物处的碱基有错误，为什么 ?怎么办 ?
三博远志总结出了以下一些原因，仅供参考：
◆PCR 过程的错配；
◆克隆过程的突变；
◆化学合成过程中，未知的错误；应该说，上述这些情况发生的可
能性都极低。然而，合成的 DNA 链越长，发生这种情况的机率也就越大。
◆概率问题，因为引物纯度不可能是 100% ，样品的纯度也不是100%，因此挑选克隆时，有可能挑选了杂质引物扩增出的 PCR 产物做了克隆。
因此，请重新挑选克隆测序，也许结果会变好。根据我们的经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。
如果挑选 2 -3 个克隆测序情况还没改观，我们会免费重新合成引物。不过重合的引物和第一次的引物一样，还有可能错误。如果还不行可以考虑重设引物，提高样品的纯度上下功夫。总之，实验有时候就是这么不顺利，不要怨天忧人，运气不好生气也没用，还不如心平气和呢？
12.如果测序发现引物突变，是否有补偿？
我们可以免费重合一次引物，没有其他补偿或赔偿，不能承担其他连带责任，这是国际行规。原因我们在前面已提到，化学合成准确率（或纯度）不可能达到100%，客户样品的纯度关系也很大，我们总结使用引物错误的概率有1％左右，关于这方面的信息在每个产品说明书里都有事先说明。
13.进行蛋白表达实验数个月不成功，后经测序发现引物处有错误，怎么办 ?
◆ 表达实验之前一定要对 DNA 序列进行验证，这是实验的常识；
◆ 我们可以免费重新合成引物；
◆ 如进行索赔时，按国际行业惯例，索赔范围限于制品价格范围之内。
14.如何提高引物的纯度？怎样才能保证 Oligo DNA 的正确性？
◆ 合成 Oligo DNA 时，选用高纯度级制品；
◆ 避免使用大于50mer 的长链 Oligo DNA ，最好选用小于 35mer 的合成 DNA 制品。不要超过2OD，60个碱基以上最好不超1OD，国内有一个不好的现象，长链引物要的量都比较大，导致割的条带比较宽，建议您减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些；
◆ 进行克隆实验时，每次克隆都须进行测序验证，以保证序列的正确性，然后再进行进一步实验，进行蛋白表达实验时，尤其需要注意。
15.Oligo DNA最长可以合成多少个碱基 ?
引物越长，出现问题的概率就越大。以每步反应效率为 99% 进行计算，粗略计算合成到 100 个碱基时，目的 DNA 片段的比例便为 0 。但有些厂家曾报道合成了 150mer 的Oligo DNA片段。三博公司也曾合成过120mer左右的Oligo DNA 制品。但根据我们的经验，要想保证合成DNA 的碱基 90% 正确，Oligo DNA的长度最好不要超过70mer，80mer以上要想保证一个碱基都不错就非常危险了，须十分注意。
16.一般的合成 Oligo DNA 的 5‘ 和 3‘ 末端有磷酸基团吗 ?
没有磷酸基团， 5‘ 和 3‘ 末端均为 - OH 基。如需要加磷酸基团，订货时请特别注明，此时需收取磷酸化的费用。
17.Oligo DNA片段退火后不能连接到载体上是什么原因？
连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。
18.平端的 PCR 产物难以克隆，为什么 ?
由于一般的 PCR 用引物的 5‘ 末端都没有 P ，因此，扩增后的
PCR 产物的 5‘ 末端也没有 P 。当克隆于去磷酸化的末端平滑载体时，无法克隆进去；而当克隆于非去磷酸化的末端平滑载体时，背景会极高。此时请对 PCR 产物的 5‘ 端进行磷酸 (P) 化处理。
19.如何将两条互补的单链退火形成双链？
用退火缓冲液(10 mM Tris pH=8.0，50 mM NaCl, 1 mM EDTA)溶解引物，浓度：1～5 OD/100μl。将二条链等摩尔混合。94℃保温5分钟后，冷却至室温，4℃保存供实验使用。
20.进行反义 DNA (Antisense DNA) 实验时，是否要对 DNA 链全部进行 S 化修饰 ?
DNA 经 S 化修饰后比较稳定，在细胞中不会被核酸酶等分解。如果整条链全部修饰成 S 化 DNA ，的确能增加 DNA 的稳定性，但此时会降低 DNA 和目的模板结合的效率。
因此，现在一般的科研人员通常采用将 DNA 片段两端的数个碱基进行S 化修饰，这样既能取得保护 DNA 的效果，又能增加 Antisense DNA 和目的模板的结合能力。
即使如此，现在还是有很多科研人员采用了全部 S 化的修饰方法，并且能得到非常良好的实验结果。因此，任何一项科研工作都不是绝对的，应根据具体情况设计实验方案。
21.Biotin标记有三种，它们之间有何不同？
ss-Biotin可提供比较长的连接臂（臂长约24.3A），有利于Biotin与Avidin间的结合，而且分子中含有S-S键，可使用还原剂（50 mM DTT或100 mM 巯基乙醇）方便地将探针分子（不再带有Biotin基团）与靶序列分开。Imino-Biotin可提供较短的连接臂（约13.5A），其最大特点是Biotin与Avidin的分离可在较温和的条件下进行：8M盐酸胍
（pH4.0）。普通的Biotin提供与ss-Biotin相似长度的连接臂，但只能用8M盐酸胍（pH1.5）分离Biotin与Avidin.
22.FITC、6-FAM、5-FAM标记之间有何区别？
他们都是荧光素标记（Fluorescein），三者结构间的区别如下：从结构图可见，5-FAM与6-FAM互为异构体：而FITC则在与oligo的连接方式上（硫脲键）有别于前者（酰胺键），但它们的发色团均为荧光素，通常使用中没有区别。
23.淬灭基团为TAMRA或ECLIPSE的双标记荧光探针在使用上有什么不同?
由淬灭基团TAMRA或ECLIPSE组成的双标记荧光探针常常被用作水解探针（Hydrolysis Probes），或称“TaqMan”探针，用于Real-time PCR实验。由于TAMRA与ECLIPSE光谱学性质不同（见下图），作为淬灭基团使用时的特点也不同，现说明如下：
加图1、2
◆ TAMRA为荧光染料，在淬灭报告基团的同时，自身会在更高波长处发射荧光，此发荧光会对报告基团的检测造成影响，探针荧光本底相对较高。而ECLIPSE为非荧光染料，淬灭报告基团，但自身不发射荧光，因此，探针荧光本底低，信噪比更大，检测灵敏度更高。
◆ 淬灭基团对报告基团的淬灭有赖于二者的光谱交盖（Overlapping），也即报告基团的荧光波长应落在淬灭基团的吸收光谱波长范围内。对比TAMRA与ECLIPSE的吸收光谱可见，TAMRA的吸收光谱波长范围窄，与之可匹配的报告基团种类比较少，而ECLIPSE具有更宽的吸收波长范围（390nm-625nm），可淬灭的报告基团种类很多（FAM、HEX、TAMRA、ROX等均可），用于多重PCR （Multiplexing PCR）时可有多种选择，因此淬灭基团为ECLIPSE的双标记荧光探针更适合于多重PCR。
24.TaqMan探针设计时应遵循哪些原则？
◆探针应位于两引物之间；
◆探针中碱基G、C的含量应在20%～80%之间；
◆避免同种碱基成串出现，特别是碱基“G”；
◆碱基G不要出现在5′末端；
◆探针的Tm值要比引物的Tm值高8-10℃，应在68-70℃之间；
◆探针长度超过30个碱基时，最好把淬灭基团放在中间，以防止荧光本底过高，这时探针的3′末端应加磷酸基封阻，以防探针延伸。
(免费共享)SDS-PEGA聚丙烯酰胺凝胶电泳常见问题及分析
常见问题及分析 1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？ 在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。 2. 样品如何处理？ 根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 1) 还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构 象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。 2) 带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保 护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 3) 非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min， 未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED 与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基磺酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。
高层建筑结构设计常见问题探讨
高层建筑结构设计常见问题探讨 摘要：近年来，建筑高度的不断增加, 风格的变化多样，给高层结构设计提出了新的课题和挑战。本文就结构设计中特别要注意的几个问题进行了分析。 关键词：高层建筑; 结构设计;常见问题 一、高层建筑结构设计特点 1 高层建筑结构设计的特点 1.1 水平荷载成为决定因素。一方面，因为楼房自重和楼面使用荷载在竖向构件中所引起的轴力和弯矩的数值，仅与楼房高度的一次方成正比；而水平荷载对结构产生的倾覆力矩，以及由此在竖向构件中引起的轴力，是与楼房高度的两次方成正比；另一方面，对某一定高度楼房来说，竖向荷载大体上是定值，而作为水平荷载的风荷载和地震作用，其数值是随结构动力特性的不同而有较大幅度的变化。 1.2 轴向变形不容忽视。高层建筑中，竖向荷载数值很大，能够在柱中引起较大的轴向变形，从而会对连续梁弯矩产生影响造成连续梁中问支座处的负弯矩值减小，跨中正弯矩和端支座负弯矩值增大；还会对预制构件的下料长度产生影响，要求根据轴向变形计算值对下料长度进行调整；另外对构件剪力和侧移产生影响，与考虑构件竖向变形比较，会得出偏于不安全的结果。 1.3 侧移成为控制指标。与较低楼房不同，结构侧移已成为高层建筑结构设计中的关键因素。随着楼房高度的增加，水平荷载下
结构的侧移变形迅速增大，因而结构在水平荷载作用下的侧移应被控制在某一限度之内。 1.4 结构延性是重要设计指标。相对于较低楼房而言，高层建筑结构更柔一些，在地震作用下的变形更大一些。为了使结构在进入塑性变形阶段后仍具有较强的变形能力，避免倒塌，特别需要在构造上采取恰当的措施，来保证结构具有足够的延性。 二、根据不同类型高层建筑，选择合理的结构体系 2.1结构的规则性问题 新旧规范在这方面的内容出现了较大的变动，新规范在这方面增添了相当多的限制条件，例如：平面规则性信息、嵌固端上下层刚度比信息等，而且，新规范采用强制性条文明确规定“建筑不应采用严重不规则的设计方案”。因此，结构工程师在遵循新规范的这些限制条件上必须严格注意，以避免后期施工图设计阶段工作的被动。 2.2结构的超高问题 在抗震规范与高规中，对结构的总高度都有严格的限制，尤其是新规范中针对以前的超高问题，除了将原来的限制高度设定为a 级高度的建筑外，增加了 b级高度的建筑，因此，必须对结构的该项控制因素严格注意，一旦结构为 b级高度建筑甚或超过了b 级高度，其设计方法和处理措施将有较大的变化。在实际工程设计中，出现过由于结构类型的变更而忽略该问题，导致施工图审查时未予通过，必须重新进行设计或需要开专家会议进行论证
引物设计基本方法
Primer 5.0搜索引物： 1.Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。 2.PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 3.Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。 4.搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。 Oligo 6.0评估引物： 1.在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer ove rall 6.7kcal/mol没有问题。 2.Hairpin Formation根据黄金法则 3.False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。 4.在PCR栏，个人感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 5.Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。下图1引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。 最后说一句，敢于尝试就会成功。 第二贴 －－科室工作很多，小医生了，没有办法，所以肯怕不能满足很多战友的要求（qq聊或帮助设计），在此表示抱歉。就楼上的问题我试着回答一下，不一定正确，供参考吧。 －－1、两个评价系统不一样，个人感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，我一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。 －－2、3端的二聚体应该避免，这个要看你的退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（个人观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。 －－3、个人感觉3端有A无A影响不大，3端有T的没有经验。有T是不是一定不行，个人感觉不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。 －－4、错配和二聚体谁轻谁重，个人觉得“到致命的程度”谁都重要，我也说不好。我设计的时候，尽量两个都不得罪。 －－5、GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以我设计的时候，尽量避免这样的情况出现。 谈一下我学这个引物设计的过程吧：
电泳常见问题及解决方法
3. 1 滑橇底部油泥污染导致电泳缩孔及其解决办法在车身经手工预清理完后，进行洪流冲洗前，需要将车身承载在滑橇上并锁紧，再装挂在自行葫芦系统的吊架上，然后依次通过电泳涂装各工艺槽。当滑橇第一次通过电泳槽时，滑橇表面会泳涂上一层电泳漆膜，形成绝缘层。而当滑橇承载车身再一次通过电泳槽时，滑橇表面因有绝缘层的存在而不会泳涂上新的电泳漆膜，但会一次次附上一层新的电泳浮漆。由于电泳后的水洗工艺主要是针对车身，而位于车身底部的滑橇不可能被冲洗干净。因此，当附有电泳浮漆的滑橇在电泳后工位(如电泳烤房、电泳烤后存放)的输送链上前行时，滑橇底部的电泳浮漆和已泳涂上的电泳漆膜与输送链上的滚子不断接触、摩擦，就会粘附滚子上的润滑油，形成油泥。由于这些油泥位于滑橇底部，并且有很强的粘附性，即使在通过脱脂和水洗等工艺槽时，也不能完全被清除干净，从而污染磷化槽液、电泳槽液及电泳烤房。油泥污染引起的直接后果就是造成电泳漆膜缩孔。经观察发现，在每次对电泳滑橇通过的输送链加油润滑后，电泳漆膜缩孔明显增加。电泳漆膜缩孔不仅加大了电泳底漆打磨的工作量，也明显影响整车涂膜的质量和抗腐蚀性能。 人工擦除滑橇底部油泥，以避免电泳漆膜缩孔是一种解决办法，但费时费力；在预脱脂槽里增加喷嘴，利用高压脱脂液对滑橇底部油泥进行冲洗也是一种办法，但这样做需要对预脱脂槽进行较大的改造，并且还会加快预脱脂槽液的更新周期，从而造成成本上升；第3 种办法是在车身吊装进槽前的滚床间安装油泥清洗机。清洗机带有一对呈滚轮状的毛刷，通过电机减速驱动毛刷对滑橇底部油泥进行刷洗。该方法简便可行。为加强对油泥的清洗效果，利用该方法并采用3 套清洗机，通过其6 个呈滚轮状、用以粘附滚轮下面清洗液的毛刷对在清洗机上面通过的滑橇底部的油泥进行连续滚刷。清洗机安装调试完毕，经过2 周的试运行后发现，清洗机工作稳定可靠，清洗效果明显提高。 滑橇底部油泥在经过3 次连续的滚刷后基本被清除，再经过后续的洪流冲洗、脱脂、水洗等流程，油泥被清除得更为彻底，不再对磷化槽液、电泳槽液形成污染，从而避免了因油泥而造成的车身电泳漆膜缩孔的问题。虽然，滑橇通过电泳槽时，滑橇表面仍然会粘附新的电泳浮漆，而且滑橇底部的电泳浮漆在接触电泳烤房输送链上的润滑油后，也会形成油泥，但由于烤房输送链使用的是高温润滑油，不易挥发，故在烤房里形成的油泥，不会导致车身电泳漆膜缩孔。这样车身电泳漆膜缩孔问题便得到有效的控制。 3. 2 车身顶篷吸顶及其消除 在车身所有的部位中，车身顶篷的强度和刚性都是最弱的。笔者所在公司生产的车型为轻型越野车，尽管在顶篷内设计了加强筋，但比起车身其它部位，其强度和刚性还是稍差。于是，在电泳涂装过程中，当车身从浸入的各工艺槽中上升出槽时，受槽液压力影响，会在顶篷处造成局部凹陷，这就是通常所说的吸顶。轻微的吸顶经修复后，对车身质量不会造成太大的影响；如果吸顶严重，则会造成顶篷报废。在所生产的两款车型中，有一款是PAJERO 系列车型(CK 车)，车身外形长4 650 mm、宽1 780 mm、高1 450 mm，其顶篷长、宽尺寸也分别为2 400 mm 和1 200 mm。由于车身顶篷面积大，导致CK 车车身在电泳涂装线上试生产时，每台车都发生吸顶现象，而未开天窗的车身发生吸顶的情况尤为严重。因此，吸顶现象成为该车型生产亟待解决的问题。 起初，解决的措施是加大车身后仰出槽的倾斜角度，同时在不影响生产节拍的情况下，适当降低车身上升出槽时的速度，以减轻槽液对车顶的压力。采取上述措施后，取得了初步的成效，即：开有天窗的CK车在通过前处理电泳生产线的各工艺槽后，只有很少比例的车发生轻微的吸顶，而且稍加修复即可消除，对车身质量不会造成影响；但未开天窗的CK 车在通过前处理电泳生产线的各工艺槽后，仍然发生一定程度的吸顶。 研究发现，未开天窗的CK 车车身顶篷面积大，强度和刚性差，因此容易发生吸顶。此时，若继续加大车
DNA合成常见问题解答
DNA合成常见问题解答 1.DNA合成粗产物中含有什么杂质 DNA合成仪合成的粗产物经过浓氨水氨解以后，其中除了含有所需的目的DNA片段(n)以外，还含有合成反应过程中产生的目的片段短的失败片段(n-1,n-2,…)以及脱保护基团产生的铵盐。需要通过纯化去除短片段、通过脱盐去除盐分。 2.如何进行合成产物的纯化 目前公认和大多采用的DNA粗产物后处理方式有4种： A) C18柱脱盐，这是一种活性炭柱子，有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。但是它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法处理的产物中虽然含有比目的片段少5' 端一个或两个或多个碱基的产物，却一般不会对普通PCR反应产生影响。但是对于需要用于测序、用于克隆的引物不能使用这个级别，以免后患无穷。 B) OPC柱纯化，OPC柱中装有对Dmt具有亲和力的树脂，合成DNA片段时保留5' 端最后一个碱基上的Dmt，所有合成产物吸附在OPC柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有Dmt 的片段吸附能力强，不易被洗脱，不带有Dmt的片段吸附能力弱， 被洗脱。然后用三氟乙酸TFA或三氯乙酸TCA脱去Dmt基团，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA这种方法的优点是快速，简易。但是其专一性吸附Dmt能力有限， 不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量小。特别是对长于25 碱基以上的片段纯化效果不好。 C) HPLC纯化，这是国外厂家常常使用的办法。它是依据不同大小的片段带有的净 电荷多少来分离产物的。合成粗产物中不同长度的DNA片段决定了它带有不同的 净电荷，较长的片段带有高电荷比带电荷低的短片段在离子交换柱中流动得慢。 先将粗产物检测主峰位置，再增加加样量，回收主峰位置的部分。它的优点是自动化程度高、省人
DNA电泳常见问题分析
DNA电泳常见问题 凝胶电泳操作注意事项 1、琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 2、凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶化的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。 3、电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应经常更新电泳缓冲液。 4、样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA 中片段的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清;反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较大的DNA此现象更明显。 5、 DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 6、 DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辩范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分辨率。 7.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。 8.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。 9. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。 10. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。 11.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤2～8。 12.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量 DNA电泳常见问题分析之一 1 请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时，促凝的是TEMED还是过硫酸铵？胶聚时间很长如何解决？ 过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。胶聚合时间长可能是TEMED失效了，过硫酸铵固体时间过久也会失效的。 一个让PAGE胶很快聚合的方法： 不要先配AP（过硫酸铵）溶液，因为AP很容易变质。在保证TEMED和AP质量的情况下，每次配胶时，直接称一定量的AP粉剂溶入液体状态的PAGE中，这样可以保证AP的催化能力，而且可以多加一点。配25ml的PAGE胶，加0.03克AP粉剂，最后加入25ulTEMED，20分钟左右就可以凝固（当然这个时候拔梳子，会有少量未凝固的PAGE在孔里形成丝状干扰，使加的样品看起来不太漂亮，但一般不影响跑胶效果和条带的形状和位置）。 2 DNA电泳的MARKER怎么是扭曲的？ 1、配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的.最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面1－2mm
楼梯设计常见问题探讨(一)
21 We learn we go 张 伟，李 斌，黄 杰/0 前言 楼梯间的功能是解决建筑物竖向交通，对多层和高层建筑而言，都是不可或缺的重要组成部分。当遇到紧急情况（如火灾、地震等）时，楼梯间是紧急疏散人群的重要交通通道，其重要性更突出。在对工业与民用建筑工程项目进行设计时，楼梯间是最能体现建筑师和结构工程师密切配合的劳动成果。在满足楼梯间建筑功能正常使用的前提下，做到安全经济，是结构工程师最基本的职责。但是，若欠缺有关的设计经验，不但会影响到楼梯间正常使用和建筑功能的要求，而且有时会遗留安全隐患。楼梯间设计正确与否的问题涉及到与建筑专业的配合深度，而且针对结构专业自身也存在一些需要注意的常见问题，故基于在实际工程中大量工程案例有关楼梯设计问题的归类和总结，通过一些常见问题的剖析，提出解决问题的思路和方法，供同行在实际工程设计中借鉴。 1 影响建筑功能的问题 1.1 净高不足 （1）存在问题 楼梯间净高不足是楼梯设计中常见问题之一，出现此类问题的原因主要有以下两点：1）建筑师对相关建筑规范中有关楼梯设计的规定尚未熟练掌握或对组成楼梯结构构件的空间关系缺乏必要了解；2）结构工程师对楼梯净高概念的要求未能融会贯通、灵活应用，对影响到净高结构构件的空间关系缺乏足够认识。 （2）应对措施 1）掌握有关楼梯净高概念的相关规定，《民用建筑设[1]第6.7.5条规定：楼梯平台上部及下部过道处的净高不应小于2m ，梯段净高不宜小于2.2m 。其中，对梯段净高的概念解释为：自踏步前缘（包括最低和最高一级踏步前缘线以外0.3m 范围内）量至上方突出物下缘间的垂直高度。上述解释的理由是基于一般应满足人在楼梯上伸至手臂向上旋升时手指刚触及上方突出物下缘一点为限，为保证人在行进时不碰头和不产生压抑感，故按照常用楼梯坡度，梯段净高不宜小于2.2m 。2）对遇到梯段净高余量较小的区域，上层踏步起跑位置的梯梁位置应仔细计算分析，遇到净高不足的情况，有两个途径可以选择：即取消起跑位置梯梁或将梯梁内退平移。前者适用于梯段和休息平台跨度之和较小的情况，此时该梯段转化为折线型楼梯，应重新复核计算，其梯板板厚和配筋均会有所变化。后者应特别注意，梯梁内退平移距离应将建筑面层厚度计算在内，以免余量太小，有可能仍旧不满足对梯段净高的要求。遇到休息平台下方净高余 各项因素，将上层位置的梯梁内退0.35m ，可有效解决该问题（图1）。 图1 梯段净高不足实例一 （4）工程实例2 某工程楼梯间，首层入户门和半层位置均存在净高不足的问题，针对此问题，采取的具体措施为：入户门上方梯梁设计为反梁可使得净高大于2m 。半层位置梯段休息平台和起跑位置净高余量均较小，除将梯梁内退0.35m 外，尚要求梯梁梁高控制在0.3m 以内，方能满足最小净高的要求（图2）。 1.2 净宽不足 （1）存在问题
引物设计原则(必看)
mi引物设计原则 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 引物序列应该都是写成5-3方向的， Tm之间的差异最好控制在1度之内， 另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能
电泳涂装常见问题汇总
电泳涂装常见问题及解决方法一现象可能产生的原因对策 膜厚不足固体份低提高固体份 溶剂量少补加溶剂 电压低提高电压 温度低提高温度 水迹纯水不干净换纯水 温度过高降低湿度 固体份过低加漆 溶剂含量高适量超滤降低溶剂量起泡工作表所不洁净充分水洗 漆膜外观不丰满颜基比过高减少颜料补加，增加树脂含量 溶剂量少补加溶剂 槽液有泡沫进气漏气检查管道和泵是否泄漏 溢流槽液体过低提出高液体高度 固体份过高，槽液粘度太大降低固体份 涂膜粗糙颜料份高减少色浆，增加树脂 电导率高超滤，降低电导率针孔槽液温度低升高槽液温度 电导率过高超滤降低电导率 漆膜不均匀，破裂槽液温度高降低温度 电压高降低电压 电导率高超滤降低电导率 斑纹地图斑痕基材表面污染检查金属表面 漆迹清洗不够增加清洗 凹孔，缩孔杂质污染清除工件上杂质 颜料份低补加色浆 硬度烘烤时间延长烘烤时间 烘烤温度低升高温度 不够流平加溶剂 麻点液温低升温 溶剂少加溶剂 浓度低加漆 条纹表面外观不佳电压升高快 溶剂含量低槽液固含量低
电泳漆膜常见故障及其纠正方法 故障产生原因纠正方法 桔皮或表面粗糙电压过高降低电压 溶液温度高降低温度 固体分过高加水稀释槽液 极距太近加大极距 烘烤加温太快压缩空气吹干后再烘烤 PH 值过高用醋酸或乳酸调整 针孔或麻点固体分过低调整至工艺范围 PH 值过低降低溶液酸度 清洗水不干净换清洗水 溶液电导率太高超滤去掉杂质离子 膜厚太薄增加电泳电压或时间 电镀表面针孔压缩空气吹干后再烘烤 火山口或油点工件上附有油加强除油工序 槽液面有油渍防止槽液被油污染 颗粒污染加强循环过滤和超滤 电压高膜层厚降低电泳电压和时间彩虹膜层太薄增加电泳电压提高膜厚颜色不符膜层太厚或太薄选择合适的工作电压和时间 调配涂料时，颜色比例错严格按工艺配方配制电泳漆 溶剂太多，渗透能力差，膜层厚薄不 均 调整溶剂含量，使其符合工艺规范不规则图形前处理不彻底加强前处理工序 硬度不够烤烘时间短或温度低严格按工艺规范进行 涂装面点状或片状颜色差 异零件有针孔或砂眼杜绝不合格工件下槽色料乳化搅拌不匀加强电泳漆搅拌 表面有水液用压缩空气吹干 水滴未干即烘烤用压缩空气吹干 电泳前水洗不彻底加强入槽产零件的清洗 工件漆膜局部堆积PH太高用冰醋酸或乳酸调整然后超滤工件表面带碱性增加中和槽处理 工件油污未除尽加强除油工艺 漆膜附着力差工件表面带碱性增加中和槽处理 工件油污未除尽加强除油工艺 烘烤温度不够或时间太短提高烘烤温度，增加烘烤时间
PCR常见问题分析报告及对策
PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无 原因: 1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer对样品不合适 3.引物设计不当或者发生降解 4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间 问题2：非特异性扩增 现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带 原因： 1.引物特异性差 2.模板或引物浓度过高 3.酶量过多 4.Mg2+浓度偏高 5.退火温度偏低
6.循环次数过多 对策： 1.重新设计引物或者使用巢式PCR 2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数 问题3：拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 原因： 1.模板不纯 2.Buffer不合适 3.退火温度偏低 4.酶量过多 5.dNTP、Mg 2+浓度偏高 6.循环次数过多 对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 6.减少循环次数 问题4：假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因： 靶序列或扩增产物
的交*污染 对策： 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管 及加样枪头等均应一次性使用。 3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存 PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 假阳性 出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。 出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非
琼脂糖凝胶电泳常见问题分析
琼脂糖凝胶电泳常见问题分析
DNA凝胶电泳简介 一、实验原理 DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：
1、聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。 2、琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.5～0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp～50kb。电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。 二、琼脂糖凝胶 琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1，3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4连接的3，6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104～105的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。表1给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围。 表1不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围 由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，象NaClO4能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。 随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：（1）低熔点琼脂糖凝胶，用于DNA片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；（2）高熔点凝胶，可分离小于1kb的DNA片段，专用于PCR产物的分析；（3）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间；（4）适用于DNA大片段的分离。（5）其它类型。各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。
对建筑结构设计常见问题探讨
对建筑结构设计常见问题探讨 发表时间：2018-11-09T17:57:33.430Z 来源：《建筑学研究前沿》2018年第19期作者：秦浩 [导读] 设计工作需要由多工种多专业合作共同完成，因此结构设计工作不是孤立的。 山东建大工程鉴定加固研究院山东济南 250000 摘要：结构设计简而言之就是用结构语言来表达建筑师及其它专业工程师所要表达的东西。用基础，墙，柱，梁，板，楼梯，大样细部等结构元素来构成建筑物的结构体系，包括竖向和水平的承重及抗力体系。把各种情况产生的荷载以最简洁的方式传递至基础。 关键词：房屋建筑；结构设计；常见问题 设计工作需要由多工种多专业合作共同完成，因此结构设计工作不是孤立的。在设计方面，就需要与建筑设计或工艺设计、设备设计及建筑经济等工种紧密配合；在设计以外，它又跟很多专业，如结构材料、施工技术、分析理论和计算工具、检测手段等密切相关，因此，要提高结构设计水平，除做好自身工作以外，不管是正常的设计工作或者科学研究，都要取得这些工种与专业的支持。不要把结构设计工作自闭起来，应该认识到它的成果或者提高是与其他工种和专业的支持分不开的。 1.地基与基础方面 1.1对于独栋或单体数量较少的住宅，建设单位能委托地质勘察单位进行详细的地质勘察，能为工程设计提供较为详细的勘察技术资料，而成片的多层房屋建筑往往因为地勘费用的问题，地勘单位的探点不能严格按照有关技术要求布置，多栋建筑单体参考一个探点，使得实际的地质情况与地勘报告相差较大。地基与基础设计要做到合理、安全适用，设计人员必须依据详细、真实的地质勘察资料。 1.2软弱地基处理一般采用级配砂石换填，仅仅简单提出换填深度和最终地基承载力的要求，在技术上只是草草写上严格执行《地基处理规范》，而没有针对具体的建筑物画出详细的开挖边线，如轴线变化处，突出凹进墙体部分的开挖边线等，也没有明确砂石换填的应力扩散角具体数值。因此很多工程在地基基础施工中，不能切实有效地做好地基处理。 1.3在基础设计中，对于混凝土独立基础、筏板基础、条形基础，节点设计、构造设计中往往不明确应采用的具体技术参数，如锚固长度搭接长度是采用抗震的还是非抗震的，造成具体实施阶段的扯皮现象 1.4在高层混凝土结构的主体结构设计中，往往梁柱混凝土的等级差别较大，那么在梁柱节点处混凝土怎么进行处理，在设计图中往往不作清楚地技术交底。梁柱节点本身就是个受力复杂的节点，而由于设计缺陷，造成此部位成为一个薄弱点。 2楼板设计常见问题 2.1设计时为了计算方便或因对板的受力状态认识不足，简单地将双向板作用按单向板进行计算。使计算假定与实际受力状态不符，导致一个方向配筋过大，而另一方向配筋不足，致使板出现裂缝。 2.2楼板承受线荷载时弯矩计算问题。在民用建筑中，常在楼板上布置一些非承重隔墙，故楼板设计中，通常将该部分的线荷载换算成等效的均布荷载后，进行楼板的配筋计算。有些设计人员图省事，错误地将隔墙的总荷载附以该板块的总面积。这样会造成非承重隔墙分布宽度内配筋量不足，而此板块其它部分配筋过大，这样隔墙处楼板会出现裂缝。 2.3双向板有效高度取值偏大。双向板在两个方向均产生弯矩，由此双向板跨中正弯矩钢筋是纵横叠放，短跨方向的跨中钢筋应放在下面，长跨方向的跨中钢筋置于短跨钢筋的上面，计算时应用两个方向的各自的有效高度。一般长向的有效高度比短向的有效高度小 d（d 为短向钢筋的直径）有的设计者为图省事或对板受力认识不足，而取两上方向的有效高度一致进行配筋计算，致使长跨有效高度偏大，配筋降低，致使结构构件存在的质量隐患，甚至出现开明缝的现象。 3楼层平面刚度的问题 一些设计在缺乏基本的结构观念或结构布置、缺乏必要措施时，采用楼板变形的计算程序。结构设计存在着结构不安全或者某些部位或构件安全储备过大等现象。为了使程序的计算结果基本上能反映结构的真实受力状况，而不致于出现根本性的误差，设计时应尽可能将楼层设计成刚性楼面。要做到这一点，首先，应在建筑设计方案阶段就避免采用楼面有变形的平面，比如楼层大开洞、外伸翼块太长、块体之间成“缩颈”连接、凹槽缺口太深等。其次，要从结构布置和配筋构造上给予保证，对于使用功能确实必需的，或者建筑效果十分优越的建筑设计，如果其平面无法完全符合刚性楼板的假定，那么在结构设计时，可以通过增设连系梁板、洞口边加设暗梁边梁、提高连系梁板或暗梁边梁的配筋量、采用斜向配筋或双层配筋形式等方法，尽量满足刚性楼板的基本假设，或者弥补由于不是绝对的刚性楼板假定而产生的计算“误差”。 4砖混结构房屋中构造柱兼作承重柱用 在砖混结构中，构造不但能够提高墙体的抗剪能力，而且构造柱与固梁联结在一起，形成对砌体的约束，这对于限制墙体裂缝的开展，维持竖向承载力，提高结构的抗震性能有着重要的作用在当前结构设计中，构造柱经常被作为承重柱使用，这种作法将引起以下几个问题。 4.1构造柱作为承重柱使用后，使得构造柱提前受力，这不但会降低构造柱对彻底的拉结和约束作和，而且结构一旦遭遇地震作用时，在构造柱位置必然形成应力集中，首先破坏这样构造柱不但起不到其应有的作用，反而成为房屋结构中的一个薄弱的部位。 4.2构造柱一般生根于地圈梁中，没有另设基础，构造柱兼作承重柱使用后，柱底基础的抗冲切、抗弯部及局部承压强度必然不能满足要求。柱底基础一旦发生冲切或局部承压被出现裂缝。本文建议承重大梁下的柱子应按承重柱设计。若梁上荷载和跨度都比较小时，构造柱也可布置于梁下，但此时必须按不考虑构造柱作用来验算下墙体的局部承压和抗弯强度。经验算满足，方可在粱下布置构造柱。 5承重柱截面高度设计过小 这种情况多发生于六度抗震设防区。一些结构设计人员误认为六度设防就是不设防，为受力分析方便，他们故意把柱子的截面高度设计得过小，使梁柱的线刚度比加大。把梁简化为铰支梁，梁柱按轴心受压计算。这种做法虽然易于进行结构受力分析，但却给房屋结构埋下了隐患。因为，这样做忽略了梁柱间的刚结作用，加之柱截面的配筋都较小，结构一旦受力后，柱顶抗弯刚度必然不足，从而柱子在梁底附近将会出现一条或多条水平裂缝，形成塑性饺。这样在正常使用情况下，柱子已开始带铰工作。这不但影响了房屋的耐久性，而且也常常引起用户的恐惧心理。更为严重的是，这样的结构一旦遭遇地震作用，将会倒塌，这违背了现行抗震规范中“强柱弱梁”的设计原则。
引物设计注意事项
引物设计 首先引物与模板的序列要紧密互补， 其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构， 再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。 引物设计应注意如下要点： 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 (22)bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，如GGG或CCC，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同 的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 非配对结构最好出现在引物中间。 另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败，3’端尽量不含互补碱基。 5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。 上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。 Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱 基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5kcal/mol）易导致产 生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
电泳常见问题及解决方法
阴极电泳常见问题及解决方法 一、颗粒 （1）现象 在烘干后的电泳涂膜表面上有手感粗糙的、较硬的粒子，或肉眼可见的细小痱子，往往被涂物的水平面较垂直面严重，这种漆膜病态称为颗粒。 （2）产生原因 ①CED槽液PH值偏高，碱性物质混入，造成槽液不稳定，树脂析出或凝聚。 ②槽内有沉淀“死角”和裸露金属处。 ③电泳后清洗液脏、含漆量过高，过滤不良。 ④进入的被涂物面及吊具不洁，磷化后水洗不良。 ⑤在烘干过程中落上颗粒状污物。 ⑥涂装环境脏。 ⑦补给涂料或树脂溶解不良，有颗粒。 （3）防治方法 ①将CED槽液的PH值控制在下限，严禁带入碱性物质，加强过滤，加速槽液的更新。 ②消除易沉淀的“死角”和产生沉积涂膜的裸露金属件。 ③加强过滤，推荐采用精度为25μm的过滤元件，养活泡沫。 ④确保被涂面清洁，不应有磷化沉渣，防止二次污染。 ⑤清理烘干室和空气过滤器。 ⑥保持涂装环境清洁，检查并消除空气的尘埃源。 ⑦确保新补涂料溶解良好，色浆细度在标准范围内。 二、缩孔（陷穴） （1）现象 在湿的电泳涂膜上看不见，当烘干后漆膜表面出现火山口状的凹坑，直径通常为0.5~3.0mm,不露底的称为陷穴、凹洼、露底的称为缩孔，中间有颗粒的称为“鱼眼”。产生这一弊病的主要原因是电泳湿涂膜中或表面有尘埃，油污与电泳涂料不相溶的粒子，成为陷穴中心，使烘干初期的湿漆膜流展能力不均衡，而产生涂膜缺陷。 （2）产生原因 ①被涂物前处理脱脂不良或清洗后又落上油污、尘埃。 ②槽液中混入油污，漂浮在液面或乳化在槽液中。 ③电泳后冲洗液混入油污。 ④烘干室内不净，循环风内含油分。 ⑤槽液的颜基比失调，颜料含量低的易产生缩孔。 ⑥涂装环境脏、空气可能含有油雾、漆雾，含有机硅物质等污染被涂物或湿涂膜。 ⑦补给涂料有缩孔或其中树脂溶解不良，中和不好。 （3）防治方法 ①加强被涂物的脱脂工序，确保磷化膜不被二次污染。