第7章 重组DNA药物

主要基因工程产品的研制、开发、上市时间
产品
首次克隆
表达时间
首次进入 国家 日本 美国 用途 治疗巨人症 治疗糖尿病 1982 欧洲 市场时间 国家/地区
人生长激素释放抑制素（SRM) 1977 人胰岛素 人生长激素（HGH) 人α干扰素（ α－IFN) 乙肝疫苗 人白细胞介素－2 人促红细胞生成素 人粒细胞集落刺激因子 人组织纤溶酶原激活剂 （t-PA) 1978
2）胰岛素(Insulin, Ins) 1921年，Banting FG等从胰脏中分离 1955年，Sanger F测序 1965年，我国完成结晶牛胰岛素全合成 1979年，Rutter W等克隆了胰岛素基因 1982年，第一个重组人胰岛素批准上市
胰岛素的结构及生物合成 胰岛素原与胰岛素 人胰岛素的生产方法 产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略

效率高、产量大 周期短、成本低
工艺稳定、质量可控
缺点是易形成包含体
1）、干扰素（IFN-α、β、γ） 1957年Isaccs等发现病毒干扰现象，即病毒感 染的细胞能产生一种因子，作用于其他细胞干 扰病毒复制，因而命名为干扰素。 根据产生干扰素细胞的来源、理化性质和生物 活性等差异，可分为α、β、γ等3种，其中 IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。
如： MTT法: MTT formazan (蓝紫色) 琥珀酸脱氢酶 干扰素类蛋白：可用细胞毒抑制试验来测定干 扰素的体外活性。
五、重要的重组DNA药物
（一）利用重组大肠杆菌生产医用蛋白或多肽
代表产品：重组人胰岛素、重组人生长激素、重组人干扰素、 重组人白细胞介素、重组人集落刺激因子、重组抗体及其片 断等。
2）、纯度分析：SDS-PAGE, CE, IEF, HPLC 3）、生物活性测定 4）、残余杂质检测 宿主细胞蛋白含量、宿主细胞DNA、残余抗生素等 5）、安全性检测 无菌实验、热原实验、毒性实验、免疫原性检查
A 体内生物学活性测定方法 生物学模型 生长激素 B 体外生物学活性测定方法
大鼠 脑垂体
1985年，美国FDA批准由大肠杆菌发酵生产 的重组人生长激素上市，随后各种途径生产 的重组人生长激素迅速充斥市场。1997年， 仅美国Genentech和Ely Lily两家公司的重组 人生长激素年产量已达20kg，年销售额超过 3.5亿美元。 人生长激素的结构与性质 重组人生长激素工程菌的构建

注意：上游DNA重组的设计必须以简化下游操作工艺和装备 为指导思想；而下游过程则是上游基因重组蓝图的体现和保 证，这是基因工程产业化的基本原则。
1、水解→ 与载体连接→转链合成 → cDN）、合成法 4）、PCR法
DNA的体外重组（切与连）
重组DNA分子转化 （转）
转化子的筛选与鉴定（选）
外源基因的大规模表达和分离纯化
产品的检验和制剂制备
二、基本过程
上游阶段： 实验室 获得目的基因、酶切和酶连、插入适当载体、转入 宿主细胞、复制、目的基因分析确证、表达、筛选 合适表达系统等 下游阶段：将实验室成果产业化 发酵参数确定、新型生物反应器研制、高效分离介质 及装置开发、生物传感器设计制造、电子计算机优 化控制、产品质量控制
将蛋白质从结构不规则、无 活性的状态，恢复到有唯一 立体结构、有生物活性的 状态的过程称为蛋白质复性。

2）、表达载体 要求： a、能独立复制 b、有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记 c、具有有效运载外源基因的能力，能携带大 小不同的外源基因 d、容易控制，在细胞内稳定性高，安全可靠。
如大肠杆菌的pBV220系统，为温度诱导表 达载体，已成功用于IL-2，IL-3，IFN等 pET系统，最有潜力的系统，可用乳糖代替 IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖），产物可 达细胞总蛋白20~30%，表达量可达总蛋白 50%。
◎针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型
等电点处于极端区域（大于8或小于5）的重组蛋白应首选 离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白； 重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲和 层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离 常数应在合适的范围内（10－8～10－4mol/L）; 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；
种子克隆纯而且稳定，在培养工程中工
程菌不应出现无突变或质粒丢失的现象 种子批系统 工作细胞库

尽量去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋白 等杂质，并避免在纯化过程带入有害物质 纯化每一步应测定纯度、计算提纯倍数、收 率等等
1）、产品的鉴别
氨基酸组成分析： 肽图分析： N末端和C末端氨基酸测序： 蛋白质二硫键的分析： 重组蛋白相对分子量： 等电点的测定：
3’
PCR
3’ 3’
PCR PCR
5’ 5’ 5’ 引物C 3’
PCR
混合,变性,退火
3’
5’
5’ 3’ 5’ 3’
5’ 3’
+ 3’
5’
3’
5’
3’ 5’
DNA聚合酶
用引物B和C作PCR
3’ 5’
化学合成法 在已知DNA序列或多肽的一般结构时， 如链长在 60bp～100bp可用化学合成法直 接合成DNA。
2、基因表达
1）、选择宿主细胞 原核 大肠杆菌：生长快；遗传研究深入；产品多为 胞内（包含体）或周质中；不能糖基化修饰。 需注意内毒素污染。 枯草芽孢杆菌： 分泌力强，不形成包含体；不 修饰；胞外酶可能会降解产物 链霉菌：分泌能力强；不致病，安全；有糖基 化能力。
优点：易大量生产，成本低，周期短 缺点：多为胞内表达、提取困难，易生 成包含体、含起始密码 Met(AUG) ，有内 毒素毒性
＃ 应首先选择能除去含量最多杂质的方法
＃ 应尽量选择高效的分离方法
＃ 应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最 后阶段
◎合适分离纯化介质的选择
常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和 Sepharose。理想的分离纯化介质应具有下列 性质： ＃ 对目标蛋白具有较高的分辨效率 ＃ 对目标蛋白不会造成变性 ＃ 化学性能和机械性能稳定，重复性好 ＃ 价格低廉
3）生长激素 1944年，李卓浩等从牛垂体中分离出牛生长激素 1956年，从人垂体中分离出hGH 1969年，hGH序列报道 临床上用于垂体性侏儒症。1956~1985年，只 能从人尸体垂体中分离纯化。但至1985年，共 发现50多例克-雅氏症，5人病亡，研究结果证 实由垂体来源的生长激素污染有朊病毒。 1985年，垂体来源的被禁用，同年，rhGH上市。
◎分离纯化过程的规模化
蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大 规模产业化过程未必合适，如： ＃ 实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破 细胞壁）
＃ 实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超 速离心）
因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于 生产工艺。
四、质量控制

1、原材料质量控制：
2、培养过程质量控制 3、纯化工艺质量控制
1979
1980 1983 1984
美国
美国 美国 日本
治疗侏儒症
治疗病毒感染症 预防乙型肝炎 治疗肿瘤 治疗贫血 治疗中性白细胞 减少症 治疗血栓症
1985
1985 1986 1989 1988 1991
美国
美国 欧洲 欧洲 欧洲 美国
1987
美国
DNA重组药物制造的主要步骤
获得目的基因 载体的选择 受体细胞的选择
凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；
径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的 一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越 性。
◎多种分离纯化技术的联合运用 在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种 技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列 原则： ＃ 应选择不同分离纯化机理的方法联合使用
大肠杆菌与真核细胞表达系统比较
大肠杆菌:
发酵 包含体 复性 纯化 目的蛋白
真核细胞:
发酵 上清液 纯化 目的蛋白
大肠杆菌表达的重组蛋白易形成包含体
• 高效表达的目的蛋白
在大肠杆菌内形成大
• 因无法有效的解决复
性问题，在美国每年 造成的经济损失就达 几十亿美元
包含体电镜图
量无活性包含体。
蛋白质复性概念
1986年，FDA批准Roch公司的重组IFNα2a和Schering公司的重组IFN-α2b，重组 IFN-β、γ分别在1990年和1993年上市。 我国中国预防医学科学院病毒学研究所侯 云德等发现中国人受病毒攻击产生的干扰 素主要为IFN-α1b型，1992年我国第一个 基因工程药物IFN-α1b获得国家一类新药 证书。




(a) AB链分别表达法 体外折叠成功率低，通常只 有10～20％ (b) 人胰岛素原表达法 由于C肽的存在，胰岛素原 在复性条件下能形成天然的空间构象，为三对二 硫键的正确配对提供了良好的条件，使得体外折 叠率高达80％以上 目前Ely Lily用这种工艺路线 年产几十吨的重组人胰岛素，其经济效益相当可 观。 (c) AB链同时表达法
4、PCR法或逆转录PCR（RT-PCR）
典型PCR反应包括 ①模板变性 94℃以上（1～2′） ②退火 50～55℃（1～2′） ③延伸 72℃（1～2′） 在高温聚合酶作用下， 以DNA单链为模板， 由引物起始从5′→3′ 延伸。
靶DNA的扩增
5’ (a) (b) 引物2 5’ 3’ 3’ 5’ 引物1 3’ 引物1互补链 5’
4、目标产品质量控制
保证编码DNA序列正确 要了解以下特性： A、目的基因来源、克隆过程、序列 B、表达载体名称、结构、遗传特性及酶切图 谱、抗生素标记等 C、宿主名称、来源、传代历史、检定结果及 生物学特征 D、载体引入宿主方式、及载体再宿主中状态 E、插入基因于表达载体两侧控制区核酸序列 F、启动和控制克隆基因表达的方法及水平