抗体标记标准化步骤

抗体标记标准化步骤
以h-FABP抗体（NP24）标记AE、BIO为例
标记步骤：
①300ul的反应体系
1、抗体解冻后，混匀离心10s，取50ul于离心管，然后取1ul AE（原倍AE不需要吹打）于离心管壁，最后用99ul标记液CB将AE向下冲散混合(如果AE 已预先和抗体混合，弃用)；
2、37℃水浴标记1小时后取出，在此之前将透析袋提前浸泡，然后将离心管内液体吸出，加入至透析袋，再加150ul 20mM PBS，混匀后，扎好透析袋进行透析（透析液为PH 7.4 20mM PBS，体积为2L）；
3、4-8小时更换透析液一次，在每次换透析液前要先测量上一次透析液中残留AE发光值，当测量发光值在3000左右即可停止透析；
4、收集：将透析袋里的抗体取出至EP管中，用20mM PBS补充至一个定值，按标记抗体：抗体储存液=4:1的体积比例加入抗体储存液，再按加完储存液后的体积1：1加入甘油，然后贴好标签，并加上透明胶带，最后放置-20℃冰箱保存；
5、以标记好的抗体NP24-AE和NP24-BIO进行样品测试，验证标记抗体是否可用，并考察信噪比。

② 150ul的反应体系
1、抗体解冻后，混匀离心10s，取50ul于离心管，然后取1ul AE（原倍AE不需要吹打）于离心管壁，最后用49ul标记液CB将AE向下冲散混合(如果AE 已预先和抗体混合，弃用)；
2、37℃水浴标记1小时后取出，在此之前将透析袋提前浸泡，然后将离心管内液体吸出，加入至透析袋，再加50ul 20mM PBS，混匀后，扎好透析袋进行透析（透析液为PH 7.4 20mM PBS，体积为2L）；
3、4-8小时更换透析液一次，在每次换透析液前要先测量上一次透析液中残留AE发光值，当测量发光值在3000左右即可停止透析；
4、收集：将透析袋里的抗体取出至EP管中，用20mMPBS补充至一个定值，按标记抗体：抗体储存液=4:1的体积比例加入抗体储存液，再按加完储存液后的体积1：1加入甘油，然后贴好标签，并加上透明胶带，最后放置-20℃冰箱保存；
5、以标记好的抗体NP24-AE和NP24-BIO进行样品测试，验证标记抗体是否可用，并考察信噪比。

所用试剂：
标记液：PH 9.5 50mM CB
抗体储存液：PH 7.4 0.1M PBS+2％BSA+1‰Tween-20+2‰NaN3
注意事项：
1、加AE和BIO时应注意，应将AE和BIO加至离心管壁上，然后用CB将其冲散，最后与抗体混合，如果AE或BIO从管壁滑落与抗体结合，应弃用；
2、透析袋要事先剪好，然后放在纯水中浸泡；
3、扎完透析袋要用手捏一下看透析袋是否扎紧；
4、每换一次透析液，应用纯水或PBS将透析袋冲洗一遍，将透析袋上的AE和BIO冲掉，然后再重新加满透析液进行透析。

5、150ul体系，透析袋应5-6cm透析袋，浸泡在500ml的大烧杯中，浸泡过程中应搓揉透析袋。