层析和膜技术在生物制药中应用剖析
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层析和膜技术在生物制药中应用剖析
二. 凝胶层析
凝胶层析，是指样品混合物通过一定孔经的凝胶固 定相，由于流经体积的差异，使不同分子量的组分 得以分离的一种分离技术。
因整个层析过程与过滤相似也称凝胶过滤。 又由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，也称排
阻层析。或称凝胶扩散层析。 凝胶的每个颗粒的细微结构如同一个筛子，小的分
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
凝胶层析的应用:分离纯化
子可以进入凝胶网孔，大的分子被排阻于凝胶颗粒 之外，因而也称分子筛层析。
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
凝胶层析分离原理
分子筛理论最容易理解，当含 有大小分子的混合物品流给凝 胶层析柱时，各组分随洗脱液 的流动而移动. 大分子进入不了 颗粒内部，最先流出；中分子 部分地进入颗粒，流出速度中 等；小分子进入所有颗粒内部， 移动速度慢，最后流出。整个 样品接分子量大小顺序先后流 出层析柱，从而达到分离。
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
凝胶层析分离原理
凝胶层析的总床体积（V t），可分为三个组分，即
Vt
Vo
Vi
Vg
4
d 2h
Vo：凝胶颗粒之间的液相体积，称外水体积；
Vi：凝胶颗粒内部所含的液相体积，称内水体积；
Vg：凝胶颗粒本身的体积；
d：层析柱直径；
h：凝胶柱床之高。
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
凝胶层析的应用
脱盐 浓缩 去热原 分子量测定 纯化
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
凝胶层析的应用:脱盐和浓缩
脱盐和浓缩属类分离，选择凝胶使大分子组为全排阻，小 分子组为全渗入（Kd=1）。
脱盐用的凝胶多用大粒度的、高交联度的凝胶。 ∵交联度大，凝胶颗粒的强度较好； 粒度大，柱层操作比较便利，流速也高。
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
凝胶层析的应用
分级分离，将分子量相差不很大的大分子物质加 以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白。
对于这种分子量相近的物质的分离常常选用排阻
限略大于样品中最高分子量的凝胶，即O≤Kd≤1。
如果样品中含有3个组分的话，最好一个接近全排 阻，另一个接近全渗入，第三个为部分渗入，且 分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的1/3。
凝胶层析分离原理
当将含有三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝 胶柱进行分离，然后以洗脱体积为横坐标，各物质浓度为 纵座标，即得下图的洗脱曲线。
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
凝胶层析的应用
凝胶层析目的（或称分离形式）一般有二种：分 组分离和分级分离。
分组分离亦称类分离，其目的是将分子量极为悬 殊的两类物质分开，如蛋白质与盐的分离,常用 Sephadex G-25，因为其分离范围是1,0005,000，被分离的两组物质的分子量正好落在分 离范围的两侧，大分子组为全排阻，而小分子组 为全渗入，其Kd值的差可达最大值1。
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
离子交换层析技术
离子交换反应：
R — S O 3 — X + + Y + = R — S O 3 — Y + + X +
离子交换剂与交换离子间的作用是由静电引力而产生的， 是一个可逆的反应过程，当这个反应达到动态平衡时，其 平衡点随着pH、温度、溶剂的组成及交换剂本身性质的改 变而变化。例如，向平衡体系中加入过量的X+离子，反应 倾向于生成R-SO3-X+。
洗脱多为易挥发盐的缓冲溶液； ∵用水洗脱时，有些蛋白质脱盐后溶解度下降，造成被凝胶 粒吸附甚至以沉淀状态析出。
样品体积最好不大于内水体积的三分之一，以便得到理想 的脱盐效果。
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
凝胶层析的应用:脱盐和浓缩 方法：
柱层析 包埋法 样品置于透析袋中埋入干胶颗粒堆
内，经过相当时间后，样品中的盐与水分 一道为干胶所吸收。 直接投入法 即将一定量的干胶投入盛样品 容器或直接使样品溶液从干胶柱上流下。
层析技术在 生物制药中的应用
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
一. 离子交换层析技术
定义：利用溶液中各种带电颗粒与离子交 换剂之间结合力的差异进行物质分离的操 作称离子交换法。
离子交换剂由惰性的不溶性载体，功能基 团和平衡离子组成。
平衡离子带正电荷的为阳离子交换剂，平 衡离子带负电荷的为阴离子交换剂，可见 离子交换剂是一类具有活性基团的荷电固 相颗粒。
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
离子交换层析技术
由于待分离的溶质分子带有不同性质的 电荷和不同电荷量，因而在作为固定相的 离子交换剂和流动相的洗脱液之间发生可 逆交换作用，并通过调节pH值、或改变同 性离子的浓度等方法，使溶质分子移动的 速度发生变化，从而达到分离的目的。
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
离子交换层析的应用
粗卵蛋白的分级分离
卵蛋白中：主要有卵清蛋白 54-57%（pI4.5)；蓝清蛋白 12-15%（pI6.1)；卵粘蛋白 3-4%(pI4.7)。
卵白过滤，用 polybuffer74稀释，离心， 上PBE94柱，以0.025mol/L 咪唑-HCl (pH7.2)平衡，用 1:10polybuffer74洗脱，分 辨率良好。
离子交换层析的应用
如庆大霉素，小诺霉素的提炼，应用了离子交换技术。
H+ 中 和
732树 脂
庆 大 发 酵 液
中 性 Solu
饱 和 树 脂
[静 态 吸 附 ]
洗Βιβλιοθήκη Baidu涤 、 洗 脱
洗 脱 液 进 一 步 处 理
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
庆大霉素的提炼
酸化的目的在于将庆大霉素从菌丝体中释放出来，然后为了 便于离子交换，将酸化液中和，再于中性溶液中投入732强酸 性阳离子树脂。因为庆大霉素属于碱性抗生素，系有机碱， 能与多种酸成盐，在水溶液中以离子状态G+存在，可以为阳 离子树脂所吸附，对吸附了庆大霉素的732树脂进行洗涤，先 用稀酸洗至无Ca2+、Mg2+，接着用无盐水洗至无Cl-，然 后用稀氨洗去小组分杂质，最后用浓氨进行洗脱，洗脱液 （解吸液）用711阴离子树脂进行脱色，然后经浓缩，转盐、 活性炭脱色，喷雾干燥即得庆大霉素成品。
二. 凝胶层析
凝胶层析，是指样品混合物通过一定孔经的凝胶固 定相，由于流经体积的差异，使不同分子量的组分 得以分离的一种分离技术。
因整个层析过程与过滤相似也称凝胶过滤。 又由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，也称排
阻层析。或称凝胶扩散层析。 凝胶的每个颗粒的细微结构如同一个筛子，小的分
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
凝胶层析的应用:分离纯化
子可以进入凝胶网孔，大的分子被排阻于凝胶颗粒 之外，因而也称分子筛层析。
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
凝胶层析分离原理
分子筛理论最容易理解，当含 有大小分子的混合物品流给凝 胶层析柱时，各组分随洗脱液 的流动而移动. 大分子进入不了 颗粒内部，最先流出；中分子 部分地进入颗粒，流出速度中 等；小分子进入所有颗粒内部， 移动速度慢，最后流出。整个 样品接分子量大小顺序先后流 出层析柱，从而达到分离。
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
凝胶层析分离原理
凝胶层析的总床体积（V t），可分为三个组分，即
Vt
Vo
Vi
Vg
4
d 2h
Vo：凝胶颗粒之间的液相体积，称外水体积；
Vi：凝胶颗粒内部所含的液相体积，称内水体积；
Vg：凝胶颗粒本身的体积；
d：层析柱直径；
h：凝胶柱床之高。
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
凝胶层析的应用
脱盐 浓缩 去热原 分子量测定 纯化
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
凝胶层析的应用:脱盐和浓缩
脱盐和浓缩属类分离，选择凝胶使大分子组为全排阻，小 分子组为全渗入（Kd=1）。
脱盐用的凝胶多用大粒度的、高交联度的凝胶。 ∵交联度大，凝胶颗粒的强度较好； 粒度大，柱层操作比较便利，流速也高。
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
凝胶层析的应用
分级分离，将分子量相差不很大的大分子物质加 以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白。
对于这种分子量相近的物质的分离常常选用排阻
限略大于样品中最高分子量的凝胶，即O≤Kd≤1。
如果样品中含有3个组分的话，最好一个接近全排 阻，另一个接近全渗入，第三个为部分渗入，且 分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的1/3。
凝胶层析分离原理
当将含有三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝 胶柱进行分离，然后以洗脱体积为横坐标，各物质浓度为 纵座标，即得下图的洗脱曲线。
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
凝胶层析的应用
凝胶层析目的（或称分离形式）一般有二种：分 组分离和分级分离。
分组分离亦称类分离，其目的是将分子量极为悬 殊的两类物质分开，如蛋白质与盐的分离,常用 Sephadex G-25，因为其分离范围是1,0005,000，被分离的两组物质的分子量正好落在分 离范围的两侧，大分子组为全排阻，而小分子组 为全渗入，其Kd值的差可达最大值1。
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
离子交换层析技术
离子交换反应：
R — S O 3 — X + + Y + = R — S O 3 — Y + + X +
离子交换剂与交换离子间的作用是由静电引力而产生的， 是一个可逆的反应过程，当这个反应达到动态平衡时，其 平衡点随着pH、温度、溶剂的组成及交换剂本身性质的改 变而变化。例如，向平衡体系中加入过量的X+离子，反应 倾向于生成R-SO3-X+。
洗脱多为易挥发盐的缓冲溶液； ∵用水洗脱时，有些蛋白质脱盐后溶解度下降，造成被凝胶 粒吸附甚至以沉淀状态析出。
样品体积最好不大于内水体积的三分之一，以便得到理想 的脱盐效果。
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
凝胶层析的应用:脱盐和浓缩 方法：
柱层析 包埋法 样品置于透析袋中埋入干胶颗粒堆
内，经过相当时间后，样品中的盐与水分 一道为干胶所吸收。 直接投入法 即将一定量的干胶投入盛样品 容器或直接使样品溶液从干胶柱上流下。
层析技术在 生物制药中的应用
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
一. 离子交换层析技术
定义：利用溶液中各种带电颗粒与离子交 换剂之间结合力的差异进行物质分离的操 作称离子交换法。
离子交换剂由惰性的不溶性载体，功能基 团和平衡离子组成。
平衡离子带正电荷的为阳离子交换剂，平 衡离子带负电荷的为阴离子交换剂，可见 离子交换剂是一类具有活性基团的荷电固 相颗粒。
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
离子交换层析技术
由于待分离的溶质分子带有不同性质的 电荷和不同电荷量，因而在作为固定相的 离子交换剂和流动相的洗脱液之间发生可 逆交换作用，并通过调节pH值、或改变同 性离子的浓度等方法，使溶质分子移动的 速度发生变化，从而达到分离的目的。
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
离子交换层析的应用
粗卵蛋白的分级分离
卵蛋白中：主要有卵清蛋白 54-57%（pI4.5)；蓝清蛋白 12-15%（pI6.1)；卵粘蛋白 3-4%(pI4.7)。
卵白过滤，用 polybuffer74稀释，离心， 上PBE94柱，以0.025mol/L 咪唑-HCl (pH7.2)平衡，用 1:10polybuffer74洗脱，分 辨率良好。
离子交换层析的应用
如庆大霉素，小诺霉素的提炼，应用了离子交换技术。
H+ 中 和
732树 脂
庆 大 发 酵 液
中 性 Solu
饱 和 树 脂
[静 态 吸 附 ]
洗Βιβλιοθήκη Baidu涤 、 洗 脱
洗 脱 液 进 一 步 处 理
层析和膜技术在生物制药中应用剖析
庆大霉素的提炼
酸化的目的在于将庆大霉素从菌丝体中释放出来，然后为了 便于离子交换，将酸化液中和，再于中性溶液中投入732强酸 性阳离子树脂。因为庆大霉素属于碱性抗生素，系有机碱， 能与多种酸成盐，在水溶液中以离子状态G+存在，可以为阳 离子树脂所吸附，对吸附了庆大霉素的732树脂进行洗涤，先 用稀酸洗至无Ca2+、Mg2+，接着用无盐水洗至无Cl-，然 后用稀氨洗去小组分杂质，最后用浓氨进行洗脱，洗脱液 （解吸液）用711阴离子树脂进行脱色，然后经浓缩，转盐、 活性炭脱色，喷雾干燥即得庆大霉素成品。