GFP融合蛋白的检测
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
译产物中很大一部分是以前体蛋白形式存在，往往有 蛋白分子定位信号，可引导蛋白质在胞内定位。
蛋白质在细胞内的定位问题，是细胞生物学研究的中 心问题，也是分子生物学研究的热门话题。理解某些 蛋白质的定位从而分析探索其生物学功能，意义重大。
蛋白质定位
蛋白质的亚细胞定位常用方法：
蔗糖密度梯度离心；免疫胶体金标记；免疫荧 光；与GFP构建融合基因表达融合蛋白；多糖 序列分析等。
绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein，GFP)
2008年诺贝尔化学奖 GFP的结构特点 GFP的发光机理 GFP的荧光特性 GFP的优点 GFP的改进 GFP的应用
2008年诺贝尔化学奖
日裔美国科学家 下村修 美国科学家 马丁·查尔非 美国华裔科学家 钱永健
GFP的改进
除去GFP基因中隐蔽型内含子 消除编码蛋白的积累 将GFP定位到特定细胞器中 改变碱基组分 更换GFP生色团氨基酸 插入植物内含子 增加增强子和更换强启动子
GFP的应用
蛋白质定位 作为报告基因 药物筛选 融合抗体 生物传感器 其他方面
脱氢酪氨酸、甘氨酸，为构成GFP生色团的核 心
GFP的结构特点
晶体结构
空间结构特点：
由 11 条β桶状结构(β- barrel) 绕成的一个圆柱体，直径约 3nm，长约4nm。
一条α螺旋缠绕在圆柱体Baidu Nhomakorabea 轴位置
生色团附着在α螺旋上，几 乎完美地包埋于圆柱体中心
这种方式被称为β罐 (β-can)
395 471-490
513 385 385 488
发射峰
509 502-511
527 445 510 507
GFP的优点
易于检测 荧光稳定 无毒害 通用性 易于构建载体 可进行活细胞定时定位观察 易于得到突变体
GFP的改进
尽管GFP作为报告基因或分子探针有许多无可 比拟的优点，但是野生型GFP（wt GFP）具有 一定的缺点： GFP有两个激发峰影响了其特异性，并且长波 激发峰强度较小，不易观察 GFP合成及折叠产生荧光的过程慢，蛋白质折 叠受温度影响大，表达量较低 GFP在某些植物细胞中并不表达
GFP融合蛋白的构建
应用亚克隆技术，将目的基因与GFP基因构成 融合基因，通过愈伤组织转化法、基因枪、显 微注射、电激转化等方法转化到合适的细胞， 利用目的基因的基因表达调控机制，如启动子 和信号序列来控制融合基因的表达，最终得到 融合蛋白，可以研究目的蛋白的定位。
目的基因 gfp 基因
融合基因
转化
GFP的荧光特性
通过对GFP的结构和生化特性进行改造，已获得许多 具有不同发射峰和激发峰的突变体，使GFP的荧光强 度和作为报告基因的检测灵敏度大大提高。
GFP及其主要突变体的荧光特征 nm
项目
激发峰
野生型（wt-GFP） 红移突变体RSGFP 黄绿突变体YGFP
蓝色突变体BFP 增强型突变体OGFP 半衰期短的突变体
蛋白质定位的方法
本节课的主要内容
蛋白质定位 绿色荧光蛋白 绿色荧光蛋白融合蛋白的构建 绿色荧光蛋白融合蛋白的检测 其它荧光蛋白简介
蛋白质定位
真核细胞具有复杂的亚细胞结构。每种细胞器都有一 组特定的蛋白。
真核细胞除叶绿体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大 部分蛋白是在胞浆或糙面内质网合成，最终运至不同 地点，形成成熟的蛋白质并行使功能。
GFP的发光机理
GFP的生色团是GFP发出荧光的物质基础。
实质：由第65、66、67位的丝氨酸—脱水酪氨酸—甘氨酸
形成对羟苯甲基咪唑环酮
GFP的荧光特性
GFP的最大吸收峰为 395nm(紫外)，并有一个 479nm的副峰(蓝光)；发 射光谱最大峰值为 509nm(绿光)
尽管450～490nm(蓝光) 是GFP的副吸收峰，但 由于长波能量低，细胞 忍受能力强，因此更适 合于活体检测。
诺贝尔奖委员会将化学奖授予美籍日裔科学家下村修、美国科学家马丁·沙 尔菲和美籍华裔科学家钱永健三人，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋 白质技术。
2008年诺贝尔化学奖
下村修：于1962年在水母Aequorea victoria发现 并分离得到GFP，并发现该蛋白在紫外线下会 发出明亮的绿色。
马丁·查尔菲 ：证明了GFP作为多种生物学现 象的发光遗传标记的价值，这一技术被广泛运 用于生理学和医学等领域。
钱永健：让人们理解了GFP发出荧光的机制。 同时拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色， 使得同一时刻跟踪多个不同的生物学过程成为 现实。
GFP的结构特点
一级结构
GFP由238个氨基酸残基组成 ,分子量为26.9kD GFP的生色团位于氨基酸序列64~69位 GFP的第65、66、67位氨基酸分别是丝氨酸、
表达
检测
GFP融合蛋白的构建
最关键的就是：要尽可能的不影响目的蛋白的定 位和功能。具体蛋白要具体分析。
将目的基因与gfp基因融合有以下几种方式: 将gfp置于目的基因后面，即目的基因-gfp 将gfp置于目的基因前面，即gfp-目的基因。
GFP融合蛋白的构建
注意事项：
两个基因之间用Linker连接。 在两个基因交接处可以增加一段核苷酸(3的倍数) ，
如增加几个为甘氨酸或赖氨酸等编码的三核苷酸。目 的是使得两个基因的蛋白产物的空间结构相互影响较 小，有利于GFP发光。 前一基因必须要有起始密码，而不能带有终止密码； 后一基因要保证有终止密码。
GFP的荧光特性
GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似， 因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样 适用于GFP观察。
GFP荧光极其稳定，在激发光照射下的抗光漂白能力 比荧光素强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定。
GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP 转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中， GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响 GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生 物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。
蛋白质在细胞内的定位问题，是细胞生物学研究的中 心问题，也是分子生物学研究的热门话题。理解某些 蛋白质的定位从而分析探索其生物学功能，意义重大。
蛋白质定位
蛋白质的亚细胞定位常用方法：
蔗糖密度梯度离心；免疫胶体金标记；免疫荧 光；与GFP构建融合基因表达融合蛋白；多糖 序列分析等。
绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein，GFP)
2008年诺贝尔化学奖 GFP的结构特点 GFP的发光机理 GFP的荧光特性 GFP的优点 GFP的改进 GFP的应用
2008年诺贝尔化学奖
日裔美国科学家 下村修 美国科学家 马丁·查尔非 美国华裔科学家 钱永健
GFP的改进
除去GFP基因中隐蔽型内含子 消除编码蛋白的积累 将GFP定位到特定细胞器中 改变碱基组分 更换GFP生色团氨基酸 插入植物内含子 增加增强子和更换强启动子
GFP的应用
蛋白质定位 作为报告基因 药物筛选 融合抗体 生物传感器 其他方面
脱氢酪氨酸、甘氨酸，为构成GFP生色团的核 心
GFP的结构特点
晶体结构
空间结构特点：
由 11 条β桶状结构(β- barrel) 绕成的一个圆柱体，直径约 3nm，长约4nm。
一条α螺旋缠绕在圆柱体Baidu Nhomakorabea 轴位置
生色团附着在α螺旋上，几 乎完美地包埋于圆柱体中心
这种方式被称为β罐 (β-can)
395 471-490
513 385 385 488
发射峰
509 502-511
527 445 510 507
GFP的优点
易于检测 荧光稳定 无毒害 通用性 易于构建载体 可进行活细胞定时定位观察 易于得到突变体
GFP的改进
尽管GFP作为报告基因或分子探针有许多无可 比拟的优点，但是野生型GFP（wt GFP）具有 一定的缺点： GFP有两个激发峰影响了其特异性，并且长波 激发峰强度较小，不易观察 GFP合成及折叠产生荧光的过程慢，蛋白质折 叠受温度影响大，表达量较低 GFP在某些植物细胞中并不表达
GFP融合蛋白的构建
应用亚克隆技术，将目的基因与GFP基因构成 融合基因，通过愈伤组织转化法、基因枪、显 微注射、电激转化等方法转化到合适的细胞， 利用目的基因的基因表达调控机制，如启动子 和信号序列来控制融合基因的表达，最终得到 融合蛋白，可以研究目的蛋白的定位。
目的基因 gfp 基因
融合基因
转化
GFP的荧光特性
通过对GFP的结构和生化特性进行改造，已获得许多 具有不同发射峰和激发峰的突变体，使GFP的荧光强 度和作为报告基因的检测灵敏度大大提高。
GFP及其主要突变体的荧光特征 nm
项目
激发峰
野生型（wt-GFP） 红移突变体RSGFP 黄绿突变体YGFP
蓝色突变体BFP 增强型突变体OGFP 半衰期短的突变体
蛋白质定位的方法
本节课的主要内容
蛋白质定位 绿色荧光蛋白 绿色荧光蛋白融合蛋白的构建 绿色荧光蛋白融合蛋白的检测 其它荧光蛋白简介
蛋白质定位
真核细胞具有复杂的亚细胞结构。每种细胞器都有一 组特定的蛋白。
真核细胞除叶绿体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大 部分蛋白是在胞浆或糙面内质网合成，最终运至不同 地点，形成成熟的蛋白质并行使功能。
GFP的发光机理
GFP的生色团是GFP发出荧光的物质基础。
实质：由第65、66、67位的丝氨酸—脱水酪氨酸—甘氨酸
形成对羟苯甲基咪唑环酮
GFP的荧光特性
GFP的最大吸收峰为 395nm(紫外)，并有一个 479nm的副峰(蓝光)；发 射光谱最大峰值为 509nm(绿光)
尽管450～490nm(蓝光) 是GFP的副吸收峰，但 由于长波能量低，细胞 忍受能力强，因此更适 合于活体检测。
诺贝尔奖委员会将化学奖授予美籍日裔科学家下村修、美国科学家马丁·沙 尔菲和美籍华裔科学家钱永健三人，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋 白质技术。
2008年诺贝尔化学奖
下村修：于1962年在水母Aequorea victoria发现 并分离得到GFP，并发现该蛋白在紫外线下会 发出明亮的绿色。
马丁·查尔菲 ：证明了GFP作为多种生物学现 象的发光遗传标记的价值，这一技术被广泛运 用于生理学和医学等领域。
钱永健：让人们理解了GFP发出荧光的机制。 同时拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色， 使得同一时刻跟踪多个不同的生物学过程成为 现实。
GFP的结构特点
一级结构
GFP由238个氨基酸残基组成 ,分子量为26.9kD GFP的生色团位于氨基酸序列64~69位 GFP的第65、66、67位氨基酸分别是丝氨酸、
表达
检测
GFP融合蛋白的构建
最关键的就是：要尽可能的不影响目的蛋白的定 位和功能。具体蛋白要具体分析。
将目的基因与gfp基因融合有以下几种方式: 将gfp置于目的基因后面，即目的基因-gfp 将gfp置于目的基因前面，即gfp-目的基因。
GFP融合蛋白的构建
注意事项：
两个基因之间用Linker连接。 在两个基因交接处可以增加一段核苷酸(3的倍数) ，
如增加几个为甘氨酸或赖氨酸等编码的三核苷酸。目 的是使得两个基因的蛋白产物的空间结构相互影响较 小，有利于GFP发光。 前一基因必须要有起始密码，而不能带有终止密码； 后一基因要保证有终止密码。
GFP的荧光特性
GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似， 因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样 适用于GFP观察。
GFP荧光极其稳定，在激发光照射下的抗光漂白能力 比荧光素强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定。
GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP 转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中， GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响 GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生 物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。