稳定株构建之十问十答

稳定株构建之十问十答

1，什么是瞬时转染和稳定转染？

答：瞬时转染：顾名思义，外源片段的表达时间短暂。这主要是因为外源导入的裸露的载体整合入基因组的几率非常低，所以以染色体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂而一同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。而且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极高。这就导致瞬时转染呈现一个高拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且无法在这个系统上实现可诱导表达。稳定转染：是相对瞬时转染而言，进入细胞的质粒整合入细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。稳定转染并不是一种与瞬时转染不同的方法，只是对瞬时转染的细胞进行筛选，得到稳定整合的细胞株。稳定整合的几率因基因传递的方法而异，跨度可以从10-8到10-1。因此，对于有的转染方法，比如化学试剂介导的转染，其整合几乎可以忽略不计。质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递方法，呈现不同的靶向倾向性，所以是一种半随机整合。

2，设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些？

答：稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有：

1)，外源插入片段的拷贝数。多数情况下，低拷贝甚至是单拷贝可以减少人为实验因素的干扰。

2)，整合的几率，这不仅决定了稳定株筛选的难易程度，而且还可以帮助人们更容易得到混合稳定株。

3)，整合位点的转录活跃度，决定了稳定株中外源片段的表达质量。最理想的状况是单拷贝，但转录活性比较高。

4)，整合后的稳定性。不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而导致稳定株再次丢失的情况。

5)，最好使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。因为稳定整合往往伴随这插入失活宿主内源基因，所以实验时通过使用混合稳定株，或者对多个单克隆稳定株进行比较，可以帮助研究人员获得更精确的实验数据。

3，什么时候需要稳定细胞株？

答：以下实验，构建稳定细胞株而不是瞬时转染更能满足实验要求：

1)，外源片段在分裂细胞中长期(>2周)稳定表达。虽然普通转染实验一般只能保证2-4天的转染和表达效率，但腺病毒载体在多数分裂细胞中可以维持2-4周内的高转染效率和表达周期。而非分裂细胞，可以使用腺相关病毒载体转导外源基因，因为腺相关病毒载体在许多非分裂细胞中可以保持长达1年的高效表达。

2)，需要构建使用诱导表达系统，这主要是由于：a)，过表达基因或者干扰目的基因引起细胞毒性或者抑制细胞生长等不利因素; b)，目的基因的过表达或者干扰需要时空特异性。

3)，希望控制目的基因过表达或者干扰的拷贝数，以避免引入人为因素影响实验结果的精确性。构建稳定株可以帮助筛选拷贝数适量的细胞进行实验研究。4)，部分细胞种类，病毒载体亦无法达到高转导效率，通过构建稳定株，达到外源片段的高效表达。

5)，长期在少数几类细胞中研究几个基因的功能，通过构建稳定株，可以大大降低频繁转染或者病毒包装的成本，也极大方便实验研究。

6)，部分蛋白稳定性极强，瞬时RNA干扰因为作用周期短，只能抑制目的基因的表达，但无法去除已经表达的目的蛋白，所以需要通过构建稳定株实现更好的基因干扰效果。

7)，需要往动物体内注射表达有外源片段的细胞。需要构建稳定细胞株，以防止注射入动物体内后，很快外源片段表达丢失。

8)，细胞个体差异(同一类细胞，不同个体细胞基因组存在差异)对实验结果有干扰，需要构建单克隆细胞株去除干扰。

9)，需要将外源片段插入基因组中，比如基因敲除，基因插入突变筛选等修饰基因组的实验。

4，什么时候不需要构建稳定株？

答：以下实验不需要构建稳定株：

1)，希望迅速观察目的基因过表达或者干扰效果。例如在正式实验之前进行的小规模预实验。

2)，2-4天的瞬时表达已经可以达到具体的实验目的，比如检测两个外源转染的目的蛋白之间的相互作用，或者观察某些细胞周期抑制，凋亡或细胞存活相关基因的细胞表型。

3)，细胞个体差异对实验结果有影响。体外培养非原代细胞，多为转化细胞系或者癌细胞，细胞个体差异大，瞬时转染或者使用腺病毒/腺相关病毒载体进行转导更可以反映细胞群体行为。或者使用逆转录病毒载体构建混合稳定株。

5，病毒载体构建稳定细胞株有什么优势？

答：化学试剂介导的转染方法和电转，整合率低，同时整合位点不稳定，易发生再次丢失的情况，而且整合位点一般都在转录活跃区之外，所以并不是理想的稳定整合工具。另外，整合后的拷贝数是由核内的外源DNA局部浓度，而不是转染时的DNA的量决定，而化学方法在输入质粒载体入核的效率比电转和病毒载体相比要低得多，导致其转染相同细胞所用质粒载体用量要大大高于其它方法，造成入核质粒载体量难以控制，这也解释了为什么化学转染方法和其它两种方法比，更倾向于得到串联多拷贝。以上种种因素，导致使用非病毒载体转染方法构

建稳定株，成功率低，稳定性差，稳定克隆株易出现不均一(含有非整合细胞)等

缺点。

逆转录病毒载体由于整合率高，是非常理想的稳定株构建工具(表1)。而且通过控制逆转录病毒载体转导的实验条件，理论上可以确保每个细胞只有单拷贝插入。同时由于病毒载体是通过病毒重组酶将外源片段整合入染色体中，其整合特性和病毒自身整合特性非常相似：偏向于转录活跃区段，且整合后非常稳定，在传代100次后仍然保留在宿主基因组中。最重要的是整合几率和所有其它化学，物理转染方法比，增加5至6个数量，使得稳定株构建不再成为实验研究的障碍。由于整合几率非常高，所以很容易获得混合稳定株。

表1:不同转染方法介导的稳定整合参数比较

腺病毒载体整合率和普通转染方法差异不大，被认为是不能整合的一类病毒载体，因此相关研究数据较少，不建议用来构建稳定株。非野生型腺相关病毒载体(Rep-)整合率较低，但因为野生型病毒载体可以定点将病毒基因组整合于人19

号染色体，所以从安全性和稳定性角度来说，潜力都非常巨大。由于诸多因素，研究人员仍然在对其进行改造中，包括考虑到啮齿类动物不含有人19号染色体

对应的整合位点序列。

6，筛选稳定细胞株的方法主要有哪些？

答：主要有三类方法：

1)，单克隆环法：此类方法多用于整合率低的转染方法或者需要得到单克隆细胞株的实验。其优点在于工作量小，只需将转染或者病毒载体感染后的细胞按照一定的细胞密度转移至新皿中，并使用合适的药物进行筛选，最后在克隆环的帮助下对单克隆细胞株进行挑选，并在新皿中完成扩增。缺点在于需要对细胞密度和药物浓度绘制致死曲线并选取合适的细胞密度和药物浓度进行筛选，一些细小的密度和浓度差别都会导致难以获取均一的单克隆，结果导致获取的克隆不纯，含