几种色谱技术介绍-2015
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醇、胺、苯酚类的衍生化（二硝基苯酰氯， ONBC）
氨基酸的衍生化（邻苯二甲醛，OPA；芴代甲 氧基酰氯 FMOC），亦可用于荧光检测
荧光反应
如衍生化试剂 5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯——氨基酸 5-二甲基氨基萘-1-磺酰肼——甾酮类等
3、应用举例
标准溶液（上）和烟草样品（下）中甲酯化有机酸气相色谱图
置亦可实现。
2、裂解机理
100~300℃：热降解阶段。C-C键破坏很少，只 产生简单的分子量递减。
300~500℃：缓和裂解阶段。C-C键有一定程度 的断裂，次级反应很少。
500~800℃：正常裂解阶段。C-C键受破坏，产 生较多单体，也有低聚物存在，存在次级反应。
800~1100℃：强烈裂解阶段。产生大量碎片和 少量单体，存在明显次级反应。
第四章 常用色谱技术
问题
➢甜酒酿中酒精含量的测定 ➢塑料的结构鉴定 ➢大豆油成分分析 ➢浓度约1ppm的CO，CO2的定量
4.1 液上气相色谱法 （顶空分析）
1、定义
➢指用气相色谱法来分析封 闭系统中与液体和固体达 到热力学平衡的气相，从 而间接测量液体或固相样 品中的被测组分。
2、特点
➢减少样品预处理工作，选 择性好，基体干扰小，灵 敏度、精度高。
裂解温度是裂解色谱的关键参数，通常控制在 450~ 600℃，具有三元结构的高分子可采用 600~800℃的温度。
3、裂解装置
裂解装置的结构和性能直接影响分 析的准确度和重现性。
要使样品受热均匀并快速达到预定 的裂解温度。抑制次级反应的发生。
管式炉裂解器
•结构简单，操作 方便，定量进样， •死体积大 •发展：微炉系统
酰化衍生法：适合于含胺基、羟基、巯基试样 的处理：
RNH2 ROH + (R'CO)2O RSH
RNHCOR' ROCOR' + R'COOH RSCOR'
2、 液相色谱中的衍生化技术
紫外发色反应
羧酸的衍生化（1-P-硝基-3-甲苯基三氮烯， PNBTT）
醛和酮的衍生化（P-硝基苄氧基胺盐酸盐， PNBA）
（1）定量原理
亨利定律： Pi P0 ni,l 理想气体： PiV ni,g RT 顶空中被分析物的浓度正比于溶液
中被分析物的浓度
K CL CG
VG
VL
CL0VL
CLVL
CGVG
CG
Hale Waihona Puke Baidu
CL0
K
因此： 体积比恒定，重现性好 β下降，灵敏度高。即样品量多，灵敏度高 K下降，灵敏度高。
1、气相色谱中的常用衍生化技术
硅烷化衍生法：应用最广，可用于醇，胺、 酚、酸等物质的处理。
R-SH
R-COOH
R-OH +
R-NH2
R NH
R
(CH3)3SiCl
R-S-Si(CH3)3
R-COO-Si(CH3)3 R-O-Si(CH3)3 R-NH-Si(CH3)3 R N-Si(CH3)3
R
+ HCl
TMS三甲基硅烷，TMCS三甲基氯硅烷，HMCS六甲基二硅烷， BSTFA双三甲基硅烷基三氟乙酰胺
酯化衍生法：处理有机脂肪酸类。
RCOOH + CH3OH
RCOOCH3 + H2O
RCOOH + CH2N2 RCOOH + R'OH
RCOOCH3 + N2
(CF3CO)2O
RCOOCH3 + H2O
3、顶空分析的分类
➢动态顶空分析 ➢静态顶空分析 ➢固相微萃取(SPME, Solid Phase
Micro Extraction)
4、应用范围
➢检测的被分析物200℃以下挥发 ➢样品前处理工作复杂，如固体、膏体、
复杂液体
5、进样装置 静态顶空分析
动态顶空分析流程
顶空固相微萃取示意图
6、定量方法
木材的鉴别
4.3 色谱中的衍生化技术
衍生化技术解决四类问题：
降低样品的沸点和极性（GC） 改善物质的响应特性，增大其在检测器中的响应值 改善分离 提高样品的稳定性
通常有离线反应和在线反应两种方式，在线反应 又可分为柱前和柱后两种形式。
对衍生化反应的要求
反应条件温和 速度快，定量进行 生成产物单一 过量的试剂不干扰测定 试剂方便易得 方法通用性好 重复性好
方法有：提高平衡温度；向基体中加盐；向基体 中加入另一种溶剂，以改变被分析物的浓度
被分析物
甲苯 甲苯 乙醇 乙醇
溶剂（基体） K(25℃)
癸烷 水 癸烷 水
~3000 ~4 ~60 ~5000
（2） 定量方法 样品制备 外标法 基体模仿 内标法 标准加入法 未知基体 …
7、应用举例
美国药典中规定药品的残留溶剂测定 （静态顶空法）
１－乳酸 ２－草酸 ３－丙二酸 ４－乙酰丙酸 ５－苹果酸 ６－柠檬酸 ７－棕榈酸 ８－亚油酸 ９－油酸＋亚麻酸 １０－硬脂酸 ＩＳ－内标（己二酸）
氨基酸的HPLC分析
氨基酸分析系统（柱后衍生） 1.柠檬酸盐缓冲液pH3.2，2.柠檬酸盐缓冲液pH4.25，3. 柠檬酸盐缓冲液pH6.4，4.N-氯代丁二亚胺，5. 邻苯二 甲酰-2-巯基乙醇的硼酸缓冲液，pH=10
快速柱前衍生 OPA与一级氨基酸反应结合FMOC与二级氨基酸反应
O
C H
H C
+ H2NR
O
R-SH
PH=10.2
SR
NR
单糖的HPLC分析
DAD1B, Sig=250,8Ref=off (D:\HPLC原始数据\DATA\ZHANGCHI\20110329000001.D) mAU
• 热（丝）裂解器
• 结构简单，加热快速，次级反应少 • 温度可控，形态多样
•居里点裂解器利
用高频感应加热进行裂 解。 •裂解温度为铁磁丝的 居里点温度，不可调。 •加热快，在100ms以下。
激光裂解器
4、 应用举例
可用于大分子化合物的定性与结构研究，裂 解动力学和高分子热稳定性研究，微生物等 的分类等。
动态顶空法
SPME法测定干香菇的香气成分
静态顶空分析与SPME的比较
4.2 裂解气相色谱
1、基本原理及特点
高分子化合物在一定条件下热裂解成易挥 发的小分子，然后将其由载气携带入色谱柱中 进行分析。裂解产物的组成和相对含量与被测 物的组成和结构有一定的对应关系。 特点： 方法简单，快速，样品无需复杂的预处理。 方法适用性强，应用广泛。 设备简单，在普通气相色谱仪上安装裂解装
氨基酸的衍生化（邻苯二甲醛，OPA；芴代甲 氧基酰氯 FMOC），亦可用于荧光检测
荧光反应
如衍生化试剂 5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯——氨基酸 5-二甲基氨基萘-1-磺酰肼——甾酮类等
3、应用举例
标准溶液（上）和烟草样品（下）中甲酯化有机酸气相色谱图
置亦可实现。
2、裂解机理
100~300℃：热降解阶段。C-C键破坏很少，只 产生简单的分子量递减。
300~500℃：缓和裂解阶段。C-C键有一定程度 的断裂，次级反应很少。
500~800℃：正常裂解阶段。C-C键受破坏，产 生较多单体，也有低聚物存在，存在次级反应。
800~1100℃：强烈裂解阶段。产生大量碎片和 少量单体，存在明显次级反应。
第四章 常用色谱技术
问题
➢甜酒酿中酒精含量的测定 ➢塑料的结构鉴定 ➢大豆油成分分析 ➢浓度约1ppm的CO，CO2的定量
4.1 液上气相色谱法 （顶空分析）
1、定义
➢指用气相色谱法来分析封 闭系统中与液体和固体达 到热力学平衡的气相，从 而间接测量液体或固相样 品中的被测组分。
2、特点
➢减少样品预处理工作，选 择性好，基体干扰小，灵 敏度、精度高。
裂解温度是裂解色谱的关键参数，通常控制在 450~ 600℃，具有三元结构的高分子可采用 600~800℃的温度。
3、裂解装置
裂解装置的结构和性能直接影响分 析的准确度和重现性。
要使样品受热均匀并快速达到预定 的裂解温度。抑制次级反应的发生。
管式炉裂解器
•结构简单，操作 方便，定量进样， •死体积大 •发展：微炉系统
酰化衍生法：适合于含胺基、羟基、巯基试样 的处理：
RNH2 ROH + (R'CO)2O RSH
RNHCOR' ROCOR' + R'COOH RSCOR'
2、 液相色谱中的衍生化技术
紫外发色反应
羧酸的衍生化（1-P-硝基-3-甲苯基三氮烯， PNBTT）
醛和酮的衍生化（P-硝基苄氧基胺盐酸盐， PNBA）
（1）定量原理
亨利定律： Pi P0 ni,l 理想气体： PiV ni,g RT 顶空中被分析物的浓度正比于溶液
中被分析物的浓度
K CL CG
VG
VL
CL0VL
CLVL
CGVG
CG
Hale Waihona Puke Baidu
CL0
K
因此： 体积比恒定，重现性好 β下降，灵敏度高。即样品量多，灵敏度高 K下降，灵敏度高。
1、气相色谱中的常用衍生化技术
硅烷化衍生法：应用最广，可用于醇，胺、 酚、酸等物质的处理。
R-SH
R-COOH
R-OH +
R-NH2
R NH
R
(CH3)3SiCl
R-S-Si(CH3)3
R-COO-Si(CH3)3 R-O-Si(CH3)3 R-NH-Si(CH3)3 R N-Si(CH3)3
R
+ HCl
TMS三甲基硅烷，TMCS三甲基氯硅烷，HMCS六甲基二硅烷， BSTFA双三甲基硅烷基三氟乙酰胺
酯化衍生法：处理有机脂肪酸类。
RCOOH + CH3OH
RCOOCH3 + H2O
RCOOH + CH2N2 RCOOH + R'OH
RCOOCH3 + N2
(CF3CO)2O
RCOOCH3 + H2O
3、顶空分析的分类
➢动态顶空分析 ➢静态顶空分析 ➢固相微萃取(SPME, Solid Phase
Micro Extraction)
4、应用范围
➢检测的被分析物200℃以下挥发 ➢样品前处理工作复杂，如固体、膏体、
复杂液体
5、进样装置 静态顶空分析
动态顶空分析流程
顶空固相微萃取示意图
6、定量方法
木材的鉴别
4.3 色谱中的衍生化技术
衍生化技术解决四类问题：
降低样品的沸点和极性（GC） 改善物质的响应特性，增大其在检测器中的响应值 改善分离 提高样品的稳定性
通常有离线反应和在线反应两种方式，在线反应 又可分为柱前和柱后两种形式。
对衍生化反应的要求
反应条件温和 速度快，定量进行 生成产物单一 过量的试剂不干扰测定 试剂方便易得 方法通用性好 重复性好
方法有：提高平衡温度；向基体中加盐；向基体 中加入另一种溶剂，以改变被分析物的浓度
被分析物
甲苯 甲苯 乙醇 乙醇
溶剂（基体） K(25℃)
癸烷 水 癸烷 水
~3000 ~4 ~60 ~5000
（2） 定量方法 样品制备 外标法 基体模仿 内标法 标准加入法 未知基体 …
7、应用举例
美国药典中规定药品的残留溶剂测定 （静态顶空法）
１－乳酸 ２－草酸 ３－丙二酸 ４－乙酰丙酸 ５－苹果酸 ６－柠檬酸 ７－棕榈酸 ８－亚油酸 ９－油酸＋亚麻酸 １０－硬脂酸 ＩＳ－内标（己二酸）
氨基酸的HPLC分析
氨基酸分析系统（柱后衍生） 1.柠檬酸盐缓冲液pH3.2，2.柠檬酸盐缓冲液pH4.25，3. 柠檬酸盐缓冲液pH6.4，4.N-氯代丁二亚胺，5. 邻苯二 甲酰-2-巯基乙醇的硼酸缓冲液，pH=10
快速柱前衍生 OPA与一级氨基酸反应结合FMOC与二级氨基酸反应
O
C H
H C
+ H2NR
O
R-SH
PH=10.2
SR
NR
单糖的HPLC分析
DAD1B, Sig=250,8Ref=off (D:\HPLC原始数据\DATA\ZHANGCHI\20110329000001.D) mAU
• 热（丝）裂解器
• 结构简单，加热快速，次级反应少 • 温度可控，形态多样
•居里点裂解器利
用高频感应加热进行裂 解。 •裂解温度为铁磁丝的 居里点温度，不可调。 •加热快，在100ms以下。
激光裂解器
4、 应用举例
可用于大分子化合物的定性与结构研究，裂 解动力学和高分子热稳定性研究，微生物等 的分类等。
动态顶空法
SPME法测定干香菇的香气成分
静态顶空分析与SPME的比较
4.2 裂解气相色谱
1、基本原理及特点
高分子化合物在一定条件下热裂解成易挥 发的小分子，然后将其由载气携带入色谱柱中 进行分析。裂解产物的组成和相对含量与被测 物的组成和结构有一定的对应关系。 特点： 方法简单，快速，样品无需复杂的预处理。 方法适用性强，应用广泛。 设备简单，在普通气相色谱仪上安装裂解装