高效液相色谱仪的原理及应用

二、液相色谱中常用术语和参数
只针对HPLC特有的，其余术语与第三章同 。 粒间体积（V0）：色谱柱填充剂颗粒间隙中 流动相所占有的体积。
孔体积（Vp） ：色谱柱中多孔填充剂的所
有孔洞中流动相所占有的体积。
二、液相色谱中常用术语和参数
柱外体积（Vext）：从进样系统到检测器之 间色谱柱以外的液路部分中流动相所占有的 体积。
一 高效液相色谱仪系统
1.输液系 统
2.进样系 统
3.分离系 统
4.检测系 统
5.数据处 理 系统
高压泵 流动相溶剂
进样口 废液
色谱柱 检测器
1、输液系统
贮液装置 脱气装置 高压输液泵 梯度淋洗系统
输液系统的功能: 1.提供足够的驱动力使流动相通过填充柱 2.使流动相流量精确和稳定 3.使流动相组成精确
柱的保养：
1. 柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 2. 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净； 3. 要注意流动相的脱气； 4. 避免使用高粘度的溶剂作为流动相； 5. 进样样品要预先提纯； 6. 严格控制进样量； 7. 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 8. 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱； 9. 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；
2. 流动相
按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯 、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活 调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调 整出峰时间。
d. 质谱检测器：
二、高效液相液相色谱固定相和流动相
1. 固定相
（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
液体总体积（Vtot） ：粒间体积、孔体积和
柱外体积之和。
淋洗体积（V） ：从进样开始计算的通过色
谱柱的实际淋洗体积。
三、反相高效液相色谱
由非极性固定相和极性流动相所组成的液相 色谱体系。其代表性的固定相是十八烷基键合 硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲醇和乙 腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。 溶质在填料表面的烃类和流动相之间进行分配。 溶质在吸附于填料表面烃类上的“改良固定相” 和流动相之间进行分配 溶质被吸附于填料表面烃类分子上，类似吸附 色谱。
高效液相色谱仪的原理 及应用
第一节 高效液相色谱法原理
一、高效液相色谱法的定义和分类
流动相是液体的色谱称为液相色谱（ LC）。 在液相色谱中，采用颗粒十分细的高效 固定相，并采用高压泵输送流动相，全 部工作通过仪器完成，这种色谱称为高
效液相色谱（HPLC） 。
一、高效液相色谱法的定义和分类
液相色谱：平板色谱和柱色谱。 液相色谱：分配色谱、液固色谱、离子交换 色谱、尺寸排阻色谱。 气相色谱：挥发性物质，不能用于热不稳定 物质分析。 液相色谱：可分析各种物质，热不稳定物质 ，但流动相有毒，运行操作比GC难。能用 GC就用GC。
表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，柱容量底；
（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
四、正相高效液相色谱
是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动 相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是 改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正 己烷。吸附色谱也属正相HPLC。 溶剂洗脱强度近似地随溶剂的介电常数增加 而增大，洗脱能力越弱，溶质在柱上保留时 间越长。
第二节 高效液相色谱仪的组成
Agilent 1100
(1) 贮液装置
分析用高效液相色谱的流动相贮罐，常 用1L的锥形瓶加一个电磁搅拌器，在连接 到泵入口处的管线上要加一个过滤器。
(2) 脱气装置
用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱 气装置再输送到色谱柱。
脱气机、超声脱气、真空脱气等。
(3) 高压输液泵
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。μL/min~几千mL/min 应具有压力平稳、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
UV 灯
logI0 Aabc I
采样二极 管
流通池
参考二极管
截止棱镜 氧化钬滤光片
狭缝 镜1
光栅
镜2
b. 光电二极管阵列检测器
紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。
c. 荧光检测器
高灵敏度、高选择性； 对 多 环 芳 烃 、 维 生 素 B、 黄曲霉素、卟啉类化合物、 农药、药物、氨基酸、甾类 化合物等有响应。
ODS柱的使用注意点：
1）柱压低于150kg/cm2（15cm色谱柱） 2）柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃ 3）流动相pH使用范围为2～7.5
4、检测系统
目前最常用的检测器主要有：
紫外-可见检测器 荧光检测器 电化学检测器 折光示差检测器 蒸发光散射检测器 质谱检测器
a. 紫外检测器
应用最广，对大部分有机化合物有响应。
2、进样系统
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置：
3、分离系统
高效分离柱
直wenku.baidu.com不锈钢管，内径1～8 mm，柱长5～40 cm。
色谱柱
填料
C18色谱柱
十八烷基硅基化学键合 到多孔硅胶或陶瓷微粒
SIL
多孔硅胶微粒
ZORBAX Eclipse XDB-C8 辛基硅烷化学键合到 多孔硅胶微粒上
(4) 梯度淋洗装置
等度洗脱
输液泵 进样器
柱温箱 色谱柱
检测器
单一或混合溶剂
等度洗脱
MeOH / H2O = 6 / 4 分析时间长
分离度差
MeOH / H2O = 8 / 2
怎样解决呢？
梯度洗脱
A A泵
进样器
B 浓度 B
B泵
色谱柱 柱温箱
时间
检测器
MeOH
梯度洗脱
95%
30%
优点：可提高分离度、缩短分离时间、 降低最小检测量和提高分离精度。