肝癌的基因治疗

中国现代普通外科进展Chin J Curr Adv G en Surg

・前沿与进展・Current Situation and Advance・2004年6月　第7卷　第3期　J un.2004Vol.7No.3

肝癌的基因治疗

王建立　徐克森　寿楠海

山东大学齐鲁医院普外科　(山东　济南　250012)

【关键词】肝肿瘤・基因疗法

【中图分类号】R735.7

【文献标识码】A

【文章编号】100929905(2004)0320133203

肝癌对化疗和放疗均不敏感,能手术根治仅占15%,其他的治疗效果也不理想。近几年随着分子生物学技术的不断发展和人们对肿瘤发病机制的不断认识,基因治疗原发性肝细胞癌取得了很大进展,本文就此作一综述。

1　基因治疗的策略　

1.1　免疫基因治疗　主要集中在细胞因子和共刺激因子这两类基因上。

细胞因子在肿瘤免疫基因治疗中占重要的地位,导入免疫反应相关的细胞因子基因,使其在目的细胞稳定表达,可使肿瘤细胞周围的细胞因子浓度提高,对肿瘤细胞产生直接的杀伤作用;另一方面这些细胞因子可以诱导和增强机体的抗肿瘤免疫反应。目前用于抗肿瘤的细胞因子有四类:白介素(IL S),干扰素(IFN2αβγ),肿瘤坏死因子(TNF2αβ),集落刺激因子(CSF)。He2P等以质粒PCDNA3作载体介导IL22基因治疗人的原发性肝癌取得了良好的效果1。Barajas2M2等以腺病毒为载体介导IL22基因治疗鼠的原发性肝癌,2周后肿瘤完全消失。干扰素调控因子1(IRF21)转染肝癌细胞后,能诱导IFN2B的分泌,通过上调MHCⅠ类和MHCⅡ类分子表达,增加免疫细胞对肿瘤的有效识别来抑制肿瘤生长3。共刺激分子包括B7、ICAM21、L FA23、VCAM21等,诱导抗原特异性T细胞的活化和增殖需要抗原递呈细胞(APC)提供2个信号,一个是MHC递呈的抗原肽对T细胞受体(TCR)的刺激,另一个就是共刺激信号。Nabel4等将人类HLA2B7基因用DNA脂质体复合物作为载体导入肿瘤部位,对晚期HLA2B7阴性的肿瘤患者进行临床研究,取得了良好的效果。

1.2　抑癌基因　又称抗癌基因,是正常组织细胞内存在的能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因,已确定的抑癌基因有DCC、NF1、NF2、RB、P53、P16、VHL等,其中P53基因是与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因,P53基因的失活与肝癌的发生和发展密切相关。某些肝癌含有突变的等位基因和一个正常的等位基因,另外一些肝癌含有一个突变的等位基因和一个缺失的等位基因,我国肝细胞癌的P53等位基因缺失率高,P53基因突变多位于249位密码子第三个核苷酸(ACG2 A GT),食物中黄曲霉素B1摄入量与该位点突变呈剂量相关性,低分化肝癌的P53突变率高,P53突变不仅丧失阻止细胞周期和DNA损伤时诱导凋亡作用,而且突变体有获得性功能,如激活PCNA、V EGF、EGFR、IGF1受体,激活C2 M YC、MDR基因等,P53突变导致化疗药物诱导细胞凋亡作用显著下降,用P53反义核酸治疗,可以抑制肿瘤的增殖,诱导凋亡,提高药物的敏感性。

1.3　反义基因治疗　反义基因治疗是利用反义基因转录和翻译水平阻断某些异常基因的表达,以期望阻断肿瘤细胞内异常信号的传导,使瘤细胞进入正常的轨道或引起肿瘤细胞的凋亡。反义基因包括反义RNA、反义DNA和核酶三类。根据碱基配对的原则,能与单链DNA或mRNA特异结合,抑制基因转录、表达和复制。Laid5等将转化生长因子α(TGF2α)的反义表达载体导入能分泌TGF2α肝癌细胞株L E2,能使其在裸鼠内的致瘤性下降。Liao6等用H2ras的反义寡核苷酸治疗裸鼠LCI2D20人肝癌模型的实验表明反义H2ras寡核苷酸抑制H2ras的表达,能诱导细胞凋亡,抑制LCI2D20细胞的生长。

1.4　多耐药基因治疗　肝癌的化疗经常伴有不同程度的骨髓造血细胞的抑制,成为制约化疗效果的重要因素。研究表明,肿瘤细胞产生耐药与多耐药基因(MDR)编码产生的一种跨膜P2糖蛋白有关,该蛋白把药物从细胞内泵出,使细胞内的药物浓度降低从而产生耐药。利用肿瘤细胞产生耐药现象的机制把多耐药基因导入肝癌病人的骨髓造血细胞内,以产生抗药性骨髓造血细胞,减少骨髓的受抑制程度,在此基础上可加大化疗药物的剂量,以提高化疗效果。

1.5　自杀基因的治疗　自杀基因治疗是指把某些病毒、细菌中特有的前药转换酶基因———自杀基因导入哺乳动物后,

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产生的酶能将无毒或低毒的药物前体转化成细胞毒性代谢产物,从而杀死肿瘤细胞。目前针对肝癌基因治疗研究的有单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷嘧啶激酶/戊环鸟苷系统(HSV2T K/ GCV)和胞嘧啶脱氨酶/5氟胞嘧啶(CD/5FC)系统,前者能催化无毒的药物gancilovir(GCV)磷酸化,产生具有明显细胞毒性的磷酸化产物,通过DNA聚合酶而抑止DNA的合成,后者能将无毒的52氟胞嘧啶(52Fc)生成毒性的(52Fu)。Mawatari7等以AFP增强子2启动子为转录调控序列,调控HSV/T K基因的表达,以逆转录病毒为载体将HSV/T K基因导入表达AFP的肝癌细胞株,随后用GCV进行治疗,结果肝癌细胞株对GCV的敏感性提高。Publmann8等报告了嘌呤核苷酸磷自杀基因治疗是某些病毒、细菌中特有的前药转换酶基因———自杀基因导入哺乳动物后,产生的酶将无毒或低毒的药物前体转化成细胞毒性代谢产物,从而杀死肿瘤细胞。目前针对肝癌基因治疗研究的有单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷嘧啶激酶/戊环鸟苷系统(HSV2T K/GCV)和胞嘧啶脱氨酶/5氟胞嘧啶(CD/5Fc)系统,前者能催化无毒的药物gancilovir(GCV)磷酸化,产生具有明显细胞毒性的磷酸化产物,通过DNA聚合酶而抑止DNA的合成,后者能将无毒的52Fc生成毒性的52Fu。酸化酶基因(PNP),可将无毒的前药62甲嘌呤核苷酸糖(6MPDR)转化成毒性产物62甲嘌呤,产生强烈的肿瘤杀伤作用。

1.6　肝癌抗血管生成的基因治疗　正常情况下,机体器官保持血管生成和抗血管生成的平衡,以维持血管生理所需要的量和速度。促血管生成因子的增加和抗血管生成抑制剂均可改变血管生成的表型。研究表明至少15种不同的蛋白质具有促血管生成特性,其中V EGF和bF GF与实体瘤血管生成的表型关系最密切。目前抗血管生成的基因治疗主要集中针对V EGF和bF GF两种介质。血管生成介质刺激新生血管生长的能力受体内血管生成内源性抑制剂的干扰,后者由肿瘤细胞或肿瘤内及其周围的间质细胞分泌,主要包括血小板反应素(TSP21)、血小板因子(PF4)、可溶性flt21、an2 giostatin和endostatin。

血管内皮细胞生长因子(V EGF)和成纤维细胞生长因子(F GFS)家族是生理性血管的主要调节因子,也是肿瘤血管生成的主要刺激因子。通过干预血管生成因子作用能使动物的肿瘤退化,如用V EGF单抗、可溶性F GF受体中和已释放的血管生成因子,或通过降低F GF结合蛋白来阻止细胞外基质释放活性bF GF9。Sun10等以pcDNA3B质粒为载体介导反义HIF封闭小鼠的肝癌模型的缺氧诱导因子基因,结果其下游的血管内皮生长因子(V EGF)明显下调,治疗组在基因注射1周后肿瘤快速萎缩,而对照组在14～17天肿瘤由0.1cm生长到1cm。

血管生成抑制剂阻止肿瘤血管生成的机理是:(1)抑制血管内皮细胞的增殖和迁移;(2)抑制血管基底膜和细胞外基质的降解和更新,抑制血管重建。目前常用的血管生成抑制剂有Angiostatin和Endostatin,两者是目前作用最强、实验效果最好的肿瘤血管生成抑制剂。Wang11等以逆转录病毒为载体介导人血管内皮抑素基因Endostatin来治疗人肝癌细胞的裸鼠的动物模型,注射该基因的裸鼠在肿瘤细胞在注射16天后才形成肿瘤,第22天肿瘤体积仅为26.8mm3;而对照组在肿瘤细胞注射后12天形成肿瘤,22天肿瘤生长至498.0mm3。Endostatin同样具有在体外明显抑制血管内皮细胞生长的作用。Xueying Sun12以腺相关病毒为载体介导Angiostatin基因通过门静脉注射治疗大鼠的原位和转移的肝癌的模型,结果Angiostatin注射2个月后在肝细胞中的浓度达到最高峰,在原位癌的模型中治疗组肿瘤较对照组缩小68%～72%,而在转移癌治疗组中肿瘤则缩小71%～72%。血管生成抑制剂可反复用药而不产生耐药性。

1.7　联合基因治疗　Xueying Sun13等将抗血管生成基因Angiostin和B721联合应用,治疗EL24肿瘤模型,结果发现单纯用Angiostin只能轻微抑制肿瘤的生长,用B721也只能根除直径小于0.1cm的肿瘤模型,而两者联合应用能根除直径0.4cm的肿瘤。Drozdzik14等研究了IL22基因与HSK2T K基因联合应用治疗鼠肝癌模型的作用,疗效明显好于单独应用IL22基因或HSK2T K基因。

2　载体的选择　

基因治疗理想的载体应具有安全性好、转染的特异性强、转染率高和操作简便等特点。目前在肝癌的基因治疗实验中使用最多的是病毒载体系统,包括腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、SV40病毒载体等;非病毒载体系统主要是脂质体、质粒介导。目前使用的载体各有其优缺点,尚无完美的理想载体。腺病毒载体有许多优点,如运载的基因片段较大,可达36kb,其不仅可感染分裂期细胞,也可感染非分裂期的细胞,转染效率高表达稳定,它不需要整合到宿主细胞的基因中,因此不会导致宿主细胞恶变,具有较高的安全性,但外源基因只能瞬间表达。但腺病毒在体内存在复制的可能,能引起程度强烈的炎症反应。LUO15等以腺病毒为载体用内皮抑素预防裸鼠大肠癌术后肝转移,结果发现内皮抑素在体内特别是肝组织内高表达,外周血和肝静脉血在注射后第5天达到高峰,实验组较对照肝转移瘤数明显减少,并且转移瘤的血管密度较对照组明显减少。重组逆转录病毒载体能将目的基因选择性的整合入增殖活跃的细胞的染色体中,而不整合到无分裂的细胞,特别适于肿瘤的治疗,但在体内可发生补体介导的病毒失活,影响目的基因的转染率。腺相关病毒(AAV)是一类无囊膜的单链DNA 缺陷型病毒,腺相关病毒属细小病毒科,目前还未发现其对人体可产生任何病理后果。是目前世界上最简单最小的动物病毒。AAV载体最大的特点是AAV能够特异性整合到宿主细胞19号染色体DNA中;外源目的基因通过AAV的启动子激活而表达相应的产物;同时对人类无致病危险,无毒性,病毒颗粒比较稳定。腺相关病毒载体对分裂和非分裂细胞均有感染作用,在不发生整合的情况下,AAV可表达插入其内的外源基因,可能有利于转染生长缓慢的肝癌细胞。AAV转染后目的基因表达的时间也较长,Xueying Sun12等以AAV病毒为载体用angiostatin治疗大鼠的肝转移癌,结

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