慢病毒载体的构建
慢病毒构建原理
慢病毒构建原理
◆慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。
可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。
◆慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。
整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。
慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。
图片
◆慢病毒载体具有宿主范围广，基因容量大等特点。
体外应用时，慢病毒载体能够有效地感染培养的神经元、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型原代细胞和大部分细胞系。
由于慢病毒的感染具有整合特性，其能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，因而可以达到持久性表达，从而构建稳转细胞株，用于基因的细胞功能研究。
◆体内应用时，慢病毒载体的应用不如rAAV载体应用广泛，因为其具有一定的免疫原性，且随机整合特性可能导致细胞功能基因的异常。
相比较腺相关病毒，慢病毒的扩散范围较小，但其表达更快、基因容量更大（可容纳4kb），可作为大容量基因的载体。
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理
慢病毒（lentivirus）是一类病毒，属于反转录病毒的一种。
慢病毒可以作为基因转移的工具，被广泛应用于基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域。
慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，将外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
慢病毒载体构建的原理主要包括以下几个步骤：
1. 选择适当的慢病毒载体，慢病毒载体通常由慢病毒的基因组和外源基因组成。
在构建慢病毒载体时，需要选择适当的慢病毒载体，通常选择已经经过改造的慢病毒载体作为基础，然后将需要表达的外源基因插入到载体中。
2. 插入外源基因，将需要表达的外源基因插入到慢病毒载体的适当位置。
通常采用限制性内切酶切割和连接酶连接的方法，将外源基因与慢病毒载体连接起来，形成重组的慢病毒载体。
3. 构建重组慢病毒载体，将插入了外源基因的慢病毒载体导入到适当的宿主细胞中，利用宿主细胞的复制和转录机制，使重组慢
病毒载体在宿主细胞中稳定复制和表达外源基因。
4. 验证慢病毒载体的稳定性和表达效果，对构建的重组慢病毒
载体进行验证，包括验证慢病毒载体在宿主细胞中的稳定性和外源
基因的表达效果。
通常采用PCR、Western blot等方法对慢病毒载
体进行验证。
总之，慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将
外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，
使外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
这一技术在基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域具有重要的应用前景，对于疾病治疗
和生命科学研究具有重要意义。
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体是一种常用于基因转染和基因治疗研究的工具，其构建原理主要包括载体选择、基因插入、包装和转染等几个关键步骤。
下面将分别对这些步骤进行详细介绍。
首先，载体选择是慢病毒构建的第一步。
常用的慢病毒载体包括pLenti、pSico、pRetro等，这些载体通常具有较高的转染效率和稳定性。
在选择载体时，需要考虑载体的大小、复制能力、转染效率以及转染细胞类型等因素，以确保最终构建的慢病毒载体能够满足实验需求。
其次，基因插入是慢病毒构建的关键步骤之一。
一般来说，可以利用限制性内切酶切割载体，然后将待插入的基因片段与载体连接，形成重组载体。
在进行基因插入时，需要注意选择合适的限制性内切酶，控制酶切的时间和温度，以确保基因能够正确插入到载体中。
接下来是包装步骤。
包装是指将重组载体导入到包装细胞中，通过包装细胞的辅助，使其产生慢病毒颗粒。
常用的包装细胞包括293T细胞、HEK293细胞等。
在包装过程中，需要利用辅助载体，如
pMD2.G和psPAX2等，通过三质体共转染的方式，使包装细胞产生
慢病毒颗粒。
最后是转染步骤。
转染是将包装好的慢病毒颗粒导入到目标细
胞中，实现基因的转染。
在进行转染时，需要根据目标细胞的特性
选择合适的转染方法，如离体转染、体内转染等，以确保慢病毒能
够有效地转染目标细胞，并表达目标基因。
总的来说，慢病毒载体构建的原理涉及到载体选择、基因插入、包装和转染等关键步骤。
通过合理的实验设计和操作，可以构建出
稳定、高效的慢病毒载体，为基因转染和基因治疗研究提供有力的
工具支持。
慢病毒载体的构建
慢
慢病毒载体是一种常用的基因转移工具，其安全性评估主要 包括对病毒的毒力、致病性和传播性的评估。在构建慢病毒 载体时，应确保所选用的慢病毒毒株无致病性，且不具有传 播性。
慢病毒载体的生物安全性
在构建慢病毒载体时，应确保载体无外源污染，如细菌、真 菌、支原体等污染。同时，应进行逆转录酶活性检测，以确 保载体无逆转录酶活性，从而避免潜在的基因重组和插入突 变风险。
慢病毒载体的构建流程
01
02
03
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目的基因的克隆
将目的基因克隆到慢病毒载体 中，常用的克隆方法包括限制
性酶切、连接和转化等。
慢病毒载体的包装
将目的基因与包装信号共同转 染包装细胞，包装细胞能够产 生具有感染力的慢病毒颗粒。
慢病毒的纯化
通过离心、过滤等方法将慢病 毒颗粒从包装细胞中分离出来
，并进行纯化。
生物学功能分析
对目的基因进行生物学功能分析， 如报告基因实验、细胞活性实验、 动物模型实验等，以评估慢病毒 载体对目的基因功能的改善效果。
安全性评估
对慢病毒载体进行安全性评估， 包括对宿主细胞的毒性、免疫反 应、致瘤性等方面进行检测，以 确保慢病毒载体的应用安全可靠。
05
慢病毒载体的安全性与伦理问题
慢病毒的滴度测定
测定纯化后慢病毒的滴度，即 每毫升或每毫克病毒颗粒的数
量。
02
慢病毒载体的设计
包装元件的选择
01
02
03
包装元件
选择合适的包装元件是构 建慢病毒载体的关键步骤， 包括病毒的复制酶、转录 酶和整合酶等。
安全性
确保所选的包装元件无致 病性，不会对宿主细胞造 成不良影响。
兼容性
确保所选的包装元件与载 体的其他元件兼容，能够 实现有效转导和表达。
慢病毒载体包装构建过程
慢病毒载体包装构建过程（一）原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。
对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。
概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。
携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。
辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。
慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。
包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。
将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。
USP22 ShRNA慢病毒载体的构建及鉴定
USP22 ShRNA慢病毒载体的构建及鉴定目的构建并鉴定USP22基因ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因在鼻咽癌中的作用机制奠定基础。
方法针对USP22基因的编码序列设计并合成2条特异性干扰序列，序列两端含有限制性内切酶位点HpaⅠ和XhoⅠ。
寡核苷酸链退火生成寡核苷酸双链，5′端磷酸化后将含有酶切位点的寡核苷酸双链克隆到pLL3.7慢病毒表达载体。
连接产物经转化、培养，提取其质粒，提取出来的质粒经HpaⅠ和XhoⅠ酶切电泳鉴定，鉴定正确的质粒进行测序。
构建成功的慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA與包装载体质粒混匀共转染于293T细胞。
通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）情况，对病毒滴度和感染效率进行检测。
结果成功构建慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA。
与包装载体质粒共转染293T细胞后测定慢病毒滴度为4×107 TU/ml。
结论本实验应用相关技术成功构建USP22 ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。
标签：USP22；慢病毒载体；构建；鉴定肿瘤细胞中基因表达具有组织特异性，USP22泛素水解酶属去泛素化酶DUB基因家族成员，其普遍表达表明其功能的保守性，因此，USP22被归类为肿瘤干细胞的标记基因而引起高度关注[1]。
国内外学者研究发现，USP22基因过表达与结直肠癌[2]、肺癌[3]、胃癌[4]、食管癌[5]、乳腺癌[6]等恶性肿瘤的浸润、转移和预后差高度相关。
沉默USP22基因表达，能显著抑制膀胱癌[7]、结直肠癌[8]细胞增殖，由此推测USP22基因可能成为肿瘤治疗的一个新靶点。
本研究通过基因工程技术构建USP22 ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因在人鼻咽癌细胞中的作用机制提供实验基础。
1 材料与方法1.1 实验材料、试剂及仪器pLL3.7慢病毒表达载体及包装载体质粒购自广州永诺生物科技有限公司。
慢病毒载体的设计
慢病毒载体的设计
1. 两质粒系统
以HIV-1为骨架，将其中的反式作用蛋白基因序列去除，然后包装成为含有目标基因的重组质粒和能够反式提供病毒颗粒所需蛋白的包装质粒，共转染包装细胞（如293T细胞）进行包装。
两质粒系统为复制缺陷型载体，仅能获得较低的滴度，且仅能感染CD4+的靶细胞，并存在产生HIV的感染风险。
2. 三质粒系统
将HIV-1基因组中负责包装，逆转录和整合所需要的顺式作用序列结构和编码反式作用蛋白的序列分离，再克隆到三个独立的质粒中，并去除了所有的辅助序列。
极大地增加了病毒的安全性，是目前比较常用的慢病毒包装系统。
3. 四质粒系统
四系统也是目前较为常用的病毒系统。
与三质粒系统相比，第一个变化是将rev基因放在一个单独的表达质粒上，新增一个质粒更增加了系统的安全性。
第二个变化是将tat基因去除，并在载体质粒上增添了与异源启动子融合的嵌合5'LTR，以启动载体质粒的表达。
这样就形成了四个质粒的系统，即pGag/Pol、pRev、pVSV-G。
此外，还有一个可以放置目的基因序列的载体。
四质粒HIV-1病毒包装系统。
慢病毒载体的构建
三 .滴度测定：稀释计数法 滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒 数。”TU”为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表 示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。 第一天 细胞准备 将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔 板，100µl/孔，为每个病毒准备10个孔。放入37℃，5%CO2培养箱 中培养。 第二天 加病毒 在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：每种 病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入90µl培养液，往第一个管中加入 10µl病毒原液，混匀后，吸取10µl加入第二个管混匀。依此类推，做 十个稀释度（10~10-8）。 吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。 第三天 追加培养液 在每个孔再加入100µl完全培养液，利于细胞的生长。 第五天 观察结果并计算滴度 在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。 假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）×1000/2/X孔的病毒 液的含量（µl ）。
293FT细胞的培养基及其添加成分（Non-Essential Amino Acids，L-Glutamine，pyeuvate solution and G418）
制备感受态用的试剂
我们用的慢病毒载体的2个包装载体
我们用的慢病毒载体表达系统的转移载体
一、空载质粒的验证
包装载体及表达载体质粒的验证
Lip2000转染293FT细胞的效率
图8 Des2-1、psPAX2、pMD2G用 Lip2000共转293FT细胞， 48h后检测GFP的表达情况，如图所示 （ 4× ）
五、慢病毒载体的验证
慢病毒载体构建 Protocol
慢病毒载体构建是一种用于基因治疗和基因转导的重要工具，其用于将外源基因或shRNA等插入到慢病毒载体中，从而实现对特定基因的表达调控。
下面是慢病毒载体构建所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、所需试剂和耗材1.慢病毒载体：用于包装目的基因的包装细胞系，如HepG2.2.15等。
2.目的基因或shRNA：需要插入慢病毒载体的DNA或RNA片段。
3.质粒DNA：用于构建慢病毒载体，包括表达盒质粒和包装质粒等。
4.DNA聚合酶：用于DNA扩增和连接。
5.限制性内切酶：用于DNA切割。
6.DNA连接酶：用于DNA连接。
7.缓冲液：维持反应液的pH值和其他辅助因子的浓度。
8.dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：DNA合成的原材料，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP。
9.细胞培养基：用于细胞培养。
10.胎牛血清：提供细胞生长所需的营养物质。
11.抗生素：用于防止细胞污染。
12.其他细胞生物学试剂：如胰蛋白酶、无血清培养基等。
二、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合和振荡反应液。
2.离心机：用于离心管和细胞培养瓶等。
3.水浴锅：用于保温反应液。
4.移液器：用于精确添加试剂和溶液。
5.细胞培养箱：用于细胞培养。
6.倒置显微镜：观察细胞生长状态和感染情况。
7.紫外线分光光度计：用于测量DNA浓度。
8.电泳仪和电泳槽：用于分析DNA样品。
9.定量PCR仪：用于定量分析目的基因的转导效率。
三、准备工作1.了解慢病毒载体构建的基本原理和步骤。
2.设计并合成目的基因或shRNA序列，并确认其正确性。
3.准备所有所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。
4.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。
5.准备好实验服、口罩、手套等个人防护用品。
6.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。
7.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等。
8.设置细胞培养箱的温度和湿度等参数。
慢病毒载体的构建讲解
pWXLd : psPAX2 : pMD2G =20:15:6
三 .滴度测定：稀释计数法 滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒 数。”TU”为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表
示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天 细胞准备
将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔 板，100µl/孔，为每个病毒准备10个孔。放入37℃，5%CO2培养箱
重组酶（Gateway® LR Clonase™ II） 293FT细胞（＜16代） 293FT细胞的培养基及其添加成分（Non-Essential Amino Acids，L-Glutamine，pyeuvate solution and G418） 制备感受态用的试剂
我们用的慢病毒载体的2个包装载体
第三天 追加培养液
在每个孔再加入100µl完全培养液，利于细胞的生长。 第五天 观察结果并计算滴度
在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。 假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）×1000/2/X孔的病毒
Cytoskeletal anchoring of GLAST determines susceptibility to brain
damage: an identified role for GFAP.
(J Biol Chem,
2007, Oct.)
慢病毒载体介导人IL-12基因修饰树突状细胞体外抗肺癌作用的研究 （邸军，吉林大学博士学位论文，2009年5月）
shRNA : psPAX2 : pMD2G = 20:15:5
Duox1 is the main source of hydrogen peroxide in the rat thyroid cell line
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理慢病毒是一类能够长期潜伏在宿主细胞内，并且在细胞分裂时能够传递给子细胞的病毒。
慢病毒的研究和应用在基因治疗、基因工程和细胞治疗等领域具有重要意义。
慢病毒载体构建是慢病毒研究的关键环节，下面将介绍慢病毒载体构建的原理。
首先，慢病毒载体构建的关键是选择合适的病毒骨架。
常用的慢病毒载体包括HIV-1、HIV-2和SIV等。
这些病毒骨架具有较高的转导效率和稳定性，能够有效地将外源基因导入宿主细胞中。
在选择病毒骨架时，需要考虑到载体的稳定性、毒性和转导效率等因素，以确保慢病毒载体能够在宿主细胞中稳定表达外源基因。
其次，慢病毒载体构建需要将外源基因整合到病毒基因组中。
一般来说，外源基因会被整合到病毒的长末端重复序列（LTR）之间，这样可以确保外源基因能够稳定地表达。
在整合外源基因时，需要使用逆转录酶将外源基因的RNA转录成DNA，并将其整合到病毒基因组中。
整合外源基因的位置和数量会影响慢病毒载体的稳定性和表达水平，因此需要对整合位点和整合数量进行精确控制。
另外，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的包装限制。
在病毒的生命周期中，病毒颗粒的组装和包装需要依赖于病毒的包装信号。
因此，在构建慢病毒载体时，需要确保外源基因的整合不会影响到病毒的包装信号，否则会影响病毒的组装和包装，从而降低病毒的转导效率和稳定性。
最后，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的安全性和稳定性。
在构建慢病毒载体时，需要对病毒的毒性进行改造，以降低其对宿主细胞的损害。
同时，还需要对病毒的复制和传播进行限制，以确保慢病毒载体在宿主细胞中稳定表达外源基因，同时不会对宿主细胞造成不良影响。
综上所述，慢病毒载体构建是慢病毒研究和应用的重要环节。
通过选择合适的病毒骨架、整合外源基因、考虑病毒的包装限制和确保病毒的安全性和稳定性，可以构建出稳定、高效的慢病毒载体，为基因治疗、基因工程和细胞治疗等领域的研究和应用提供重要支持。
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理慢病毒是一类能够引起慢性感染的病毒，其特点是在宿主细胞内复制速度较慢，病程较长。
慢病毒载体是一种用于基因转移和基因治疗的工具，其构建原理是通过将外源基因插入慢病毒基因组中，利用慢病毒的复制和转录机制将外源基因稳定地表达在宿主细胞中。
本文将介绍慢病毒载体构建的原理及相关技术要点。
首先，慢病毒载体构建的基本原理是利用慢病毒的基因组和复制机制来稳定表达外源基因。
慢病毒基因组包括基因组RNA和反转录酶，而慢病毒的复制过程主要依赖于反转录酶的活性。
因此，构建慢病毒载体的关键是将外源基因插入到慢病毒基因组中，并确保其在宿主细胞中的稳定表达。
其次，慢病毒载体构建的技术要点包括选择合适的慢病毒载体和外源基因插入位点。
常用的慢病毒载体包括逆转录病毒和伞状病毒，它们具有较高的基因载荷能力和稳定的表达特性。
而外源基因的插入位点则需要选择在慢病毒基因组中不影响病毒复制和转录的区域，通常选择在非编码区域或非必需基因上进行插入。
另外，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的安全性和稳定性。
为了确保慢病毒载体在宿主细胞中的稳定表达，需要对其进行适当的改造和优化，例如加入启动子和终止子来调控外源基因的表达水平，或者利用基因编辑技术来增强慢病毒的复制和转录能力。
此外，为了降低慢病毒载体的致病性和提高其安全性，还可以通过删除病毒基因组中的致病基因或关键复制基因来实现。
总之，慢病毒载体构建是一项复杂而关键的技术工作，其成功与否直接影响到基因转移和基因治疗的效果。
通过深入理解慢病毒的复制机制和基因组结构，合理选择慢病毒载体和外源基因插入位点，以及优化病毒的表达和安全性，才能够成功构建出稳定、高效、安全的慢病毒载体，为基因治疗和基因转移研究提供有力的工具支持。
慢病毒载体的构建
慢病毒载体的构建一．构建原理：慢病毒属于逆转录病毒科, 但其基因组结构复杂, 除gag 、po l 和env 这3 个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外, 还包括4 个辅助基因, vif 、vp r 、 nef 、vpu 和2 个调节基因tat 和rev 。
H IV 21 是慢病毒中最具特征性的病毒, 第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的。
慢病毒载体的构建原理就是将H IV 21 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离。
载体系统包括包装成分和载体成分: 包装成分由H IV 21 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建, 能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白; 载体成分与包装成分互补, 含有包装、逆转录和整合所需的H IV 21 顺式作用序列。
同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒(RCV ) 的可能性, 将包装成分的5′ L TR 换成巨细胞病毒(CMV ) 立即早期启动子, 3′ L TR 换成SV 40 po lyA 位点等。
将包装成分分别构建在两个质粒上, 即一个表达gag 和po l 、另一个表达env 。
二．实验操作举例：一）磷酸钙法转染HEK293T 细胞1. 试剂配制:无菌水ddw: 高温灭菌; 分装;2XHBS: 280mM NaCl10mM KCl1.5 mM Na2HPO412 mM glucose50 mM HEPESAdjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 过滤灭菌,分装;2M CaCl2: 过滤灭菌,分装.2. 实验过程:1. 铺细胞: 选择状态良好的293T 细胞传代, 2-3x105个细胞/35mm dish.2. 20-24h 后,待细胞长至铺满瓶底约50-70%的时候,进行转染.下面就35mm dish 为例,采用以下转染体系:ddw: 105ulplasmid: 2 ug (如0.5ug/ul, 即用4ul)2M CaCl2: 16.5ul2XHBS: 125ul按上述顺序,往eppendorf管中依次加入上述四种试剂.先将前三者混匀,最后加2XHBS.一种方法是,加2XHBS时要逐滴加入,吹打至微现乳白色,立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液.另一种方法是,加入2XHBS后立即吹打约40下(不过这个要根据每个人的力道和吹打的频率而定,建议做一个梯度实验,吹打不同的次数看哪次的转染效率高以后就按这个次数来吹打),之后步骤同上,立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液.二）转染方法2-Fugene转染病毒包装1．传293T细胞，将T75用明胶包被，每瓶T75加1.5-2mL明胶，置于37度培养箱10min。
慢病毒包装的原理
慢病毒包装的原理慢病毒（lentivirus）是一类能够将基因信息稳定地整合到宿主细胞基因组中的病毒，因其具有较高的转染效率和广泛的宿主细胞范围而被广泛应用于基因治疗、基因编辑和细胞治疗等领域。
慢病毒的包装是指将外源基因载体包装入慢病毒颗粒中，使其具有传递和整合到宿主细胞基因组的能力。
本文将介绍慢病毒包装的原理及其相关技术。
慢病毒包装的原理主要包括载体构建、包装细胞系和包装技术三个方面。
首先是载体构建，即将外源基因插入到慢病毒基因组中，构建成慢病毒表达载体。
慢病毒基因组包括基因组RNA和辅助质粒DNA两种形式，通过重组技术将外源基因插入到慢病毒基因组中，并在适当的位点上加入启动子、终止子和调控元件，构建成慢病毒表达载体。
其次是包装细胞系的建立。
包装细胞系是指能够表达慢病毒包装蛋白的细胞系，通常采用293T细胞或HEK293细胞。
通过转染慢病毒表达载体和包装蛋白表达质粒，使其在细胞内表达慢病毒包装蛋白，从而实现慢病毒颗粒的包装和产生。
最后是包装技术，主要包括质粒转染、病毒包装和病毒收集等步骤。
质粒转染是指将慢病毒表达载体和包装蛋白表达质粒转染至包装细胞系，使其在细胞内表达慢病毒包装蛋白。
病毒包装是指慢病毒包装蛋白识别慢病毒基因组RNA，并将其包装成慢病毒颗粒的过程。
病毒收集是指通过超速离心或滤膜浓缩等方法，从包装细胞系的培养上清中收集慢病毒颗粒。
总的来说，慢病毒包装的原理是通过构建慢病毒表达载体，利用包装细胞系表达慢病毒包装蛋白，将外源基因包装入慢病毒颗粒中，最终实现慢病毒的包装和产生。
这一技术为基因治疗和基因编辑研究提供了重要工具，也为细胞治疗等领域的发展提供了有力支持。
随着基因治疗和细胞治疗的不断发展，慢病毒包装技术的进一步优化和改进将为相关研究和临床应用带来更多的机遇和挑战。
慢病毒载体构建步骤
一、简介慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi 的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA 半衰期短，体外合成siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
慢病毒载体能够产生表达shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。
慢病毒作为siRNA 的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。
在所构建的siRNA 表达载体中，是由RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA 合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A 尾。
当RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续4 个或5 个T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4 个U。
U6 和H1 RNA 启动子是两种RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA 和～50ntRNA 茎环结构（stem loop）。
慢病毒载体构建
第一天
第二天
第三天
第四天
第五、六天
可选:等一天 测序结果
D1.引物设计（NCBI、Prime5）
• 添加酶切位点和保护碱基（推荐XbaI、NotI）
需要确定自己的目的序列是否有相同酶切位点 序列，有则不能用
D2.PCR扩增、跑胶、胶回收、连接T载、 转化
D3.挑菌、摇菌、送样检测、菌液扩增
每次两个重复，每板挑4-6个菌
24H
48H
3.慢病毒收集和浓缩并感染目的细胞
4.筛选稳定表达的细胞株
注意事项
谢谢大家
学到了就要教人，赚到了就要给人
慢病毒载体构建
演讲人：华仁武
导师：雷明刚
1.整体步骤
1.质粒构建
(1).超表达载体穿梭质粒 (2).shRNA
（1）.质粒构建步骤（以CD513B为例）
引物 设计
PCR扩增、连接T 载、转化
挑菌、摇菌、送 样检测、菌液扩 增
提质粒、双酶切、 连接cd513b、 转化
挑菌、摇菌、 PCR检测、菌液 扩增，提质粒、 双酶切验证
D4:提质粒、双酶切、连接cd513b、转化
D5、6挑菌、摇菌、PCR检测、菌液扩增， 提质粒、双酶切验证
2.病毒包装
前期准备 • A目的载体：将目的基因片段连到慢病毒载体上，酶切，连接， 转化，抽质粒，测序 • B包装质粒：三个质粒按照以下比例混合PMDLG：PMDG: PRSV (2:1:1),混成终浓度为1mg/ml（至少要达到0.75mg，传的代数 不要太多 • D 试剂：慢病毒转染试剂（我们用的是fugene6），polybrene (病毒感染用), opti
慢病毒转染原理
慢病毒转染原理
慢病毒转染是一种常用的基因传递技术，它利用慢病毒病毒粒子作为载体将目标基因导入靶细胞。
慢病毒是一类特殊的病毒，具有较高的感染效率和稳定的基因表达能力，因此被广泛应用于基因转染领域。
慢病毒转染的基本原理可以分为以下几个步骤：
1. 构建慢病毒载体：首先，将目标基因插入到慢病毒载体的适当位点上。
慢病毒载体通常包括了病毒的基因组结构，例如表达型蛋白、包装型蛋白等。
2. 包装慢病毒：将构建好的慢病毒载体导入特定细胞系，并通过培养和传代扩增病毒。
这些细胞会产生足够多的慢病毒病毒颗粒。
3. 收集病毒颗粒：从培养基中收集慢病毒病毒颗粒。
通常，病毒颗粒可以通过浓缩和超速离心等方法获得。
4. 转染靶细胞：将收集到的病毒颗粒加入待转染的靶细胞培养基中。
病毒颗粒会与细胞表面的受体结合，进入细胞。
5. 病毒基因组整合到靶细胞基因组：一旦进入细胞内，慢病毒会释放出自己的遗传物质，包括病毒基因组RNA和逆转录酶。
逆转录酶能够将病毒基因组的RNA逆转录成DNA，并将其整合到宿主细胞的染色体上。
从而实现病毒基因的稳定表达。
综上所述，慢病毒转染是一种利用慢病毒病毒粒子作为载体将基因导入到靶细胞的技术。
通过包装慢病毒病毒颗粒，并与靶细胞进行转染，实现了基因的稳定表达。
这种技术在基因治疗、基因功能研究等领域具有重要的应用价值。
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Vector Titer Determination
Transduced Cells
Virions
FACS (TU/ml)
qPCR SybRGreen (proviral DNA/cell)
p24 ELISA (ng p24/ml)
IP
PP
2.HIV-1 Vector Production Supernatant recoveries & concentration
一 HIV-1 life cycle
HIV二 HIV-1基因结构
• • • • • • • •
gag, -----群抗原基因，编码核心蛋白p24 pol -----多聚酶基因，编码多聚酶； env-----包膜蛋白基因，编码包膜蛋白gp120 及gp41； tat ----- 基因反式激活因子对HIV-1基因其正调控作用 rev,----- 病毒蛋白表达调节因子，能增加gag和env基因对结构蛋白的表达 vif,----- 病毒感染因子, 其作用是在一些细胞因子的协下促进HIV-1在细胞内复 Vpr,----- R蛋白能使HIV在巨噬细胞中增殖 vpu,----- U蛋白，能促进HIV从细胞膜上释放 nef,----负因子，具有抑制HIV-1增殖作用
PACKAGING CONSTRUCT
VECTOR CONSTRUCT
ENVELOPE CONSTRUCT
1. HIV-1-Derived lentiviral vector production & titration
Tri-Transfection (CaPO4) Pseudoparticles Recovery (filtration 0.45µm)
Lentiviruses life cycle
慢病毒通过病毒衣壳糖蛋白与细胞膜上的特异受体结合而 进入易感靶细胞。一旦与细胞膜上的特异受体结合，慢病 毒膜和细胞膜融合后病毒核心释放入细胞浆里。病毒RNA 逆转录合成双链线性DNA而转运之细胞核。线性病毒 DNA永久性的整合入染色体DNA（宿主基因组）中，形 成前病毒，成为永久的遗传成分，在细胞周期中与靶细胞 基因一样进行复制，转给子代细胞。前病毒DNA转录成 RNA后再转运至胞浆，在胞浆里RNA翻译成病毒蛋白。病 毒前结构蛋白和复制酶与病毒RNA组装成新的病毒核心， 从包装细胞获得病毒包膜蛋白后以出芽的方式从细胞膜上 释放出。病毒前结构蛋白经进一步处理而最终形成成熟的 具有感染性的子代病毒颗粒。这些特性是慢病毒成为基因 治疗转运工具的重要原因 。
Mitrophanous K, Gene Ther 5(11):1481–1487(1999)
Lentiviral Vector Systems Under Development
• Primate – Human immunodeficiency virus (HIV) – Simian immunodeficiency virus (SIV) • Non-primate – Feline immunodeficiency virus (FIV) – Equine infectious anemia virus (EIAV)
八 Advantages and Disadvantages of Lentiviral vectors
1.Potential for long term therapeutic expression: incorporates into the genome of target cells 2.High efficiency gene transduction 3.Transduce several nondividing cells 4.Broad application in vivo / ex vivo 1.Potential for insertional mutagenesis 2.Unable to transduce all nondividing cells (e.g. Hepatocytes) 3.Safety issues 1).HIV-based vectors must overcome a great social barrier 2).Limited knowledge of other lentivirus poses a risk for recombination
重组慢病毒的产生：瞬时转染法，即将包装结构和载体结构瞬时共转染法如
293T 高表达细胞系而产生重组慢病毒。此法非常成功，大多实验室采用此法。包膜 质粒、包装质粒与载体质粒共转(多用磷酸钙共沉淀法)染293T细胞直接产生生产细胞。 最后重组慢病毒分泌到培养基中进行培养而得到大量载体慢病毒。 例如用以下三质粒来包装产生重组慢病毒：
Components of the lentiviral system
Expression vecto Range vector
五 包装系统的设计
HIV----- HIV-1-Derived lentiviral vector production ,concentration & titration
Fig.1 慢病毒载体的顺式作用元件
四 载体系统的设计
• 慢病毒载体系统由三种不同的组成部分：包装结构、转移载体成分和包膜 蛋白成分（Env表达结构）。 • 包装部分由去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用元件的HIV-1基因 组而构建,能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白; • 载体部分与包装成分互补,仅含有包装、逆转录和整合所需的HIV-1顺式作 用元件,同时具有异源启动子控制下的MCS及在此位点插入的目的基因。 • 三种表达结构均以细菌质粒的形式保存，能转染到哺乳动物细胞内产生复 制缺陷性病毒原种。为降低包装成分和载体成分同源重组产生有复制能力 的慢病毒(RCL) 的可能性, 将包装成分的5ˊLTR 换成巨细胞病毒(CMV ) 立即早期启动子, 3′LTR 换成猿猴空泡病毒40（SV 40）polyA 位点等，而 将包装成分分别构建在两个质粒上, 即一个表达gag 和po l、另一个表达env。 以HIV-1为基础的慢病毒载体而言，病毒颗粒的核心和酶成分来自于HIV-1, 而包膜蛋白来自于异源性病毒, 大多是水泡性口炎病毒(VSV-G)－－－ •
The outline of this ppt
接下来将以 HIV为例从以下方面说明慢病毒载体构建方面 的基础知识：
HIV一. HIV-1 life cycle HIV二. HIV-1基因结构和病毒颗粒结构 三.载体系统构建的基本原理 四.载体系统的设计 HIV五.包装系统的设计 ----- HIV-1-Derived lentiviral vector production , concentration & titration 1. HIV-1-Derived lentiviral vector production & HIVtitration 2.HIVProduction-------Supernatant 2.HIV-1 Vector Production----Supernatant recoveries & concentrat 六.The difference of Packaging Cells for LVV with other retroviruses 七.The Development of LV Vectors 八.Advantages and Disadvantages of Lentiviral vectors 九.The comparison of Lentiviral vectors with other vectors
HIV二 HIV-1病毒颗粒结构
三 载体系统构建的基本原理
• HIV-1基因组中如包装信号、长末端重复序列的顺式作用元件与编码 反式作用蛋白的序列进行分离。即从病毒基因组中将反式gag, pol, and env基因(其他辅助基因省去)从病毒中分离出而用我们感兴趣的外源性 目的基因代替，剩下的顺式作用元件在病毒复制周期中------逆转录、 整合、转录和包被--------可以被其它病毒或细胞蛋白识别。
D0
293T producer cells
Tri-transfection
D1
In the evening
Medium D2 & D3 exchange
Supernatant harvests
Aliquots
Aliquots
Filtration 0.45µm
1
D3 supernatants
1
D2 supernatants
2
Pool 2
SW28 Store at 4°C ° SW55 Pool 1
2
SW28
Concentration by ultracentrifugation
3
Pool 1 & Pool 2 Pool 3 Aliquots
六 The difference of Packaging Cells for LVV with other retroviruses
∪
慢病毒载体的构建
－－Gateway to lentiviral vector －－
∪
------献给勇敢的斗士 献给勇敢的斗士
January 2007
Introduction
慢病毒（ 慢病毒（Lentiviruses）属于逆转录病毒科。慢病毒核蛋 ） 白质前整合复合物具有噬核特性，病毒基因组运输至细胞核， 从而使慢病毒可以感染和在非有丝分裂细胞中复制。这一特性 使慢病毒成为基因治疗的转移载体。 HIV （Human immunodeficiency virus） 、EIAV （Equine infectious anemia virus） 、 FIV （Feline immunodeficiency virus） 、 SIV （Simian immunodeficiency virus 。其中研究最多最为透彻 Simian virus） 的是HIV。