纤维素酶的固定

纤维素酶载体的选择
试剂：硫酸亚铁（FeSO4·7H2O），氯化铁（FeCl3·`6H2O），氨水（NH3·H2O），聚乙二醇（PEG），高纯氮，正硅酸乙酯(TEOS)，丙酮（CH3COCH3），羧甲基纤维素纳（CMC）3,5—二硝基水杨酸（DNS），3—氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），丙三醇（C3H8O3），磷酸氢二钠（Na2HPO4·H2O）柠檬酸（C6H8O7·H2O），纤维素酶，去离子水，甲醇和乙醇为分析纯。

仪器：超声波清洗机，真空干燥箱，可见分光光度计，PH计，恒温水浴振荡器
氨基硅烷化磁性纳米复合载体的准备
采用化学共沉淀法制备纳米Fe3O4颗粒。

以Fe2+和Fe3+摩尔比1:2将8.34gFeSO4·7H2O 和16.23g FeCl3·`6H2O溶于300ml去离子水中，加入4gPEG，置于三口烧瓶中，在氮气保护下逐步升温至70℃，然后滴加50ml25%的氨水，在450r/min下搅拌反应1h，水浴逐步升温至85℃，保温1h，蒸发过量的氨水，冷却至室温后，在3800Gs磁场条件下分离，并用无水乙醇和去离子水反复洗涤。

用无水乙醇分散定容至200ml，4℃冰箱保存备用。

去一定量制备的Fe3O4颗粒于异丙醇、去离子水和氨水的混合液（100:20:3）中，滴加一定量的TEOS，室温下搅拌12h，得到的产物用磁场分离，去离子水反复洗涤，真空干燥后得到SiO2包裹的纳米磁性微球。

取2gSiO2纳米磁性微球、2.5ml水和10mlAPTES加入到250ml的甲醇中，超声分散30min。

然后在三颈瓶中与150ml丙三醇混合，在85~90℃下，快速机械搅拌3h。

磁场分离，用甲醇和去离子水反复洗涤数次，得到表面氨基硅烷化的磁性载体。

纤维素酶的固定化
分别取25mg的氨基化纳米磁性载体，加入一定浓度的戊二醛3ml，室温下放入摇床（120r/min）中反应2h，磁场分离，用去离子水反复洗涤。

将戊二醛活化的纳米磁性载体置于3ml一定PH值的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲溶液中，然后加入不等量的纤维素酶。

在一定温度下，固定化反应一定时间后磁场分离，在用去离子水反复洗涤，直至上清液中检测不到蛋白质为止。

纤维素酶固定化含量的测定
采用Bradford法测定上清液中游离酶蛋白含量，并根据加入蛋白的量换算成固定于磁性微球上的蛋白量。

固定化纤维素酶活性测定
使用DNS法测定固定化纤维素酶的CMC酶活。

为了确定固定纤维素酶的最佳条件，以某以参数下的最大酶活为100%计，取相对酶活进行计算。

烟末的制备及预处理
将废次烟叶去梗后，在100℃的烘箱中烘干2h，除去水分后研磨成粉末，称取40g烟末，加入350ml去离子水，在室温下搅拌2h，让烟叶中的水溶性杂质，如无机盐、糖类、尼古丁、苹果酸等溶于水中，抽滤后随滤液除去，滤渣留作做茄尼醇提取试验用。

烟草酶混合物料
在保持其他条件不变的情情况下分别改变纤维素酶用量、PH、水解温度、底物质量分数和酶水解时间进行单因素实验；通过多组实验对水解条件进行优化。

茄尼醇含量的测定
仪器及试剂：LC—高效液相色谱仪，SPD—6A V紫外线检测仪，C—R3A色谱数据处理机。

茄尼醇标准品，提纯的正己烷，正己烷加硫酸和硝酸搅拌过夜，用硫酸洗至无色，再水洗，脱水，蒸馏，取中段80%使用。

色谱柱：硅胶柱Shim—pack CLC—SLL（4um，5mm i.d.*150mm）；柱箱温度：30℃；流动相：正己烷—异丙醇（体积比为98:2）混合液，流速0.6mL/min;检测波长：215nm。

样品处理：取适量烟草叶提取物，精密称定，用提纯过的正己烷溶解定容，取5uL进样测定。

色谱条件的选择：选择正己烷—异丙醇混合液为流动相，考察了检测波长和柱箱温度等条件对分离效果的影响。

茄尼醇在200nm有最大吸收，205nm处有较大吸收，在215nm处的吸收只有200nm处的1/3，但由于检测波长为200nm和205nm时仪器难于稳定，因此选择检测波长为215nm；柱温对分离和出峰时间都影响很大，需要恒温；
线性关系：精密吸取茄尼醇标准溶液（质量浓度为0.964g/L）1uL，3uL，5uL，7uL和10uL 进样测定，以峰面积（Y）对茄尼醇质量（X，ug）进行线性回归，在1ug~10ug，线性方程为Y=166204X-3253,相关系数为r=0.9997。

精密度：取同一样品溶液，重复进样5次，RSD为1.3%。

回收率试验：取同一样品溶液6份，精密加入确定量的茄尼醇标准溶液，定容后，分别进样测定，结果列于表中，茄尼醇的平均回收率为98.1%，RSD为1.9%。

中压层柱纯化茄尼醇
仪器，试剂及原料：电子天平，高速离心机，高效液相色谱仪，色谱柱，磁力搅拌器，中压层析柱系统，硅胶，活性炭，聚乙烯基吡咯烷酮，氧化铝，层析氧化铝，丙酮，6号溶剂油，乙腈，异丙醇，茄尼醇标准品。

采用配有二极管阵列检测器的高效液相色谱仪对茄尼醇粗品溶液进行分析，结果如图1所示，由图可以看出，茄尼醇粗品中所含的大部分杂质的吸收波长在300~600mm之间，说明他们都为有色杂质；另外，这些杂质的保留时间均小于6min，说明它们的极性均较大。

为了去除这些强极性色素类杂质，参考已有报道的天然活性成分中色素类杂质去除方法，设计了如下方案：称取茄尼醇粗品10.0g，加入100ml6号溶剂油溶解，溶液平均分成5分，其中4份分别加入300~400目的层析硅胶，颗粒状活性炭，聚乙烯吡咯烷酮和氧化铝各2.0g，用磁力搅拌器搅拌2h，离心，取上清液，另外1分溶液不加任何吸附剂，用作对照，上述5份溶液采用HPLC测定茄尼醇含量。

不同吸附剂对茄尼醇和色素类杂质的吸附率见表，其中吸附剂对色素类杂质的吸附率用下列公式计算：
式中P——吸附剂对色素类成分的吸附率；V1——对照溶液三维色谱的体积积分（0~6min，300~600nm）；V2——吸附后溶液三维色谱的体积积分（0~6min，300~600nm）。

从去除色素的角度考虑，良好的吸收剂应该少吸附或者不吸附茄尼醇，且易吸附色素类成分，从表的结果可以看出，4种吸附剂对茄尼醇粗品的色素均有吸附作用，其中活性炭，氧化铝和硅胶对色素的吸附率较高，且三者差别不大，PVP对色素的吸附率较小。

活性炭对茄尼醇的吸附率为32.2%，因为活性炭对低级性物质吸附作用强，多为不可逆吸附，对于属于低级性化合物的茄尼醇来说，用活性炭来吸附脱色，势必造成茄尼醇的大量损失；PVP 虽然对茄尼醇的吸附率低，仅为15.1%，但色素的去除效果较差；硅胶和氧化铝对茄尼醇的吸附率分别为46.1%和40.2%，但属于可逆吸附，茄尼醇可以被溶剂洗脱下来。

硅胶为层析试剂，价格较高，使用的氧化铝是化学纯，价格较低。

综合考虑上述各个因素，选择氧化铝作为去除茄尼醇粗品中色素类杂志的吸附剂。

吸附溶剂的选择：精密称取茄尼醇粗品3份，每份10.0g，分别加入100ml的6号溶剂油和丙酮，搅拌，溶解，再加入5g氧化铝吸附脱色，用磁力搅拌器进行搅拌，吸附2h，离心，取上清液，HPLC检测。

结果表明，吸附后6号溶剂油溶液在300~600nm处的吸光度明显减小（氧化铝脱色后溶剂油溶液三维谱图见图2）；而丙酮溶液的吸光度无明显变化，说明6号溶剂油对杂质的吸附量大，因此我们选择6号溶剂油作为吸附溶剂。

吸附时间和吸附剂用量的选择：精密称取10.0g茄尼醇粗品5份，分别加入100ml的6号溶剂油，搅拌，溶解，再分别按照茄尼醇粗品与氧化铝的质量比1:2,1:4,1:6,1:8,1:10加入氧化铝吸附脱色，吸附60min，每隔10min取样，离心，取上清液，HPLC检测，结果见图3 由图3可知，使用不同量的氧化铝脱色，随着吸附时间的延长，溶液中的茄尼醇相对峰面积均逐渐增加，说明色素类杂质逐渐被吸附，在40min时增加趋势明显变缓，因此选择吸附时间为40min。

由图3还可知在吸附40min时，随着氧化铝用量的增加，茄尼醇相对峰面积逐渐增加。

当茄尼醇粗品与氧化铝的质量比为1:8时，茄尼醇相对峰面积达到最大值，说明在此条件下可被氧化铝吸附的色素累杂质基本被完全吸附，继续增大氧化铝用量，茄尼醇相对峰面积几乎不再增加，为了在保证色素累杂质被充分吸附的前提下控制氧化铝的消耗量，选择茄尼醇粗品与氧化铝的质量比为1:8在此条件下脱色后的溶液经过浓缩，浓缩物的纯度达到67.26%。

洗脱机用量的影响：因为氧化铝在吸附色素类成分的同时，也吸附了部分茄尼醇，因此须将被氧化铝吸附的茄尼醇用溶剂洗脱下来。

精密称取10.0g茄尼醇粗品，加入100ml的6号溶剂油，搅拌，溶解，再加入氧化铝80g，自然吸附40min后，用6号溶剂油洗脱，每次100ml，洗脱液减压浓缩至干后HPLC测定茄尼醇含量，结果见图4.
由图4可知，随着洗脱剂体积的增加，茄尼醇收率逐渐增加，当洗脱剂与茄尼醇粗品的比例达到100:1（ml/g）时，茄尼醇收率可达到92.8%，继续增加洗脱剂体积，茄尼醇收率增加趋势变缓，因此选择洗脱剂与茄尼醇粗品比例为100:1（ml/g）。

经脱色处理后的茄尼醇溶液与洗脱液合并，浓缩，经过测定，在最佳氧化铝脱色条件下，茄尼醇平均收率92.8%，纯度为68.32%（色谱图见图5b）。

中压层柱吸纯化茄尼醇：连续中压层析系统构成：玻璃层析柱，柱长50cm，内径5.5cm，内装650g300~400目层析用中性氧化铝，采用干法装柱，用砂芯板和法兰封口。

用柱塞泵泵入6号溶剂油平衡层析柱，取氧化铝脱色得到的茄尼醇样品40g，用80ml6号溶剂油溶解后
泵入层析柱，用6号溶剂油—丙酮（30:1）为洗脱剂洗脱，柱的使用压力为1.0MPa，定量分批连续接收洗脱液，每份200ml，用薄层层析跟踪分析，合并含有茄尼醇的洗脱液，回收溶剂至干，经HPLC测定茄尼醇纯度为94.37%（色谱图见图5c），收率为78.6%。