基因工程的原理和技术

重组DNA分子（重组质粒） 不能稳定存在并表达。 cDNA文库的目的基因中没有启动子和终止子.
温故知新
基因工程操作步骤的必要性
为什么要有这一步
①目的基因的获取； ②表达载体的构建； ③将目的基因导入受体细胞； ④目的基因的检测与鉴定。
含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维 持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物 中的转化。
专题一 基因工程
1.2 基因工程的
基本操作程序
补充：基因的结构
基因的定义 基因是有遗传效应的DNA片段。
是决定生物性状的基本单位。
什么是遗传效应？ 遗传效应是指能转录为mRNA，继而翻译为蛋 白质，或转录为核糖体RNA、转运RNA的功能。
基因、DNA、染色体、脱氧核苷酸的关系
遗传物质的 主要载体 染色体 线性排列 蛋白质 DNA 具有遗传效应的DNA片段 基因
获取目的基因方法②： 利用PCR技术扩增目的基因
全称是：多聚酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段 的核酸合成技术。可以在短时间内大量扩增的目的基因。
DNA复制的过程涉及DNA双链的方向。通常将DNA的羟基 （-OH）末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端。
5’端 3’端
3’端
5’端
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3’端 延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA 母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引 物的3’端开始延伸DNA链。
③将目的基因导入受体细胞； ④目的基因的检测与鉴定。
单独的目的基因（DNA片段）是不能稳定遗传的。 为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传 给下一代，同时使目的基因能正常表达和发挥作用， 必须构建表达载体。
第二步：基因表达载体的构建
—— 基因工程的核心
构建目的：使目的基因在受体细胞中 稳定存在，并且可以以传给下一代。
如：抗虫基因、抗病基因、人胰岛素基因、人干扰素基因等
基因工程的操作步骤
第一步：获取目的基因
（1）目的基因：
主要是指编码蛋白质的基因，例如，与生物
抗逆性相关的基因、与优良品质、生物药物
和保健品、毒物降解以及工业用酶相关的基
因等，也可以是一些具有调控作用的因子。
基因工程的操作步骤
第一步：获取目的基因 初始目的基因的来源 （2）现代获取方法：
DNA复制方式：半保留复制
思考： DNA复制需要哪些成分和反应条件？ 如何在体外设置一个类似的DNA复制环境？
参与的组分 解旋酶 DNA母链（模板链） 4种脱氧核糖核苷酸 DNA聚合酶 在DNA复制中的作用 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从3’端开始连接 脱氧核苷酸
基因 启动子 ATC 转录 翻译 起始点 起始点 转录 转录 终止点 TAA RNA终点 转录区 终止子
ATC RNA起点 起始密码
Biblioteka Baidu
终止密码
真核生物的基因结构
非编码区 编码区 非编码区
RNA聚合酶 结合位点 信使RNA
外显子
内含子
成熟的信使RNA
学习目标
1.简述基因工程原理及基本操作程序。 2.尝试设计某一转基因生物的研制过程。
花粉管通道法 我国科学家独创的一种方法 实例：我国的转基因抗虫棉
2）将目的基因导入动物细胞
最常用的方法: 显微注射技术 原因是：受精卵全能性较高， 受体细胞： 受精卵 可使外源基因在相应的组织 基本操作程序： 细胞内表达。 提纯基因表达载体 体外显微注射入受精卵 经胚胎早期培养后 移植到雌性体内
脱氧核苷酸 （DNA的基本单位）
磷酸基＋脱氧核糖＋含氮碱基
原核生物的基因结构
非编码区
编码区 非编码区
RNA聚合酶 结合位点
编码区：能转录为相应的mRNA进而指导蛋白质的 合成。 非编码区：不能转录为相应的mRNA但有调控遗传 信息表达的核苷酸序列，位于编码区的 上游和下游。
区分：启动子与起始密码 终止子与终止密码
思考4:利用大肠杆菌能生产人的糖蛋白吗?
有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链, 这些糖链是在内质网和高尔基体上加 工完成.大肠杆菌是原核生物,不存在这 两种细胞器,因此在大肠杆菌生产这种 糖蛋白是不可能的.
小结
1.将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
2.将目的基因导入动物细胞 显微注射技术（最多、最有效）
基因文库 基 因 组 文 库 cDNA 文 库
某生物体内全部DNA
限制酶
某种生物某个时期的mRNA 反转录
许多DNA片段
与载体连接 导入
cDNA
与载体连接 导入
受体菌群体
受体菌群体
基因组文库
部分基因文库 （cDNA文库）
基因组文库与cDNA文库的比较
文库类型
文库大小 基因中有无启动子 基因中有无内含子
PCR第一轮过程：
变性 复性
55-60℃
延伸
1.DNA变性：加热至9095℃， DNA片段受热后氢 键断裂，形成单链； 2.复性：冷却至55-60℃， 引物结合到互补DNA链； 3.延伸：加热至70-75℃， 耐热的DNA聚合酶从引物 起始引导互补链的合成。
结果：使目的基因在短时间内成 百万倍的扩增 目的基因以指数方式扩增，即2n
cDNA文库
小 无 无 某种生物的 部分基因 可以
基因组文库
大 有 有 某种生物的 全部基因 部分基因可以
基因多少
物种间的基因交流
如何从基因文库中获取目的基因？
就像从图书馆借一本书，要知道书名、 作者、出版社或人物情节等信息一样 获取目的基因前，要对这个基因的背景 有一定程度的了解，（如核苷酸序列、 基因的功能、位置以及基因的表达产物 的特性等）然后通过恰当的技术手段将 目的基因从基因文库中调取出来。
DNA分子杂交的理论基础是： 互补碱基序列的DNA分子，可以通过碱基对之 间形成氢键等，形成稳定的双链区。
DNA分子杂交的双方是所使用的探针和要检测的核酸
基因探针与目的基因杂交，观察标记有无 杂交带
将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸 进行杂交
• 受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完 成了表达吗？ 不能，受体细胞必须合成相应的蛋白质 或表现出特定的性状，才能说明目的基因完 成了表达。 若不能表达，
基因表达载体的组成：
目的基因、启动子、终止子、标记基因等
基因表达载体
启动子：位于基因的首端， 是RNA聚合酶识别和结 合的部位，有了它才能驱 动基因转录出mRNA，最 终获得所需蛋白质。 终止子：位于基因的尾端， 使转录在所需要的地方停 止下来。 标记基因：为了鉴别受体细 胞中是否含目的基因，从 而筛选出来。 如：抗生素抗性基因
3）将目的基因导入微生物细胞
1）早期基因工程为什么选用原核生物作为受体细胞？ 原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 2）应用最为广泛的受体细胞是大肠杆菌 3）方法：
a.用Ca2+处理细胞（以增加细菌细胞壁的通透性）， 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状 态，这种细胞称为感受态细胞； b.是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态 细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收 DNA分子，完成转化过程。
3.将目的基因导入微生物细胞
Ca2+处理
温故知新
基因工程操作步骤的必要性
①目的基因的获取； ②表达载体的构建； ③将目的基因导入受体细胞； ④目的基因的检测与鉴定。
为什么要有这一步
因为并不是所有受体细胞的DNA都接纳了目的基因、 也并不是所有插入的目的基因都能正确表达，因此需要 筛选。只有通过检测和鉴定，才能得知目的基因是否 能够在受体细胞中稳定存在和正确表达。
要对抗虫基因 再进行修饰。
第四步：目的基因的检测和鉴定
分子 水平 检测
①检测转基因生物的染色体DNA上是 否插入了目的基因 ——DNA分子杂交
②检测目的基因是否转录出了mRNA ——分子杂交 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 ——抗原—抗体杂交
第三步：将目的基因导入受体细胞 ——转化
转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体 细胞中维持稳定和表达的过程，称为转化 • 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 • 常用的受体细胞： 动植物细胞和大肠杆菌、枯草杆菌、 酵母菌等微生物。
1）将目的基因导入植物细胞
a.农杆菌转化法（采用最多的方法） 农杆菌特点：生活在土壤中，能够在自然条件下感 染 双子叶植物和裸子植物，受植物体伤口处的细胞 分泌的大量酚类化合物的吸引，农杆菌中的Ti质粒 上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞 染色体的DNA上。
获取目的基因方法③ DNA合成仪用化学方法直接人工合成 前提条件：基因比较小 ，核苷酸序列已知
设备：DNA合成仪
根据已知的氨基酸 序列推知DNA序列
蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 目的基因
温故知新
基因工程操作步骤的必要性
①目的基因的获取； ②表达载体的构建；
为什么要有这一步
第四步：目的基因的检测和鉴定
①检测转基因生物的染色体DNA上是 否插入了目的基因 ——DNA分子杂交
DNA分子杂交技术
【小组交流】阅读教材14页，讨论什么是DNA分子探针？
检测时探针通过什么原理来检测目的基因？
DNA分子杂交技术
什么是DNA分子探针？
探针是一小段单链DNA或者RNA片段（约20到500bp）， 用于检测与其互补的核酸序列。 根据重组质粒上目的基因的部分DNA序列，人工合成 （或PCR技术合成）与之互补的一小段单链DNA（或RNA) ,利 用带有32P-磷酸的dATP使其标记上放射性同位素，这一小段 与目的基因的部分序列互补的核酸分子称为DNA探针。
目的基因
标记基因
• 在构建表达载体（重组DNA分子）过程中需要 什么分子工具？ • 只考虑两两结合，可产生 几种重组DNA分子？
三种 质粒 DNA分子 同种 限制酶处理
• 为什么不能将目的基因直 一个切口 两个黏性末端 接导入受体细胞？ 通过cDNA文库获得的目的 基因有启动子和终止子吗？
两个切口 获得目的基因 DNA连接酶
5’
3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’
5’
3’ 5’
3’
5’
3’
DNA的合成方向总是从子链的5’端端向3’端端延伸
复习：DNA复制
DNA复制的过程
1.解旋:利用细胞提供的能量
边解旋、边复制 2.配对:分别以每条单链为模 板,以四种游离的脱氧核 苷酸为原料,利用碱基互 补配对原则合成两条新的 子链 3.螺旋：两条子链分别与对应 的模板链绕成螺旋型，构 成两个新的DNA分子
基因操作的基本步骤
1. 提取目的基因 2. 目的基因与运载体结合 (基因表达载体的构建) 3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
温故知新
基因工程的操作步骤
为什么要有这一步
①目的基因的获取； ②表达载体的构建；
③将目的基因导入受体细胞； ④目的基因的检测与鉴定。
基因工程的原理：“按照人们的愿望，进行严格的设 计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新 的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和 生物产品。
①从基因文库中获取目的基因（目的基因的序列未知）
从生物中直接获取 人工合成
②利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的基因
（目的基因的序列部分已知）
③人工合成目的基因（目的基因的序列已知，基因较小）
获取目的基因方法①： 从基因文库中获取目的基因
基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片 段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含 有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
原理：将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌转化 ，使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞染色体的 DNA上。使目的基因的遗传特性得以稳定的维持和表达。 优点及应用：此法比较经济和有效，约80%的转基因植物都是 通过这种方法获得。
基因枪法
（1）常用于单子叶植物 的基因转化 （2）缺点：成本较高
引物
PCR技术依据的原理：
DNA双链复制的原理（遵循碱基互补配对原则） DNA热变性的原理 前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列 基本条件：
• 含待扩增目的基因片段的DNA模板； • 根据目的基因双链各一端序列片段合成 与两条模板链相结合的两种引物； • 要有耐热的DNA聚合酶（Taq酶）； • 四种单核苷酸（dCTP、dGTP 、dATP 、dTTP ）。